elemeket
absztrakt
A hasnyálmirigy-ductalis adenocarcinoma (PDAC) a negyedik vezető daganatos halálozási ok az Egyesült Államokban, évente körülbelül 40 000 halálesetet okoz. A PDAC semleges prognózisa nagyrészt a késői diagnózisnak köszönhető. Jelenleg a PDAC legérzékenyebb diagnózisa invazív eljárásokat igényel, például az endoszkópos ultrahangvizsgálatot, amelynek megvannak a maga kockázatai és pontossága, amely nagymértékben függ a kezelőtől. Itt a szilárd daganatok, az savas metabolikus melléktermékként keletkező savas mikrokörnyezet általános jellemzőit használtuk fel a pH (alacsony) beágyazott peptidek (pHLIP) PDAC képalkotáshoz való új alkalmazásának kidolgozására. Megmutattuk, hogy a fluoreszcensen jelölt pHLIP lokalizálhatja és specifikusan kimutathatja a PDAC-t az emberi xenograftokban, valamint a PDAC és a PanIN elváltozásokat genetikailag módosított egérmodellekben. Ez az új megközelítés javíthatja a PDAC-k felismerését, differenciáldiagnózisát és fokozatos fejlesztését.
Körülbelül 45 000 amerikainak diagnosztizálják a hasnyálmirigy-duktális adenokarcinómát (PDAC) évente, és a PDAC előfordulása növekszik 1. Az 1970-es évek óta azonban kevés előrelépés történt a PDAC-betegek eredményei terén. A terápia alappillére a műtéti reszekció; azonban a betegek csak 20% -a jogosult reszekcióra az előrehaladott betegség jelenléte miatt a diagnózis idején 2. A specifikus tünetek hiánya (a szerv fizikai elhelyezkedése miatt), valamint az érzékeny és specifikus biomarkerek hiánya megnehezíti a diagnózis felállítását a korai szakaszban 3. Ezen okok miatt sürgősen szükség van olyan eszközökre, amelyek elősegítik a PDAC korai és specifikus felismerését a mikrometasztatikus betegségek kialakulása előtt. A PDAC diagnosztikájának eddig leggyakrabban alkalmazott módszerei, beleértve a számítógépes tomográfiát (CT), a mágneses rezonancia képalkotást (MRI) és az endoszkópos ultrahangvizsgálatot (EUS), nem képesek kimutatni a korai elváltozásokat, és főként a betegség 3., 4. stádiumában alkalmazzák. .
Jelen tanulmányban a rákos sejtek egy részében túlzottan expresszált egyetlen biomarker fehérje leképezésén alapuló hagyományos molekuláris célzási stratégia alkalmazása helyett a célzás általánosabb megközelítését értékeltük: a tumor mikrokörnyezetének savasságát. Az acidózis a rákos sejtek anyagcseréjének melléktermékeként képződik, és korrelál a tumor fejlődésével és az 5, 6, 7 progresszióval. A savas mikrokörnyezet képalkotása elkerüli a fehérje biomarkerek heterogenitásának általános problémáját, amely korlátozza a 8, 9 specifikus sejtfelszíni markerekre célzó szerek hasznosságát. Nemrégiben kifejlesztett pH-érzékeny próbákat, pH (alacsony) inszert peptideket (pHLIPs®) használtunk a PDAC képalkotására egerekben. A PHLIP-ek vízoldható membránpeptidek, amelyek csak a savas extracelluláris mikrokörnyezetben helyezkednek el a membrán lipid kétrétegében és transzmembrán spirált képeznek, mint például a 10., 11., 12., 13. daganatokban. Kimutattuk, hogy a fluoreszcensen jelölt pHLIP szondák PDAC tumorokat, metasztázisokat és PanIN elváltozásokat detektáltak a PDAC preklinikai egérmodelljeiben. A kapott adatok kritikus bizonyítékot szolgáltatnak az új megközelítés továbbfejlesztését támogató elvről, amely végül klinikai áttöréshez vezet a PDAC korai felismerése és diagnosztizálása szempontjából.
az eredmény
Vizsgálatunk célja az extracelluláris savasság megvalósíthatóságának bemutatása a PDAC képalkotáshoz különféle daganatos modellekben. E cél elérése érdekében pH-érzékeny WT-pHLIP peptidet és annak kontrollját, a 2K-WT-pHLIP-t használtuk (1. táblázat), amelyeket más 13., 14., 15., 16., 17. tumormodellben jól validáltak. A 2K-WT-pHLIP transzmembrán (TM) részében található protonálható Asp maradványokat pozitív töltésű, nem protonálható Lys maradékokkal helyettesítik, ami csökkenti a 2K-WT-pHLIP membránba jutásának pH-függő képességét. Ezenkívül megvizsgáltuk a PDAC-k célzását a pHLIP, a Var3 és a Var7 variánsokkal (lásd az 1. táblázatot), mivel a közelmúltban új változatokként azonosították őket, amelyek nagyon alkalmasak savdaganatos képalkotásra 12. Valamennyi peptid tartalmaz egy Cys-maradékot a membránvégekbe való beilleszkedéshez (1. táblázat), amelyet konjugáltunk az Alexa546 vagy Alexa647 fluoreszcens festékekhez. A konstrukciókat megtisztítottuk és in vivo és ex vivo fluoreszcencia vizsgálatokban alkalmaztuk.
Asztal teljes méretben
A pHLIP megcélozza a PDAC-t és a peritoneális metasztázisokat humán hasnyálmirigy-karcinóma xenograftokban
Reprezentatív in vivo biolumineszcens (A) és fluoreszcens (B) képek atmikus meztelen egerekről daganat nélkül (normál, n = 5; balra) és daganattal (ortotóp PDAC modell luciferázzal jelzett Capan-2 sejtekkel; n = 5) injektálva 40 μM Alexa647 -WT-pHLIP 100 μl PBS-ben. A daganatot és a veséket fekete és kék nyilak jelölik. Alexa647-WT-pHLIP-vel (C) injektált egerek normál hasnyálmirigyének és PDAC-jának reprezentatív ex vivo képei. A hasnyálmirigy ex vivo biolumineszcencia és fluoreszcencia jelének mennyiségi meghatározása (n = 5 csoportonként) (D), valamint a máj, a vesék és a tüdő fluoreszcencia jelének mennyiségi meghatározása (E - G). Az értékek átlag ± SEM, * p = 0,0167, ** p = 0,0025.
Teljes méretű kép
A hasnyálmirigy ex-vivo vizsgálata tumormentes és tumormentes egerekben azt mutatja, hogy a WT-pHLIP szonda specifikusan a tumort hordozó hasnyálmirigyet célozza meg, a normál hasnyálmirigyet azonban nem (1C, D ábra). A daganatos egerek hasnyálmirigyében a fluoreszcencia jel 13,6-szor nagyobb volt (p = 0,0025), mint a normál hasnyálmirigy fluoreszcenciája (1. kiegészítő táblázat). A máj-, vese- és tüdőszignálokat szintén számszerűsítettük (1E-G ábra és 1. kiegészítő táblázat). Érdekes módon a WT-pHLIP beadása után 24 órával a vesében a jel szignifikánsan magasabb volt a daganatot hordozó egerekben, mint a daganatmentes egerekben (1E. Ábra). Ezen túlmenően annak meghatározása érdekében, hogy az acidózis alkalmazható-e markerként az áttétek kimutatásához, lumineszcens jelen keresztül (2A. Ábra) detektálható áttéteket mutató egerekbe fluoreszcensen jelölt WT-pHLIP-t injektáltunk. 24 órás próbainjekció után az elsődleges daganat és az összes peritoneális metasztázis WT-pHLIP fluoreszcenciája lokalizálódott a lumineszcens jel mellett (2. ábra).
Ortotóp PDAC modell luciferáz-jelzett Capan-2 sejtekkel, 40 μM Alexa647-WT-pHLIP-vel 100 μl PBS-ben (+ pHLIP; n = 5) injektálva. A tumor növekedését és metasztázisát jelző biolumineszcens jel együtt lokalizálódik fluoreszcens pH-függő célzás Alexa647-WT-pHLIP (B) segítségével. A jel átfedése a (C) képernyőn jelenik meg.
Teljes méretű kép
A pHLIP-ek pH-függő módon hatnak a PDAC és az áttétek kimutatására genetikailag módosított egérmodellekben (GEMM) és korai PanIN elváltozásokban
A normál hasnyálmirigyet (tumormentes egerek, n = 10) vagy a PDAC-t (daganatot hordozó egerek, n = 10) a farokvénán keresztül 40 μM Alexa546-WT-pHLIP-vel injektáltuk 100 μl PBS-ben (n = 5). ) vagy 40 μM Alexa546-2K-WT-pHLIP (kevésbé pH-érzékenyre módosított peptidszekvencia) 100 μl PBS-ben (n = 5). (A) A tumormentes egerek (balra) és a daganatot hordozó egerekre (jobbra) a hasnyálmirigy, a vese, a máj és a tüdő reprezentatív ex vivo fluoreszcencia képei 24 órával az Alexa546-WT-pHLIP injekció után. Néhány egérben májmetasztázisokat (négyzeteket) figyeltek meg, amelyek korreláltak a fluoreszcencia jel növekedésével. (B - E) Alexa546-WT-pHLIP-vel vagy Alexa546-2K-WT-pHLIP-vel injektált tumormentes egerek (n = 10) és daganatot hordozó egerek (n = 10) ex vivo fluoreszcencia-meghatározása. (F) A tumorok célzásának összehasonlítása Alexa546-WT-pHLIP és Alexa546-2K-WT-pHLIP (kontroll) alkalmazásával. Az értékek átlag ± SEM, * p = 0,0159, ** p = 0,0043.
Teljes méretű kép
(A) H&E, Alexa647 szignál (WT-pHLIP) és DAPI (magok) fluoreszcenciája daganatmentes egerekben (felül) és daganatot hordozó egerekben (alul) 40 μM Alexa647-WT-pHLIP-vel kezeltek 100 μl PBS-ben (n = 5). (B) A fluoreszcencia jel mennyiségi meghatározása a magfestés vonatkozásában. Az értékek átlag ± SEM, **** o
A hasnyálmirigy (A) reprezentatív ex vivo fluoreszcencia képei és a hasnyálmirigy (B), a vese (C), a máj (D) és a tüdő (E) fluoreszcenciájának mennyiségi meghatározása tumormentes egerekből (n = 10), tumor- hordozó egerek (n = 10), Panin elváltozásokat tartalmazó egerek (n = 5) és hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedő egerek (n = 5), 40 μM Alexa647-WT-pHLIP-vel 100 μl PBS-ben vagy 100 μl PBS-ben injekciózva. Az értékek átlag ± SEM, * p
Röviden, ez a munka alapvető preklinikai bizonyítékokat szolgáltat különböző egérmodellekkel, amelyek a hasnyálmirigy-daganat savasságát pH-érzékeny pHLIP-próbák segítségével célozzák meg, hasznosak lehetnek a PDAC klinikai kimutatásához. Megnyitja a lehetőséget új képalkotó klinikai protokollok kidolgozására a detektálás javítása, a differenciáldiagnosztika szűkítése és a PDAC stádium javítása érdekében. Ennek a szondának a PDAC-monitorozásra való egyéb felhasználása elősegíti a túlélést, mivel képes lesz a legtöbb daganat kimutatására a reszekálható stádiumban.
mód
A pHLIP variánsok konjugálása fluoreszcens festékekkel
A PHLIP variánsokat szilárd fázisú peptidszintézissel állítottuk elő Fmoc (9-fluorenilmetiloxikarbonil) kémia alkalmazásával, és fordított fázisú kromatográfiával tisztítottuk a WM Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory-ban Yale-ben. Mindegyik pHLIP-variánst az AlexaFluor®546 és az AlexaFluor®647 C5-maleimidhez DMSO-ban 1: 1, 2 színezék: peptid arányban konjugáltuk, és szobahőmérsékleten 4-8 órán át inkubáltuk. A reakció előrehaladását fordított fázisú HPLC-vel követtük nyomon. A termékeket HPLC-vel izoláltuk. A csúcs azonosságát SELDI-TOF tömegspektrometriával és analitikai HPLC-vel igazoltuk. A konjugált peptidkoncentrációkat abszorpcióval határoztuk meg (Alexa546 esetén: ε = 93 000 M-1 cm-1 és Alexa647 esetében: e = 265 000 M-1 cm-1).
Sejtvonalak
A kialakult hasnyálmirigy-karcinóma sejtvonalat (Capan-2) az American Type Culture Collection-től (ATCC, Manassas, VA) szereztük be. A sejteket rutinszerűen tenyésztettük az ajánlott táptalajban. Az összes sejtet 37 ° C-on 5% CO 2 nedvesített atmoszférában tartottuk.
immunocitokémia
A fagyott szövetlemezeket VECTASHIELD szerelőközeggel (Vector laboratories, Burlingame, CA) fedtük le. A metszeteket Zeiss Axioplan2 mikroszkóppal vizsgáltuk, és a képeket egy Hamamatsu ORCA-ER kamerával rögzítettük Image-Pro Plus szoftverrel (Media Cybernetics, Rockville, MD), és elemeztük őket Simple PCI szoftverrel (Hamamatsu Corporation, Sewickley, PA).
Állatmodellek
Annak felmérésére, hogy a pHLIP képes-e biomarkerként szolgálni az in vivo képalkotás során, immunhiányos humán hasnyálmirigy-karcinóma xenograftokkal (az Országos Rákkutató Intézetből 5–6 hetes korúak) és transzgénikus egereken végeztek vizsgálatokat. Az állatokat az MD Anderson Rákközpontban helyezték el. Valamennyi állatkísérletet az MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) intézményi irányelveinek megfelelően hajtottuk végre, az MD University of Texas Anderson Cancer Center állatgondozási és állat-egészségügyi intézményeinek jóváhagyott állatorvosi protokolljának felhasználásával. Az optikai képalkotó vizsgálatokhoz használt egereket klorofillmentes táplálékkal etették.
Genetikai PanIN-eket és PDAC egérmodelleket dolgoztunk ki az LSL-KRas G12D egerek 32 keresztezésével floxifikált p53 egerekkel 33 és a hasnyálmirigy-specifikus cre (Pdx-1-Cre) egerekkel 34 olyan egerek előállításához, amelyek feltételes p53 delécióval és a mutáns KRas endogén szinttel rendelkeznek. G12D18., Ezekben az egerekben a PDAC 6-8 héttel a születés után 35 alakult ki. PDAC nélküli testvérek szolgáltak kontrollként. Ezenkívül az LSL-KRas G12D 32 egereket kereszteztük CreERT (Ela-CreERT) szabályozott tamoxifennel (Ela), amelyet elasztáz (Ela) szabályozott a fentiek szerint 36, és 30 napig magas zsírtartalmú étrendet tápláltak PanIN 1 elváltozások kiváltása érdekében 19 felett. Az LSL-KRas G12D, p53 és Pdx-1-Cre gén egereket a Humán Rák Konzorcium Tárházának egérmodelljeiből (Rockville, MD) szereztük be.
In vivo és ex vivo képalkotás
Statisztikai analízis
Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. Az in vivo vizsgálatokhoz csoportonként 5 állatot használtunk (n = 5). Statisztikailag szignifikáns különbségeket kétfarkú, párosítatlan Student-féle t-teszttel (P