elemeket

absztrakt

A hatomarubigin bioszintézis gének működését a hrb gén klaszter heterológ expressziójával elemeztük. Megállapítottuk, hogy a Streptomyces lividans 25 génből (hrbR1 - hrbX) és hrbY álló géncsoportot hordozó összes ismert hatomarubigint termeli, beleértve a hatomarubigin D-t is, amelynek egyedi dimer anguciklinje van metilénkötéssel. Ebben a heterológ expressziós rendszerben génmegszakítást alkalmaztak az ismert anguciklin bioszintézis génekkel homológ gén, a hrbF működésének elemzésére. Az új metabolitot a hrb géneket hrbF nélkül expresszáló S. lividans fermentált táptalajában detektáltuk, és hatomarubigin F-nek neveztük el. Ezt a vegyületet NMR spektroszkópiai elemzéssel 5-hidroxi-hatomarubigin E-ként azonosítottuk, jelezve, hogy a HrbF szabályozza az oxidatív enzimek regiospecifitását.

A Hatomarubigin A, B, C és D anyagokat (1. ábra), amelyek több gyógyszerrel reverzibilisek, a Streptomyces sp. 2238-SVT4. 1 A fermentált húslevesben bioszintetikus köztitermékként 1 hatomarubigin E-t és rubiginont B2 is találtak. Ezek a vegyületek az anguciklinek 3, 4 csoportjába tartoznak, amelyre jellemző, hogy benz [a] antrakinon módosított csontvázat tartalmaz. Közülük a hatomarubigin D egyedülálló dimer anguciklin volt, metilénkötéssel. Korábbi vizsgálatunkban a hatomarubigin D-től eltérő 5 hatomarubigint állítottak elő Streptomyces lividans, amely 25 génből álló génklasztert (hrbR1 - hrbX) hordozott, hogy azonosítsa a púpfürt gént (2. ábra) hatomarubigin bioszintézis génként. Egy ilyen heterológ expressziós rendszer hasznos ismeretlen gének funkcionális elemzéséhez egy klaszterben. Ebben a vizsgálatban az összes ismert hatomarubigint, beleértve a hatomarubigin D-t is, 25 hrb gén hrRBY-vel történő heterológ expressziójával állítottuk elő, és a hatomarubigin F-et, a hatomarubigin család új tagját, izoláltuk a fermentált S. lividans micéliumból, amely a hrb hiányzó csomóját tartalmazta .

bioszintézis

Az A – F hatomarubiginek és a rubiginon B2 szerkezete.

Teljes méretű kép

Hatomarubigin bioszintézis gén klaszter a Streptomyces sp. 2238-SVT4. A nyilak a heterológ expresszióhoz használt DNS-fragmenseket jelzik. A szürke négyzetek az ismert angucyclin bioszintézis génekkel homológ géneket jelölnek.

Teljes méretű kép

Eredmények és vita

A hrbY-t tartalmazó hrb gén klaszter expressziója S. lividans-ban

Korábbi tanulmányunk a HrbY enzimet azonosította, amely képes a hatomarubigin C-t hatomarubigin D-vé átalakítani metilkobalamin jelenlétében. A HrbY in vivo funkciójának igazolásához elkészítettük a pWHM3-HR-Y-t, egy 25 hrb gént (hrbR1 - hrbX) hordozó plazmidot hrbY-vel. Valamennyi ismert hatomarubigint, beleértve a hatomarubigin D-t, pWHM3-HR-Y-t hordozó fermentált S. lividans táptalaj HPLC-analízisével detektáltuk, bár a púpgéneket púp nélküli géneket expresszáló S. bividans gének nem termeltek hatomarubigin D-t (3. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a HrbY in vivo funkcionális, és hogy a hatomarubigin bioszintézis géncsoportja a hrbR1 és a hrbR3 közötti régióban, a nukleáris szabályozóval homológ génben található (61% azonosság). 5.

A pWHM3-HR5 hordozó S. lividans micéliumkivonat HPLC elemzése ( a ); pWHM3-HR-Y ( b ); pWHM3-HR-YF ( c ) és a pWHM3-HR-YFF-F ( d ). 1: hatomarubigin F, 2: hatomarubigin B, 3: hatomarubigin A, 4: hatomarubigin C, 5.: hatomarubigin E, 6.: hatomarubigin D.

Teljes méretű kép

A hrb-klaszter gén expressziójából hiányzik a hrbF az S. lividans-ban

A púpgén-klaszter számos gént tartalmaz, homológ nélkül az anguciklin-bioszintézis ismert génjeivel (2. ábra). Közülük a hrbF egy 234 aminosav fehérjét kódol, amely kevés hasonlóságot mutat a S. griseus NBRC13350 SGR_5610 antibiotikum monooxigenáz bioszintézissel (34% azonosság) és az ubiquinone/menakinon metiltranszferáz bioszintézisével Caulobacter crescentus CB15-től (34% azonosság). A hrbF működésének vizsgálatához elkészítettük a pWHM3-HR-YF plazmidot, amely képes kifejezni egy hrb géncsoportot, amelyből hiányzik a hrbF. A pWHM3-HR-YF-et hordozó fermentált S. lividans micélium minden hatomarubigint tartalmazott, jelezve, hogy a hrbF nem elengedhetetlen a hatomarubigin bioszintéziséhez. Amikor a HPLC profilokat összehasonlítottuk a teljes zhb géncsoportot hrb expresszáló S. lividans profiljaival, új metabolitot detektáltunk, és a csúcs eltűnt a transzformátor táptalajában, amelyet a hrbF-be juttattunk (3. ábra). Ezt az anyagot a hatomarubigin család új tagjának azonosították spektroszkópiai elemzéssel, és hatomarubigin F-t ( 1 ).

A hatomarubigin F (1) szerkezetének meghatározása \ t

Asztal teljes méretben

A hatomarubigin F NMR-analízise ( 1 ). A félkövér vonalak a COSZY hálózatokat, a nyilak pedig a HMBC-t jelzik.

Teljes méretű kép

Streptomyces sp. A 2238-SVT4 előállította a rubiginont B2, amely C-6-ra és C-11-re oxidálódva átalakulhat A és B hatomarubiginekké. A hrb klaszterben két tandem gén, a hrbW és a hrbX, amelyek az oxidoreduktázt és az oxigenázt kódolják, részt vesznek a 11-hidroxilezésben. A 6-hidroxilezésért felelős feltételezett oxigenáz a hrbG-nek tulajdonítható. A hrbF megszakadása oxigénellátást okozott a kóros C-5 helyzetben, és csökkentette a hatomarubigin A termelést (3. ábra), ami arra utal, hogy a HrbF szabályozza ezen oxidáló enzimek regiospecifitását.

Kísérleti szakasz

Baktériumtörzsek és DNS-manipuláció

Közepes és növekedési körülmények Streptomyces sp. A 2238-SVT4 és S. lividans TK23-t fentebb leírtuk. 1,5 Escherichia coli XL1-kék MRF'-t és JM110-et tenyésztettünk 100 ug ml-1 ampicillinnel kiegészített LB táptalajban. A PCR-amplifikációhoz a gyártó utasításai szerint KOD-plusz DNS-polimerázt (Toyobo, Osaka, Japán) használtunk. Egyéb általános eljárásokat Sambrook és mtsai. 8.

Plazmidok felépítése a klaszter expresszióhoz

A hrbR1-hrbS-ből (HR01) álló 19,8 kbp méretű fragmenst a fent leírtak szerint állítottuk elő. A hrbT-től hrbX-ig (HR02) álló 5,2 kbp méretű fragmenst a Streptomyces sp. 2238-SVT4 genomi DNS további Nsi I és Nhe I helyeket tartalmazó primerek alkalmazásával (5'-TGCATGCATGTGCGAGAGCGCTGGACGCACGC-3 'és 5'-ACCGCTAGCTCAGACGGACAGCAGCCCGCGTGC-3'). Az 1,1-KBP púpos fragmenst (HR03) genom DNS-ből amplifikáltuk további NheI és HindIII helyekkel rendelkező primerek alkalmazásával (5'-ACCGCTAGCATGAGTGCAACAGTCGCGGTCGTC-3 'és 5'-ACCAAGCTTTCAGCCGGCGGTGGGACCGAACTG-3'). HR01 hasított XbaI/NsiI, HR02 hasított NsiI/NheI, HR03 hasított NheI/Hin dIII-val és hasított pWHM3 hasított XbaI/Hin dIII ligáltuk a pWHM3-HR-Y konstrukcióhoz, hrbR1-t hordozó plazmidot hrbXs-hez. Ebben a plazmidban a hrbA-hrbY átírható.

A hrbF megszakítását az alábbiakban leírtak szerint hajtottuk végre. A hrbF-et tartalmazó 3,1 kbp méretű Not I/PstI fragmenst klónoztuk a pBluescript II SK (+) -ba (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA). A hrbF előtt egy 1,2 kbp méretű fragmenst R13 M13 primer és egy másik Bln I hellyel rendelkező primer (5'-AACCTAGGCGTCTTTCACTCCCGGTGTCGTCG) segítségével amplifikáltunk, és NotI-vel és Bln I-gyel emésztettünk. A hrbF irányában lévő 1,2 kbp méretű fragmenst M13 M4 primert és egy további Bln I hellyel rendelkező primert (5'-AGCCTAGGGCGCGCAGGTCGGCCCCAGAAGGA-3 '), majd Pst I és Bln I enzimmel emésztettük. Ezt a két fragmenst a pBluescript II SK (+), HrbF enzimmel emésztett Not I/Pst I-hez ligáltuk. A plazmid Not I/Pst I emésztésével kapott 2,4 kbp méretű fragmenst kicseréltük a pWHM3-HR-Y eredeti 3,1 kbp méretű Not I/Pst I fragmensével a pWHM3-HR-YF előállításához. A 0,7 kbp méretű hrbF fragmenst genomi DNS-ből amplifikáltuk további Bln I helyeket tartalmazó primerek alkalmazásával (5'-GACCTAGGATGCCTGTAGCCTCCGACGCCCCA-3 'és 5'-CGCCTAGGTCAGTCGGCTGTCTTCTCCAGCGC-3'), és a p1 HbG-be a orientáció a pWHM3-HR-YFF-F konstrukciójára a hrbF komplementer elemzéséhez .

A hatomarubigin bioszintézis génjeinek heterológ expressziója

Az E. coli JM110-en átjutott expressziós plazmidokat a S. lividans TK23-ba vezettük be. A transzformánsokat 10,3% szacharózt, 3,0% glükózt, 1,5% Bacto Soytone-t, 0,1% glicint, 3 mM CaCl2-t, 5 mM MgCl2-t és 10 μg ml-1 tiostreptont (pH 7, 2) tartalmazó oltóanyagba oltottuk. Inkubálás után kétirányú rázógépen, 27 ° C-on, 2 ml inokulum tenyészetet 500 ml Erlenmeyer-lombikba helyeztünk 50 ml 2,5% oldható keményítőt, 1,5% szójalisztet, 0,2% szárított élesztőt, 0,2% 4% CaCO 3-at tartalmazó 50 ml-es termékekkel. és 10 μg ml-1 tiosztreptont (pH 6, 2). Az erjesztést rotációs rázógépen végezzük 27 ° C-on 2-3 napig. A fermentlét centrifugáljuk, és a micéliumot acetonnal extraháljuk. Párologtatás után a vizes koncentrátumot etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot fordított fázisú HPLC-vel (YMC-Pack R-ODS-7, 4,6 mm x 250 mm; YMC, Kiotó, Japán) analizáltuk 80% metanollal. A hatomarubiginek abszorpciós csúcsait 470 nm-en detektáltuk.

A hatomarubigin F izolálása (1)

A micéliumot pWHM3-HR-YF-t hordozó és acetonnal extrahált S. lividans TK23 kétnapos fermentált táptalaj (5 liter) centrifugálásával nyerjük. Az extraktumot bepároljuk, és etil-acetát és víz között megosztjuk. A szerves fázist bepároljuk és kloroformban oldjuk. A csapadékot 10 térfogatrész hexán hozzáadásával metanolban oldjuk, és szűrjük. A szűrletet HPLC-nek vetettük alá (YMC-Pack D-ODS-7, 20 mm x 250 mm; YMC) 80% metanol/0,2% foszforsavval. Az egyik fő csúcsot (retenciós térfogat: 280 ml) tovább tisztítottuk HPLC-vel (YMC-Pack D-ODS-7), 75% metanollal, amely 5 mM nátrium-hidrogén-citrátot tartalmazott. A fő frakciót (retenciós térfogat: 395 ml) bepároljuk, és a vizes koncentrátumot etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot vízzel mossuk és szárazra pároljuk, így narancssárga port kapunk 1 (1,2 mg).

A hatomarubigin F (1) fizikai-kémiai tulajdonságai \ t

olvadáspont: 276-278 ° C. Nagy felbontású EI-MS m/z 340,0948 (M +, C 19H 16O 6-ra számítva, 340,0947); UV λmax (λ) 224 nm (20 300), 287 nm (18 000), 475 nm (6800) metanolban, 226 nm (22 000), 287 nm (20 000), 474 nm (7 000) 0, 01 M HCl- metanol, 240 nm (14 200), 310 nm (15 000), 534 nm (8300) 0,01 M NaOH-metanolban; IR (ATR) vmax 3438, 3127, 1619, 1568, 1449, 794 cm-1 .

Spektroszkópos mérések

A tömegspektrumokat JMS-SX102A spektrométeren (JEOL Ltd., Tokió, Japán) végeztük EI módban. Az UV- és IR-spektrumokat Shimadzu UV-1700 és JASCO FT/IR-410 spektrométereken mértük. Az NMR-spektrumokat DMSO-d6-ban kaptuk JEOL JNM-LA400 spektrométeren, 1H-NMR 400 MHz-en és 13 C-NMR 100 MHz-en. A kémiai elmozdulásokat ppm-ben adtuk meg a DMSO-hoz viszonyítva, 2,49 ppm-nél 1H-NMR-nél és 39,5 ppm-nél 13C-NMR-nél.