elemeket

absztrakt

A tanulmány célja annak vizsgálata volt, hogy mennyire hasznos a szekvencia szekvenciája nagyszámú, a szívcsatorna és kardiomiopátiával összefüggő gén közül, egy 61 SUD-áldozatból álló csoportban Dániában egy igazságügyi orvostechnikai környezetben.

szívgén

Anyagok és metódusok

Vizsgálati populáció

2009 és 2011 között 348 fiatal (1-50 éves) elhunytat feltételeztek, hogy természetes okokból haltak meg, boncolást végeztek a koppenhágai egyetem Egészségügyi és Orvostudományi Karának Igazságügyi Orvostani Tanszékének igazságügyi orvostan szakán. Ezek közül 142 személyt soroltak SCD-be, beleértve a negatív boncolású eseteket is. Alapos makro- és hisztopatológiai vizsgálat után összesen 61 személy hirtelen, váratlanul és patogén leletek nélkül halt meg. A toxikológiai szűrés során nem találtak olyan toxikus szintű gyógyszert, amely magyarázatot adhatna ezekre az esetekre. A fennmaradó 81 esetet korábbi tanulmányok során kivizsgálták más szívbetegségekben. Húsz alany minősült kardiomiopátiának (jobb kamrai aritmogén kardiomiopátia (ARVC) = 14, hipertrófiás kardiomiopátia (HCM) = 6), 52 alanynak, akinek 15 és 9 alanynál nem diagnosztikus strukturális szívhibák voltak, hirtelen váratlan gyermekkori halál. 16.

Genetikai tesztelés

Eddig a genetikai kutatás módszereit írtuk le Hertz et al. Röviden, 57 személy teljes véréből vontunk ki DNS-t a QIAamp DNS Mini Kit segítségével (Qiagen, Stockach, Németország). Az EZ1 DNS Investigator Kit (Qiagen) segítségével egy alany friss, fagyasztott izomból és három alany friss fagyasztott lépszövetéből nyertünk DNS-t. A kivont DNS-t a Quantifiler Human DNA Quantification Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mennyiségével határoztuk meg a gyártó protokollja szerint. A két mintából származó DNS-t a teljes genomot amplifikáltuk a REPLI-g Midi kit (Qiagen) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint az alacsony DNS-koncentráció miatt.

Az NGS-t 100 gén vizsgálatára használták, amelyekről korábban kiderült, hogy összefüggenek örökletes szívbetegséggel és SCD-vel (1. táblázat). A géneket a rendelkezésre álló szakirodalomból választottuk ki a PubMed és az Online Mendelian Inheritance in Man (//omim.org/).

Asztal teljes méretben

A SureDesign-ot (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA) arra használták, hogy megfogási szondákat tervezzenek az exon célrégiókhoz és az UTR-ekhez 100 génből a 150 bp-os Haloplex célrendszer-dúsító rendszerhez (Agilent Technologies). A tervezés magában foglalta az összes kódoló exont, 25 bp összefüggő intronokat, valamint 5'- és 3'-UTR régiókat 100 kívánt géntől összesen 2076 régióig, összesen 787,943 bp nagyságú. Összességében a cél 99,6% -át lefedték> 50x. Két exont nem fedett le kellő mértékben szekvencia, és hét exont nem szekvenáltak a szonda hiányzó kialakítása miatt. A nem megfelelően lefedett genomrégiók részletei az S1 kiegészítő táblázatban találhatók. Az amplikonok medián lefedettsége 950 volt (tartomány: 206 - 3065).

A Haloplex Target Enrichment protokoll D.5 verzióját a gyártó utasításainak megfelelően használták. A protokoll a következő lépéseket tartalmazta: (1) 200 ng genomiális DNS emésztése különféle restrikciós enzimekkel nyolc csőben és fragmenselemzés 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) alkalmazásával; (2) az emésztett DNS hibridizálása Haloplex próbákkal olyan próbavégekkel, amelyek komplementerek voltak a célfragmentekkel. A hibridizáció során a fragmenseket körkörössé tették, és indexeket, szekvencia motívumokat és biotint építettek be; (3) a cél DNS-t Haloplex mágneses gyöngyökkel rögzítettük; (4) a cirkularizált fragmensekben lévő kócokat ligálással lezártuk; és (5) eluálás NaOH-val, PCR amplifikáció, tisztítás és végső elúció a befogott cél DNS Tris-HCl pufferjével. A könyvtár összeszerelése után a DNS mennyiségét Qubit Fluorometer 2.0 segítségével mértük dsDNS HS assay-vel (Invitrogen, Life Technologies Europe BV, Nærum, Dánia). A DNS-méreteloszlást 2100 Bioanalyzer és egy nagy érzékenységű DNS-készlet (Agilent Technologies) segítségével elemeztük. Az összes mintát a MiSeq-en (Illumina, San Diego, Kalifornia, USA) szekvenáltuk a gyártó ajánlásai szerint, 150 bp páros végszekvenálással, MiSeq Reagent Kit V2 alkalmazásával (300 ciklus).

Adatok elemzése és bioinformatika

Eddig részletesen leírtuk az adatelemzést Hertz et al. Röviden: a MiSeq által létrehozott fastq fájlokat használtuk a további összehangoláshoz és elemzéshez. A SureCall-t (Agilent Technologies) használták az alaphívások elemzésére a szokásos beállítások és azok algoritmusa segítségével. Az azonosított változatok teljes listája a Váltó hívó formátumban található.

Az Alamut Batch v.1.2.0 és az Alamut Visual v.2.5 (Interactive Biosoftware, Rouen, Franciaország) elemzéseket és a változatok értékelését Hertz és mtsai. A variánsokat (1) egy in vitro in vitro analitikai eszközzel értékeltük, hogy meghatározzuk a variáns patogenitásának valószínűségét és (2) a 17

A változatot ismeretlen jelentőségűnek minősítették, a rendelkezésre álló szakirodalom szerint a betegség prevalenciájával szembeni gyakoriság, fenntartatlan aminosav-szubsztitúció, a variáns többszörös megfigyelése a kohorszban vagy a szignifikáns kapcsolat hiánya bármely szívbetegséggel és nukleotiddal szemben azokban a régiókban, ahol a változat megtalálható.

A géneket és a DNS-variánsokat az 1. táblázatban használt referenciaszekvenciáknak megfelelően számoztuk meg a HGVS-nómenklatúra (www.HGVS.org) felhasználásával. Változatokat küldtek a Leiden Open Variation Database-be (//adatbázisok.lovd.nl/shared/individuals, személyi azonosító: 00064702–00064741).

A lefedettséget egy python szkript segítségével számolták ki, amely a Bedtools lefedettségBed használatával kiszámítja az egyes ampplikonok lefedettségét. Az amplikonokat, ahol az összes mintának 23-an voltak, statisztikai elemzések elvégzésére és az in silico analízisben szereplő variánsok értékelésére használták egyedi szkriptet.

Etikai normák

A tanulmányt a dán egészségügyi kutatások etikai bizottságai (H-2-2012-017) és a dán adatvédelmi ügynökség (2011-54-1262) hagyták jóvá.

az eredmény

Vizsgálati populáció

61 olyan személyt vettünk fel, akik alapos orvosi vizsgálat után hirtelen és váratlanul haltak meg kórokozói leletek nélkül, és SUD-nak minősítették. A medián életkor halálakor 39 év volt (1-50 közötti tartomány) és 43 (70%) férfi volt (2. táblázat). A post-mortem toxikológiai vizsgálatokat 54 (89%) esetben végezték el, ebből 16 (30%) negatív volt. Nem találtak olyan mérgező koncentrációjú gyógyszert, amely bármelyik esetben megmagyarázhatta a halált.

Asztal teljes méretben

Két halott egyénnél (3%) a családban szívbetegség volt. Egy személy apja 56 éves korában, meghatározatlan szívbetegségben halt meg. Ebben a személyben nem találtak valószínű funkcionális hatású változatot. A másik egyén két közeli hozzátartozója alvás közben, fiatalon, ismeretlen ok nélkül halt meg. Két valószínű funkcionális hatású változatot találtunk ebben az egyénben (3. táblázat, ID 7).

Asztal teljes méretben

Vizsgálatunkban a SUD-ban 16 (26%) esetben volt pszichiátriai betegség a rendelkezésre álló orvosi feljegyzések szerint. Hét (13%), illetve nyolc (15%) alkalmazott antipszichotikumot. Antidepresszánsok. A rendelkezésre álló alkalmazási előírás szerint az elhunytnál alkalmazott antipszichotikumok és antidepresszánsok QT-megnyúlása nagyon alacsony vagy ismeretlen volt c. Ezenkívül 14 (23%) SUD-es esetben volt epilepszia, és 10 (19%) vérében egy vagy több antiepileptikum volt (2. táblázat). Az epilepszia kezelésére alkalmazott gyógyszerek egyike sem ismert QT-megnyúlás gyakorisággal a rendelkezésre álló alkalmazási előírás szerint.

Valószínű és ismeretlen funkcionális hatású változatok

Összesen 21 (34%) egyénnél volt 25 olyan genetikai variáns, amelyeket valószínűleg funkcionális hatásúnak minősítettek (3. táblázat). E változatok közül tíz új volt. A valószínű funkcionális hatású alanyok medián életkora 36 év volt (1–49 tartomány), és 11 férfit (52%) érintett. A valószínű funkcionális hatású változatok közül 22 missense mutáció és 3 nonszensz mutáció volt (3. táblázat). Tíz (40%) és 15 (60%) változatot találtak azokban a génekben, amelyekről korábban kiderült, hogy kardiomiopátiákkal vagy szívcsatorna-patológiákkal társultak. Azok közül hét személynél, akiknél valószínű funkcionális hatású változatok voltak, ismeretlen funkcionális hatású változatok is voltak. Ezenkívül 19 egyed csak ismeretlen funkcionális hatású genetikai variánsokat hordoz (az ismeretlen változatokra vonatkozó adatokat az S2 kiegészítő táblázat tartalmazza). A fennmaradó 21 (34%) alanynak nem volt valószínű vagy ismeretlen funkcionális hatású változata.

Fizikai aktivitás a halál idején

A testmozgás során hat (10%) SUD-eset halt meg. Közülük négynek valószínű funkcionális hatású változatai voltak. Egy 39 éves nő séta közben összeomlott, és valószínű funkcionális hatású változata volt a KCNJ8-ban (kb. 1066C> T, o. (R356 *)). Korábban nem számoltak be szívbetegség tüneteiről. Két személy halt meg merülés közben: egy 46 éves nő, akinek az egyik változata valószínűleg funkcionális hatású volt a MYBPC3-ban (kb. 4242G> A, o. (G148R)), egy másik pedig a TNNC1-ben (kb. 433G> A, p ( D145N)) és egy 35 éves férfi, amelynek változata valószínűleg funkcionális hatást fejt ki a MYBPC3-ban (kb. 3742G> A, o. (G1248R)). Két búvár nem számolt be a szívbetegségre utaló korábbi tünetekről. Egy 15 éves férfi hirtelen összeomlott egy futballfutás során. Az egyik változata valószínűleg funkcionális hatással volt a CACNB2-ben (c.641G> C, p. (S214T)), a másik pedig a MYBPC3-ban (c.649A> G, p. (S217G)). Korábban két szinkopeseménye volt a futball során, és amikor meghalt, szívbetegség miatt vizsgálták. Az EKG kamrai extrasystolát mutatott, de nem diagnosztizáltak.

vita

100 dán szívbetegséggel összefüggő gént szekvenáltunk 61 dán SUD-es esetben NGS segítségével. Egy vagy több valószínű funkcionális hatású változatot azonosítottak 21 egyénnél (34%). A 21 egyén közül 12-nek csak funkcionális hatásai voltak olyan variánsokban, amelyek korábban a szívionális betegséggel társultak. Hat személynek voltak valószínű funkcionális hatásai kizárólag a korábban kardiomiopátiás betegségekkel társult génekben. Három egyénnél valószínű funkcionális hatású variánsok voltak a kannulopathiával és a cardiomyopathiával összefüggő génekben.

A kardiomiopátiával összefüggő gének variánsainak gyakorisága a vártnál magasabb volt. A kardiomiopátiák gyakran változóak az expresszióban és hiányos behatolással rendelkeznek, és a kezdeti fenotípusos változások nem feltétlenül láthatók a boncoláskor, vagy nem specifikusnak vagy a normál tartományon belülinek tekinthetők. Azok a változatok, amelyekről beszámoltak, hogy kardiomiopátiákkal és a szív strukturális változásaival társulnak, szívritmuszavarokhoz vezethetnek - és egyes esetekben szívműködési zavarok által közvetítettek. Ezt támasztják alá deszomomális gének funkcionális vizsgálata, amelyekről korábban kimutatták, hogy összefüggenek az ARVC-vel. 3, 4, 5, 6 A PKP2 génről először kiderült, hogy az ARVC-hez kapcsolódik, amikor Gerull és mtsai 24 azt találták, hogy a PKP2-ben 25 variáns volt 32 ARVC-ben szenvedő betegnél. A PKP2 változatait találtuk

Az összes ARVC-eset 70% -a. 4, 25 Nemrégiben azt találták, hogy a PKP2 strukturális kóros rendellenességek nélkül társul a BrS-hez. 3, 4 Cerrone és mtsai 3 a vizsgált BrS-betegek 2,5% -ában találtak PKP2 variánsokat. Ezért ebben a tanulmányban felvetődött, hogy a PKP2 szerepet játszik majd a nátriumcsatornák ismeretlen mechanizmuson keresztüli átvitelében az interkalált lemezre. 3 Zhang és mtsai. 4 azonos számú PKP2 változatot talált negatív boncolású ARVC és SUD betegeknél, és arra a következtetésre jutottak, hogy a hirtelen halál oka lehet aritmia lehet a Nav1.5 csatorna fehérjék csökkent lokalizációja révén az interkalált lemezre, növelve ezzel a mikrotubulusok plusz vége közötti távolságot és N- kadherin központi lepedék. A DSP és a DSG2 variánsai, amelyek szintén a szív dezmoszóma komplexumának részei, hasonlóan kiderült, hogy egerekben és HL-1 sejtekben összefüggésbe hozhatók a Nav1.5 diszfunkcióval. 5, 6 A szarcomomer génmutációk olyan hirtelen csecsemőhalál szindróma (SIDS) esetén is jelen voltak, amelyben nem figyeltek meg strukturális változást. Brion és mtsai 26 korábban leírt variánsokat találtak a szarkomer génekben 286 SIDS áldozatban. Azt javasolták, hogy a szarcomer gének variánsai lehetnek ezeknek a gyermekeknek a halálai, még akkor is, ha a gyermekeknek nincsenek strukturális változásai a szívben.

Ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a SUD esetek kétharmadánál (40 egyén) ismeretlen funkcionális hatású változatok voltak, vagy nem voltak valószínű vagy ismeretlen funkcionális hatású változatok. Ezen egyének halálának oka továbbra is megválaszolatlan, és új kérdéseket vet fel; Vannak-e más gének vagy szabályozó elemek (metiláció, miRNS stb.), Amelyek csak SUD esetekben találhatók meg, és soha nem fordulnak elő szívbetegségben szenvedő egyéneknél? Érdekes lenne ezeket az eseteket tovább vizsgálni a teljes genom szekvenálásával és az epigenetikus tényezők vizsgálatával.

Fizikai aktivitás a halál idején

Hat (10%) SUD esete halt meg fizikai aktivitás során, beleértve a gyaloglást, a búvárkodást, a kerékpározást vagy a focit. A hat egyén közül négynek voltak funkcionális hatású változatai, amelyek közül hárman a MYBPC3-ban voltak. A 46 éves búvár egy korábban megfigyelt MYBPC3-variánssal rendelkezett (kb. 422G> A) egy HCM-ben szenvedő betegnél. A 35 éves férfi búvárnak a MYBPC3 egyik változatát (kb. 3742G> A) korábban megfigyelték egy másik HCM 28-as betegnél, és valószínűleg patogénnek minősítették. Egy 15 éves futballistának a vizsgálat során a MYBPC3 variánsai voltak (c.649A> G), ahol ezt a változatot két SIDS esetben találták meg, és potenciálisan patogénnek nevezték. Egy másik vizsgálatban ezt a változatot találták egy 19 éves nőnél, akinek a szív megállítása megkezdődött, és később diagnosztizálták náluk a HCM-et. Ezenkívül a változatot ugyanaz a tanulmány írta le, mint az előző szövegben Andreasen és munkatársai, 29, és megállapították, hogy ennek a variánsnak alacsony a gyakorisága és esetleg patogén is. Mindhárom valószínű funkcionális hatású MYBPC3 variánssal rendelkező személy enyhe vagy súlyos testmozgást végzett a halál idején.

Hirtelen váratlan halál pszichiátriai betegségekben és epilepsziában

A SUD-k ebben a csoportjában 16 (26%) SUD-es esetben volt pszichiátriai betegség a rendelkezésre álló orvosi feljegyzések szerint (2. táblázat). Öt (31%) pszichiátriai betegségben szenvedő egyénnél azonosítottak egy vagy több valószínű funkcionális hatású változatot. Változatokat találtunk az SCN5A, KCNQ1, TTN és LMNA génekben. A depressziós fiatalok SUD előfordulását nem vizsgálták széles körben. Ismeretes, hogy Dániában a skizofrén betegek átlagos várható élettartama 16-20 évvel rövidebb, mint az általános népességnél. Egy nemrégiben végzett ausztráliai tanulmányban Sweeting et al. 32 megállapította, hogy a skizofrén betegek leggyakoribb halálozási oka a szív- és érrendszeri betegségek voltak (23%), és hogy a halálesetek 11% -a nem volt megmagyarázható a boncolás után.

A pszichiátriai rendellenességekben az SCD és a SUD kiváltó okait nem sikerült megállapítani, de a gyógyszerek által kiváltott ritmuszavarokat fontosnak tartják a depresszió 33 és a skizofrénia esetén. 34, 35, 36, 37

Ennek a tanulmánynak vannak bizonyos korlátai. Először is, ez egy nagyon kiválasztott kohorsz, amely potenciálisan csökkenti eredményeink általánosíthatóságát. Funkcionális vizsgálatokat és a szegregáció elemzését kell elvégezni a családokban a valószínű funkcionális hatásokkal rendelkező változatok további vizsgálata érdekében. A tanulmány genetikai eredményei önmagukban nem tudják meghatározni a halál okát, mivel az azonosított változatok közül sok új és további vizsgálatot igényel.

Összefoglalva azt tapasztaltuk, hogy a negatív törvényszéki boncolással rendelkező halottak egyharmadának volt egy vagy több változata, amelyek valószínűleg funkcionális hatást mutattak a kardiomiopátiákkal és a szívcsatorna-kórokkal összefüggő génekben. Ezenkívül 19 és 21 egyénnél csak ismeretlen jelentőségű változatok vannak, vagy nincsenek szignifikáns változatai. Eredményeink azt sugallják, hogy az NGS alkalmazásával végzett kiterjedt genetikai szűrés hasznos diagnosztikai része a törvényszéki vizsgálatoknak olyan SUD esetekben, amikor a rutin boncolást követően nem lehet meghatározni a halál okát. Mivel a valószínű funkcionális hatású variánsok jelentős részét olyan génekben azonosították, amelyekről kiderült, hogy kardiomiopátiákkal társulnak, azt javasoljuk, hogy a SUD-áldozatok genetikai vizsgálata magában foglalja mind a strukturális, mind a nem strukturális szívbetegségben részt vevő géneket. Ezen túlmenően azoknak az egyéneknek a kétharmada, akiknél nem azonosítottak valószínű funkcionális hatású változatot, arra késztetnek bennünket, hogy vajon vannak-e más gének vagy szabályozó elemek, amelyek még nem jelentek meg ezekben a megmagyarázhatatlan halálozásokban.