absztrakt

A fő

A glomerulonephritis kezelésében a gyógyszer beadásának időzítésének és időtartamának a helyi mikroszkópos gyulladás pontos értékelésén kell alapulnia. Noha szerológiai és vizeletjelzőket gyakran használnak erre a célra, ezek a paraméterek nem tükrözik közvetlenül a gyulladásos aktivitást. Az akut fázisú fehérjék, beleértve a C-reaktív fehérjét, nem hasznos markerek a glomeruláris gyulladás monitorozására. A jelenlegi, legmegbízhatóbb módszer a glomerulonephritis értékelésére a vesebiopsziát alkalmazó hisztopatológiai elemzés. A szövetbiopszia azonban invazív, komplikációk, például hatalmas vérzés kockázatával jár. Ezenkívül nem teszi lehetővé az utólagos értékelést, amely gyakran instabil, ingadozó glomerulonephritis esetén szükséges. A glomeruláris gyulladás folyamatos, nem invazív értékelésére szolgáló technológiák jelenleg nem állnak rendelkezésre. Ebben a jelentésben egy erre a célra alkalmas in vivo genetikai bioszenzor létrehozására összpontosítottunk.

Korábban leírtunk egy ex vivo génátviteli megközelítést, amely kifejezetten a glomerulusokat célozza meg. 1 Ez a módszer egy glomeruláris mesangialis sejtet használ vektorként a génszállításhoz. Vagyis a mesangialis sejteket izolált glomerulusokból tenyésztettük, in vitro idegen génekkel stabilan transzfektáltuk, és a vesekeringésen keresztül visszavittük őket a glomerulusokba. Az injektált sejtek az injektált vesében eloszlottak, és szelektíven felhalmozódtak a glomerulusokban. A sejtek tartós túlélését és a transzgén expresszióját legalább néhány hétig fenntartjuk. Ezt a sejttranszmissziós megközelítést alkalmaztuk egy olyan helyi bioszenzor létrehozására, amely érzékeli és beszámol a glomeruláris gyulladásos aktivitásról.

Mint fent említettük, az SRE molekuláris érzékelőként szolgálhat a glomerulonephritis számára. Az SRE promóter aktivitása az idegen génexpresszió hajtására azonban viszonylag gyenge a mesangiális sejtekben. Ebben a jelentésben ezért egy alternatív gyulladásos válaszelemet, a KB fokozó elemet használtunk a glomerulonephritis érzékelőjeként. A nukleáris faktor -KB (NF-kB) egy mindenütt jelenlévő, pleiotróp transzkripciós faktor, amely különböző gyulladásos folyamatokban vesz részt. 9, 10 A kísérleti és humán glomerulonephritis során az NF-κB aktiválódik, 11, 12, 13, ami a gyulladással járó gének expressziójához vezet a glomeruláris sejtekben. 14, 15 A KB fokozó elemnek hasznosnak kell lennie a glomerulonephritis szenzoraként.

Ebben a jelentésben kísérleti bizonyítékokat szolgáltatunk arra vonatkozóan, hogy a helyi gyulladás nem invazív módon nyomon követhető egy lokálisan generált bioszenzoron keresztül. A glomerulonephritis betegségmodellként történő felhasználásával bemutatjuk a K B-SEAP érzékelő rendszer alkalmazásának megvalósíthatóságát a helyi mikroszkópos gyulladás folyamatos in vivo monitorozásához.

Anyagok és metódusok

Sejtek és reagensek

Az izolált hím Sprague-Dawley 1 patkány glomerulusaiból képződött mesangiális sejteket (SM43) 5% marha-magzati szérumot (FBS) tartalmazó táptalajban tartottuk fenn. A vizsgálatokhoz általában 1% FBS-t tartalmazó táptalajt használtak. A ciklofoszfamid-monohidrátot a Wako-tól (Osaka, Japán) szerezték be. A humán rekombináns IL-1β és a TNF-a nagylelkű adomány volt az Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd (Tokushima, Japán) és Dr. Katsuo Noguchi (Teikyo Egyetem Orvostudományi Kar, Tokió, Japán).

Stabil transzfekció

Az SM/NF-kB B-SEAP5 mesangiális sejt-szenzort az SM43 sejtek pNF-kB B-SEAP-tal (BD Biosciences, Palo Alto, Kalifornia, USA) és pcDNA3.1-vel történő kotranszfektálásával határoztuk meg. (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), a fent leírtak szerint. 16 pNF-kB A B-SEAP a SEB-t kódolja a kB fokozó elem négy példányának ellenőrzése alatt. Az önmagában neo-t expresszáló ál-transzfektált mezangiális sejteket pcDNA3.1 transzfekcióval határoztuk meg. A megalapozott sejtek mesangialis sejt fenotípusát pozitív festéssel igazoltuk az a-simaizom aktin és a Thy 1, 1 ellen anti-α-simaizom aktin monoklonális antitesttel (1: 300 hígítás; Sigma, St Louis, MO, USA) és anti -Thy 1.1 monoklonális antitest 1-22-3 (5 ug/ml), 17, ill.

Northern Blot elemzés

A teljes RNS-t egylépéses módszerrel extraháltuk, 18 és Northern-blot elemzést végeztünk a fent leírtak szerint. 19 SEAP próbaként a pSEAP2-kontrollból (BD Biosciences) származó 1,5 kb-os Hind III-Xbal fragmentumot radioaktívan jelöltük és hibridizációhoz használtuk. Gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz expressziót alkalmaztunk terhelés kontrollként.

Teszteld a SEAP-ot

A SEAP aktivitást kemilumineszcencia módszerrel értékeltük a Great EscAPe SEAP detektáló készlet (BD Biosciences) alkalmazásával. Röviden, 5 μl táptalajt vagy patkány szérumot összekevertünk 15 μl 1x hígító pufferrel, és 65 ° C-on inkubáltuk 30 percig. Inkubálás után a mintákat összekevertük 20 μl L-homoarginint tartalmazó vizsgálati pufferrel, 5 percig hagytuk szobahőmérsékleten, majd 20 μl 1,25 mM CSPD kemilumineszcens szubsztrátot tartalmazó kemilumineszcens fokozót adtunk hozzá. 30 percig sötétben végzett inkubálás után a mintákat luminométerrel (Gene Light 55; Microtech Nition, Funabashi, Chiba, Japán) mértük a SEAP aktivitásra.

Crossing tanulmány

Kondicionált táptalajokat izolált normál és nefrit patkány glomerulusokból készítettünk. Ez utóbbi anti-Thy1 glomerulonephritis előállításához felnőtt, hím Sprague-Dawley patkányokban az előzőekben leírtak szerint 1-22-3 17 monoklonális antitestet indukáltunk. 4 nappal az antitestinjekció után glomerulusokat izoláltunk, és 1x104 glomerulust inkubáltunk 24 órán át 1 ml 1% FBS-t tartalmazó táptalajban. A kondicionált táptalajt összegyűjtöttük, az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából centrifugáltuk és keresztezési vizsgálatokhoz használtuk. Röviden: az érzékelő sejteket 1: 1 arányú hígított (50%) kondicionált táptalajnak tettük ki 24 órán át, és a tenyésztő táptalajt összegyűjtöttük a SEAP vizsgálathoz.

Ex vivo A glomerulonephritis érzékelése

A szenzorsejteket (1x106) tripszineztük és injektáltuk normál patkányok vagy nefrit patkányok bal vesearteriájába, amelyeket anti-Thy1 glomerulonephritisnek (1. nap) tettünk ki a fent leírtak szerint. 1, 4, 21 Sejtinjekció után a glomerulusokat mindkét veséből izoláljuk, hagyományos szitálási módszerrel. Mind a 1000 glomerulust 100 μl 1% FBS-t tartalmazó táptalajban inkubáltuk, és 12 óra elteltével a táptalajt összegyűjtöttük a SEAP-vizsgálatra. Az anti-Thy1 antitest SEAP-szekrécióra gyakorolt ​​lehetséges közvetlen hatásának vizsgálatához a szenzorsejtekben a sejteket 1-22-3 (0,5-5 ug/ml) -vel kezeltük 24 órán át, és értékeltük a SEAP aktivitást.

A sejttranszfer hatékonyságának értékelése

A szenzorsejtek glomerulusokba történő transzferjének hatékonyságát a fent leírtak szerint értékeltük. Röviden: a tripszinezett sejteket (1x106) fluoreszkáló festékkel festettük, 1,1'-dioktadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametil-indokarbocianin-perkloráttal (DiI; Molecular Probes, Eugene, OR, USA; 4 μg/ml ) 37 ° C-on 30 percig, és a patkányok bal veseartériájába injektáltuk. A vesekeringés helyreállítása után mindkét vesét eltávolítottuk és izolált glomerulusok előállítására használtuk fel. Az izolált glomerulusokat fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk, hogy értékeljük a DiI-pozitív glomerulusok százalékos arányát.

A glomerulonephritis in vivo monitorozása

A patkányokat négy csoportra osztottuk: normál patkányokra, normális patkányokra szenzoros sejtekkel, nefrit patkányokra és nefrit patkányokra szenzor sejtekkel. Szenzorsejtekkel injektált csoportokban 1 x 106 SM/NF-kB B-SEAP5 sejtet injektáltunk normál patkányok vagy nefrit patkányok bal veseartériájába, amelyek anti-Thy1 glomerulonephritisnek voltak kitéve (1. nap). A szérumokat a sejtinjekció előtt és 1, 3, 6, 8 és 10 nappal összegyűjtöttük, és SEAP vizsgálatnak vetettük alá. Annak tesztelésére, hogy a szenzorsejtek csak lokális gyulladást észlelnek-e és rögzítenek-e ott, ahol az érzékelő sejtek találhatók, 1x106 szenzorsejtet intraperitoneálisan, intraperitoneálisan injektáltunk nefrit patkányokba, és a szérum SEAP szintjét legfeljebb 9 napig vizsgáltuk. Minden kísérleti csoport legalább négy patkányt tartalmazott.

Annak igazolására, hogy az injektált szenzorsejtek túléltek a glomerulusokban a vizsgálat során, a glomerulusokat minden kísérlet végén (10. nap) mindkét veséből izoláltuk, és 10% FBS jelenlétében tenyésztettük. A növekvő sejteket 330 ug/ml G418 koncentrációval szelektáltuk, 1% formaldehiddel rögzítettük, és hematoxilinnel festettük a neomicin-rezisztens sejtek láthatóvá tétele érdekében.

Patkányokban az immunszuppresszív ciklofoszfamid intraperitoneális injekciója a keringő leukociták 98% -os kimerülését okozza 2 napon belül, ami a glomeruláris gyulladás és a proteinuria elnyomásához vezet a kísérleti glomerulonephritisben. Annak megállapítására, hogy a glomerulonephritis terápiás beavatkozása a szérum SEAP csökkenését eredményezi-e, patkányoknak intraperitoneálisan ciklofoszfamidot (165 mg/testtömeg-kg) injektáltak 2 nappal az érzékszervi sejtek injekciója előtt. 3 nap elteltével (Thy 1 glomerulonephritis, 2. nap) szérumokat gyűjtöttünk ciklofoszfamiddal kezelt (+) és kezeletlen (-) nefrit patkányokból, és SEAP tesztnek vetettük alá.

Immunfluoreszcencia vizsgálat

8 μm vastagságú fagyasztott szakaszokat készítettünk, és 60 percig inkubáltuk anti-patkány anti-patkány monoklonális ED1 antitesttel (1: 200 hígítás; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). Mosás után a metszeteket 60 percig inkubáltuk Alexa Fluor 488-konjugált anti-egér immunglobulinokkal (1: 1500 hígítás; Molecular Probes) és fluoreszcens mikroszkóppal kezeltük. Megszámoltuk az ED1-pozitív sejtek számát egy teljes méretű glomerulusonként, és az átlagértékeket használtuk összehasonlításra a különböző csoportokban.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± se-ként fejeztük ki. A statisztikai elemzést nem-parametrikus Mann-Whitney U-teszttel végeztük. P

helyi

A proinflammatorikus citokinek érzékszervi érzékelése. A patkány mangánsejteket stabilan transzfektáltuk a szekretált alkalikus foszfatáz (SEAP) génnel a KB fokozó elemek irányítása alatt, és gyulladásra érzékeny SM/NF-kB B-SEAP5 klónt generáltunk. a ) Immunfluoreszcens festés mesangialis sejt markerek, α- simaizom aktin és Thy 1.1. NC, negatív kontroll. ( b ) A SEAP expressziójának Northern blot elemzése citokinekkel exponált szenzorsejtekben. A sejteket 24 órán át IL-1β-nak (10 ng/ml) vagy TNF-α-nak (250 U/ml) tettük ki, és értékeltük a SEAP mRNS expresszióját. A glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPHD) expresszióját terhelés-kontrollként mutatjuk be. ( c ) SEAP-szekréció citokinnak kitett szenzoros sejtek által. A sejteket 24 órán át IL-1β vagy TNF-a-val kezeltük, és a táptalaj SEAP aktivitását kemilumineszcencia vizsgálattal értékeltük. A teszteket négy példányban hajtottuk végre. Az adatokat átlag ± se értékként adjuk meg, és a csillagok statisztikailag szignifikáns különbségeket jeleznek (P

A glomeruláris gyulladás érzékelése in vitro érzékszervi sejtekkel: crossover vizsgálat. A szenzorsejteket 24 órán át 1: 1 arányú hígított (50%) táptalajnak tettük ki, izolált normál vagy nephritikus glomerulusokkal kondicionálva, amelyek anti-Thy1 glomerulonephritisnek voltak kitéve (4. nap). A táptalajokat összegyűjtöttük és SEAP vizsgálatnak vetettük alá. A teszteket négy példányban hajtottuk végre. Az adatokat átlagként ± egy csillag jelzi, amely statisztikailag szignifikáns eltérést mutat a feltétel nélküli tápközegtől (kontroll), a kettős csillag pedig statisztikailag szignifikáns különbséget mutat a "normál" kondicionált közegtől.

Teljes méretű kép

A glomerulonephritis fokozatos értékelése in vivo. Szenzorsejteket (1 x 106 sejt) injektáltunk normál patkányok vagy nephritikus patkányok bal vese artériájába, amelyek anti-Thy 1 glomerulonephritisen estek át (1. nap). A patkányokat négy csoportra osztottuk: normál patkányokra (A csoport, n = 5), normális patkányokra szenzoros sejtekkel (B csoport; n = 4), nefrit patkányokra (C csoport; n = 4), és nephrit patkányokra oldatot injekció. érzékelő cellák (D csoport; n = 5). Sejtinjekció előtt és után a szérumokat 2-3 naponta gyűjtötték, és SEAP tesztnek vetették alá. Annak eldöntésére, hogy az érzékelő sejtek csak a helyi gyulladást észlelik-e, ahol a sejtek találhatók, 1 x 106 érzékelő sejtet (E csoport; n = 4) injektáltunk intraperitoneálisan, intraperitoneálisan, és a szérum SEAP szintjét monitoroztuk. legfeljebb 9 napig. Az adatokat átlag ± se értékként adjuk meg, és a csillagok statisztikailag szignifikáns különbségeket jeleznek (P

Szenzorsejtek megszerzése izolált glomerulusokból. A kísérletek végén (10. nap) a nem szteroid patkányok mindkét veséjéből glomerulusokat izoláltunk, amelyeket szenzorsejtek továbbítottak és 10% FBS jelenlétében tenyésztettek. Nefritikus (-), nefrit glomerulusok szenzoros sejtek nélkül; az érzékelő sejtek által továbbított nefrit (+), nefrit glomerulusok. Injekció nélküli normális patkányokból izolált glomerulusokat (normál (-)) használtunk negatív kontrollként. A növekvő sejteket G418-mal (330 ug/ml) 1-2 hétig szelektáltuk, 1% formaldehiddel rögzítettük és hematoxilinnel festettük a neomicin-rezisztens szenzorsejtek láthatóvá tétele érdekében.

Teljes méretű kép

Annak megállapításához, hogy az érzékszervi sejtek által továbbított szérum SEAP-szintje nefrit patkányokban csökkent-e terápiás beavatkozással, gyulladáscsökkentőt, ciklofoszfamidot használtunk. Patkányokban a ciklofoszfamid (165 mg/testtömeg-kg) intraperitoneális injekciója a glomeruláris gyulladás és a proteinuria jelentős szuppresszióját okozza kísérleti glomerulonephritisben. 20 nappal patkányokat intraperitoneálisan injektáltunk ciklofoszfamiddal 2 nappal a szenzoros sejtek injekciója előtt. 3 nap múlva (Thy 1 glomerulonephritis, 2. nap) szérumokat gyűjtöttünk gyógyszerrel kezelt és nefrit patkányokkal kezelt nefrit patkányokból, és SEAP tesztnek vetettük alá. Amint a 7. ábrán látható, a ciklofoszfamid beadása jelentősen gyengítette a szérum SEAP növekedését sejttenyésztett, nefrit patkányokban (a szérum SEAP szeres növekedése: ciklofoszfamiddal kezelt patkányokban 1,81 ± 0,50-szeres, szemben a kezeletlen ciklofoszfamidok 3-szorosával ). patkányok, P

Ebben a vizsgálatban a KB fokozó elemet használták szenzorként a glomeruláris gyulladáshoz. Az SEAP riporter rendszerrel kombinált egyéb szenzorszekvenciák azonban hasznosak lehetnek a glomerulonephritis in vivo monitorozásához. A gyulladásra érzékeny szekvenciák lehetséges jelöltjei az SRE és a 12-o-tetradekanoil-forbol-13-acetát-válasz elem (TRE). A mesangiális sejteket olyan expressziós plazmidokkal transzfektáltuk, amelyek SRE vagy TRE irányítása alatt vezetik be a SEAP gént. Stabil klónokat azonosítottunk és teszteltük a SEAP indukcióját az ingerekre adott válaszként, beleértve a szérumot, a vérlemezkéből származó növekedési faktort, a forbol-észtert és az IL-1β-t. A SEAP indukció mindkét szenzoros klónban váratlanul alacsony volt. Ellentétben a KB-alapú szenzoros sejtekkel, amelyek akár 70-80-szorosára is magas szintű SEAP-indukciót értek el, a maximális indukciós arány csak kétszer-háromszoros volt (nem publikált adataink). A SEAP alacsony indukciója az SRE- és TRE-alapú szenzorsejtekben ezen szabályozó elemek viszonylag magas bazális aktivitásának és/vagy a tenyésztett mesangiális sejtekben fellépő ingerekre adott alacsony indukálhatóságnak tudható be.

A SEAP-t riportermolekulaként használtuk a glomeruláris gyulladás meghatározására. Tudomásunk szerint ez az első, amely bemutatja az SEAP riporterrendszer in vivo hasznosságát a helyi gyulladás értékelésében. A szérum SEAP aktivitás könnyen, gyorsan és érzékenyen mérhető hagyományos kemilumineszcens módszerekkel. Ez nagy előnye a SEAP riporter rendszernek. Az in vivo SEAP riporterrendszer egyik hátránya, hogy a SEAP nem ürül a vizelettel.8 és a vizeletalapú aktivitás értékelése nem lehetséges. Ennek oka, hogy a SEAP molekulatömege körülbelül 64 kDa, 5, ami túl nagy ahhoz, hogy a glomeruláris alapmembránon keresztül lehessen szűrni. Más kisebb riportermolekulák, mint például az emberi koriongonadotropin, felhasználhatók a vizeletalapú betegség helyi aktivitásának monitorozására, 27 de további vizsgálatokra lesz szükség.

köszönöm

Ezt a munkát a Japán Oktatási, Kulturális, Sport-, Tudományos és Technológiai Minisztérium tudományos kutatásának támogatása támogatta (16390243 - MK).