elemeket

absztrakt

A gyermekkori elhízás összhangban van a keringő klasszikus CD14 + CD16 - és mérsékelt CD14 + CD16 + monociták megnövekedett számával. A monociták kulcsszerepet játszanak az érelmeszesedés kialakulásában és súlyosbodásában, ami felveti a kérdést, hogy a gyermekkori elhízásban előforduló monocitózis hozzájárult-e az aterogenezishez az évek során. Itt megvitattuk a monocita gén expressziós profilját gyermekkori elhízásban, az Illumina microarray platform segítségével 35 elhízott gyermek és 16 gyenge kontroll szétválogatott monocitáin. Az elhízott gyermekek a monocita gének erős expressziós profilját mutatták a sovány kontrollokhoz képest. Kvantitatív PCR-rel történő validálást követően tanulmányoztuk az 5 legjobban differenciáltan szabályozott monocita gén társulását a gyermekkori elhízásban az elhízással és a koszorúér-ateroszklerózis komplexitással (SYNTAX-pontszám) 351 felnőtt csoportban, akiknél az ischaemiás kardiovaszkuláris betegség kockázata volt. A monocita IMPDH2 és a TMEM134 downregulációját gyermekkori elhízásban elhízott felnőtteknél is megfigyelték. Ezenkívül a TMEM134 monocita downregulációja magasabb SYNTAX ateroszklerózis pontszámmal társult felnőtteknél. Összefoglalva: a gyermekkori elhízás magában foglalja a monocita génexpresszió változását, amely az elhízással és a koszorúér-érelmeszesedés megnövekedett komplexitásával jár együtt felnőtteknél.

A gyermekkori elhízás járványának riasztó kardiovaszkuláris következményei vannak, és így korlátozza a várható élettartam világszerte tapasztalható növekedését 1, 2. A korai életkori elhízás többféle módon is hozzájárulhat a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásához. Először is, a gyermekkori elhízás általában elhízáshoz vezet felnőttkorban, ami a szív- és érrendszeri betegségek, különösen a zsigeri zsírbetegség 3, 4 fontos kockázati tényezője. Másodszor, a gyermekkori és felnőttkori elhízás független rizikófaktorokkal rendelkezik a szív- és érrendszeri betegségek, például a magas vérnyomás szempontjából 5. Ezenkívül az elhízás okozta inzulinrezisztencia és a hiperglikémia az inzulin hibás jelzéséhez vezet az érfal elváltozás sejtjeiben, ami elősegíti az érelmeszesedést az artériás fal szintjén 6. Végül az elhízás alacsony szisztémás gyulladással jár, amely elősegíti az aterogenezist 7, 8 .

Sejt szinten a monociták kulcsfontosságú kapcsolatnak tűnnek az elhízás és a szív- és érrendszeri betegségek között. Az elhízás leukocitózissal jár, különösen a 7, 9 myeloid nemzetség esetében. A legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a zsírszármazékokból származó gyulladásos faktorok, például az IL-1β, stimulálják a csontvelő myeloid progenitorait, ami elhízás esetén monocitózishoz vezet 10. A megnövekedett monocitaszám mellett aktivált és gyulladásos fenotípus van az elhízásban. Emberben a monociták három fenotípus kategóriába sorolhatók: klasszikus CD14 + CD16-, köztes CD14 + CD16 + és nem klasszikus CD14 + CD16 + monociták 11. Korábban kimutattuk, hogy a gyermekkori elhízás a klasszikus CD14 + CD16 - 7. monocita alcsoport megnövekedett számával és aktivált fenotípusával jár. Ezek a monociták egyenértékűek a magas GR1 + Ly6c monocitákkal egerekben, amelyek gyulladásos makrofágokká és habsejtekké differenciálódnak az ateroszklerózis különböző modelljeiben 12, 13. Így a gyulladásos monociták megnövekedett száma a gyermekkori elhízásban hozzájárulhat az aterogenezishez az évek során.

Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy a rendezett monociták mikro-tömb elemzésével mélyebb megértést nyerjen a monocita gén expressziós profiljáról gyermekkori elhízásban a normál testsúlykontrollokhoz képest. A monocita génexpressziós profilokat tovább hasonlítottuk az ischaemiás szív- és érrendszeri megbetegedések kockázatának kitett 351 felnőttből álló megállapított kohorszhoz annak megállapítására, hogy a gyermekkori elhízás monocita génexpressziós profiljai átfedik-e a felnőttek monocitáinak aterogén fenotípusát. A felnőtt kohorsz számos klinikai paramétert tartalmazott, de a monocita génexpresszió és a SYNTAX ateroszklerózis pontszámok közötti kapcsolatra összpontosítottunk, mivel ez a koronária érelmeszesedés elváltozásainak komplexitásának értékelésére létrehozott angiográfiai osztályozási rendszer, amelyet széles körben használnak ateroszklerotikus terhelés-leolvasásként., 17, 18 .

az eredmény

A gyermekkori elhízásban szenvedő monociták erős génexpressziós profilt mutatnak

Az elhízott gyermekek tipikus klinikai és biokémiai jellemzőket mutattak, a testtömeg-index életkor és nem szerinti szignifikánsan nagyobb szórásával (BMI-SD) összehasonlítva a sovány kontrollokkal (3, 4 vs. 0,4, p 109/ml vs. 0,4 x 109/ml, p + CD16 - monociták (52,0 × 107/ml vs. 36,2 x 107/ml, p = 0,001) és magasabb átlagos CD14 + CD16 + monociták (4,6 x 107/ml szemben 3,3 x 107/ml, p

expressziója

Hőtérkép és a monocita gének expressziójának klaszteranalízise. A hőtérkép a gének klaszterének felépítését hierarchikus faként mutatja, különböző ágakkal, és a z-pontszámok segítségével jeleníti meg a populációs átlag felett vagy alatt különböző adatokat.

Teljes méretű kép

Kvantitatív PCR validálás

Kvantitatív PCR-t (qPCR) alkalmaztunk a génexpresszió eredményeinek megerősítésére, az első 20 mikroray-beavatkozásra összpontosítva. A QPCR elemzések megerősítették a monocita gének hidroximetil-bilán-szintáz (HMBS) (p = 0,01), leucinban gazdag Pentatricopeptide Repeat tartalmazó (LRPPRC) (p = 0,005), transzmembrán fehérje 134 (TMEM134) (p = 0,028) és Zwilin Kinetochore gének megfigyelt visszaszorítását. (ZWILCH) (p = 0,005) gyermekkori elhízásban a sovány kontrollokhoz képest (2. ábra, 7. kiegészítő táblázat). Ezenkívül az inozin-monofoszfát-dehidrogenáz 2 (IMPDH2) tendenciát mutatott az elhízott monociták csökkenése felé (p = 0,06). Az elhízott felnőtteknél a monociták jelentős mértékű csökkentése miatt az IMPDH2-t a későbbi elemzésekbe is bevonták. Ez az 5 szabályozatlan gén együtt képezte a kiindulópontot a további vizsgálatokhoz. Először megvizsgálták az 5 alulszabályozott monocita gén és a gyermekkori klinikai változók kiválasztásának összefüggését (3. és 4. kiegészítő táblázat). Másodszor, az elhízással és az érelmeszesedéssel összefüggést vizsgálták az ischaemiás szív- és érrendszeri betegségek kockázatának kitett felnőtteknél.

A kvantitatív PCR megerősíti 5 monocita gén szabályozásának csökkenését gyermekkori elhízás esetén. A grafikonok a kívánt gén többszörös indukcióját mutatják, normalizálva a génexpresszióhoz. A hibasávok a SEM-et képviselik.

Teljes méretű kép

Pályaelemzés

A megfigyelt génexpressziós profil funkcionális relevanciájára összpontosítva a differenciálisan expresszált gének biológiai folyamatokban való funkcionális dúsulását a ToppFun eszköz, a GO Term Enrichment eszköz segítségével értékeltük. A 67 génből hatvannégyet a ToppFun segítségével azonosítani lehetett, és feltérképezni a biológiai folyamatokban részt vevő útvonalakra, legalább 10 gén útmérettel. Ezek a gének főleg az oxidatív foszforilációban és a különböző anyagcsere folyamatokban vettek részt (5. kiegészítő táblázat, 1. kiegészítő ábra).

Monocita gén expresszió és felnőttkori elhízás és kardiovaszkuláris kockázat

Annak megállapítására, hogy a veszélyeztetett felnőtteknek van-e az elhízott gyermekekhez hasonló monocita génexpressziós profilja, 5 validált monocita gént vizsgáltak 351 felnőtt csoportban, akiknek kockázata volt az ischaemiás kardiovaszkuláris betegségre. A felnőtt kohorsz klinikai jellemzőit a 8. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

vita

Eredményeink kiemelik a monocitózis fontosságát a gyermekkori elhízásban, és számos érdekes kérdést vetnek fel. Először is, a differenciálisan szabályozott monocita gének útjának elemzése a gyermekkori elhízásban az oxidatív foszforiláció, az oxidatív stressz és az intracelluláris anyagcsere útvonalainak túlzott reprezentációját tárta fel, ami nyilvánvalóan tükrözi az aerob glikolízis újraprogramozását. Míg a nyugalmi immunsejteknek elsősorban ATP-re van szükségük a sejtek szükségleteinek kielégítéséhez, és glükóz- és piruvátkonverziót (glikolízist) és oxidatív foszforilezést alkalmaznak ezeknek az igényeknek a kielégítésére, a gyulladásos mikrokörnyezetben sok immunsejt metabolikus átprogramozáson esik át az aerob glikolízis érdekében, hogy részt vegyen a sejtek növekedésében és szaporodásában. 23. Érdekes módon az aerob glikolízis szabályozása egybeesik a "képzett immunitás" kialakulásával is 24. Mikrobiális részekkel és/vagy metabolitokkal történő ismételt stimulálás után a monociták epigenetikus átprogramozáson mennek keresztül az aerob glikolízis felé, ami fokozza a képzett monociták reakcióját a 23, 25 újra stimulálására. A legújabb irodalom szerint az edzett immunitás kialakulása hozzájárul a szisztémás gyulladás és az érelmeszesedés kialakulásához, és érdekes célpontot jelent a terápiás beavatkozás szempontjából 25 .

Másodszor, a TMEM134 szerepe a monocitákban egyre nagyobb vonóerővel bír. Humán monocita vizsgálatokban a TMEM134 expressziója csökkent a klasszikus CD14 + CD16- és köztes CD14 + CD16 + monocitákban, ellentétben a nem klasszikus CD14 + CD16 + monocitákkal 26. Így a gyermekkori elhízásban és a kardiovaszkuláris rizikóban szenvedő felnőtteknél a TMEM134 lefelé történő szabályozása tükrözheti a CD14 + CD16 + és a CD14 + CD16 + által indukált CD14 + indukált elhízást. Tisztázni kell, hogy a nagymértékben konzervált 21,5 kDa transzmembrán fehérje, a TMEM134 aktív szerepet játszik-e a monocita differenciálódásban. A meglévő vizsgálatok azt mutatják, hogy a TMEM134 befolyásolja a gyulladásos nukleáris faktor-KB (NF-KB) jelátviteli útvonal prototípusát. A TMEM 134-et a látens membrán fehérje 1 (LMP1) és a hepatitis E vírus nyitott 2. leolvasási keretének (ORF2) megkötő fehérjéjeként azonosítottuk, és ez befolyásolta a downstream NF-KB jelátvitelt ezen kötőpartnereken keresztül 27, 28. Fontos, hogy a downstream NF-κB jelátvitel modulációját a veleszületett immunprogramozás egyik jellemzőjének tartják krónikus gyulladás esetén 29. Ezért csábító feltételezés, hogy a gyermekkori elhízás monocitákban a TMEM134 megfigyelt visszaszorítása összefügg a képzett immunitás kialakulásával, amint azt fentebb tárgyaltuk.

Végül figyelembe kell venni a jelenlegi tanulmány korlátait. Mivel a gyermekgyógyászati ​​vizsgálatok népessége viszonylag kicsi volt, a tanulmányunkban közölt egyesületek finom erővel bírnak. Másodszor, a környezeti tényezők, például a fagyás-olvadás monociták, befolyásolhatják a génexpressziós profilokat. Noha a gyermek- és felnőtt mintákat hasonlóan kezelték, a feldolgozás kisebb különbségei befolyásolhatják a génexpressziós profilokat. Harmadszor, úgy döntöttünk, hogy a qPCR által validált 5 monocita génre összpontosítunk. Ezért figyelmen kívül hagyhattuk azokat a fontos monocita géneket, amelyek nem szerepeltek a qPCR validálásban. Végül a CD14-pozitív mágneses gyöngyök válogatása eltérítette az elemzett monocita rekeszeket a klasszikus CD14 + CD16 és a köztes CD14 + CD16 + monociták irányából (2. kiegészítő ábra), és részben nem vette figyelembe a nem klasszikus CD14 + CD16 + monocita részhalmazokat, ami kevésbé fontosnak tartják az érelmeszesedés kialakulásában 21, 22 .

Összefoglalva, a gyermekkori elhízás magában foglalja az elhízással és a koszorúér-érelmeszesedés megnövekedett komplexitásával járó monocita gének expressziójának változását felnőtteknél. Különösen a TMEM134 monocitákban betöltött szerepe nyeri el a vonóerőt, mert a TMEM134 monociták visszaszorítása gyermekek és felnőttek elhízásával járt együtt, és időben egybeesett az iszkémiás szív- és érrendszeri megbetegedések kockázatának kitett felnőttek magasabb SYNTAX ateroszklerózis pontszámával.

mód

Gyermekcsoport

A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) 51, 6-16 éves (35 elhízott, 16 gyenge kontroll) gyermeknél vizsgálták. A sejteket egy korábban közzétett keresztmetszeti vizsgálatból nyerték a hollandiai Amersfoort városában, a Meander Medical Center gyermekgyógyászati ​​ambulanciáján, amely 60 elhízott gyermekből, valamint 30 életkor és nem szerinti kontrollcsoportból állt 7. Mivel a PBMC-k 35 elhízott gyermek és 16 rossz kontroll esetében voltak elérhetőek, ezeket a gyerekeket bevonták a jelenlegi vizsgálatba. Fontos, hogy a tárolt PBMC-k rendelkezésre állása attól függött, hogy a beteg mennyi vért adott fel a beiratkozás után, ami véletlenszerűen változott. Ezért úgy gondoljuk, hogy a jelenlegi vizsgálatban a betegeket randomizálták az előző vizsgálatba.

A BMI-SD az ötödik holland növekedési vizsgálat (2008-2010) eredményei alapján került kiszámításra. A gyermekkori elhízást BMI-SD> 2, 5-ként határozták meg, ami extrapolálható az elhízás nemzetközi meghatározására, mint a BMI> 30 kg/m2 felnőtteknél 30, 31. A vérnyomást automatizált oszcillometriás módszerrel mértük (Dinamap; GE Healthcare, Amersham, Egyesült Királyság). A lipidprofilokat standardizált laboratóriumi eljárásokkal állítják elő. Minden gyermektől és szüleiktől írásos beleegyező nyilatkozatot kaptak. A tanulmányt a hollandiai Utrechti Egyetem Orvosi Központjának Intézményi Orvosi Etikai Felülvizsgálati Testülete hagyta jóvá. Az emberi biológiai anyagokkal végzett összes kísérletet a vonatkozó irányelveknek és előírásoknak megfelelően végezték el.

Felnőtt csoport

monociták

A perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) izoláltuk mindkét kohorszban Ficoll-Paque sűrűséggradiens centrifugálással. A gyermekkori kohorszban az áramlási citometriás fenotipizálást a korábbi vizsgálatokban hajtották végre 7. Az izolálást követően a mintákat fagyasztó közegben (FCS 10% DMSO-val, Sigma-Aldrich) tároltuk a további felhasználásig. A monociták izolálásához a tárolt mintákat felolvasztjuk és 1-glutamáttal kiegészített RPMI1640-et és 2% FCS-t és 25% M HEPES-t (Gibco) tartalmazó tápközegben mossuk, amely 2% FCS-t és penicillin/sztreptomicint (100 egység/ml) (Invitrogen) tartalmaz. A sejteket 10 percig centrifugáltuk, szobahőmérsékleten 1600 fordulat/perc sebességgel. Ezután a PBMC-ket MACS pufferben - 2% FBS (Biowest), 2% EDTA (VWR vegyszerek) PBS-ben (Gibco) - szuszpendáltuk, és megszámoltuk a tripán kék kizárási módszerrel (Gibco). Anti-humán CD14 mágneses részecskék, ahol ezt követően monociták izolálására használják a céges protokoll (BD IMag) segítségével. A CD14 pozitív sejteket ezután 500 μl TRIZOL-ban (Life Technologies) újraszuszpendáltuk és -80 ° C-on tároltuk.

Microarray és adatfeldolgozás

Az RNS-t izoláltuk trizolizált AROS Applied Biotechnology mintákból. 35 elhízott gyermek, 16 egészséges kontroll gyermek és 351 felnőtt mintája ugyanazon izolációs eljáráson ment keresztül, és hasonlóan kezelték őket. Röviden, a mintákat egy Illumina TotalPrep RNS amplifikációs készlet és 100 ng teljes RNS felhasználásával jelöltük. Az IVT terméket gélen ellenőriztük és NanoDrop (Thermo Scientific) alkalmazásával számszerűsítettük. 750 ng cDNS-t használtunk a szokásos Illumina-protokollhoz, mielőtt a mintákat hibridizáltuk a mezőkkel (Illumina humanHT-12 v3). A mezőket egy Bead Array Reader (Illumina) segítségével szkenneltük. Az átlagos mintaintenzitás ellenőrzése után 33 közepes intenzitású mintát vettünk .

qPCR érvényesítés

A 67 különböző módon expresszált gén validálásához a top 20 találat qPCR primereit tervezték. Ezen primerpárok közül 17 működött optimálisan, és hasznosnak ítélték őket az érvényesítési folyamat során (6. kiegészítő táblázat). Kiváló minőségű RNS állt rendelkezésre 27 elhízott gyermek és 11 egészséges kontroll számára a qPCR validációs vizsgálatokhoz. A QPCR elemzést SYBR Select Master Mix reagensekkel (Thermo Fischer Scientific) hajtottuk végre, és a QuantStudio Flex rendszert (Thermo Fischer Scientific) futtattuk. Az adatokat a GUSB, 36B4 és B2M génexpresszióra normalizáltuk a nemzetközi szabványokkal összhangban 34 .

statisztika

Először is, a vizsgált populáció demográfiai jellemzőit számok és százalékok formájában adtuk meg a kategorikus változók esetében, valamint standard deviációjú átlagként (SD) vagy interkvartilis tartományú mediánként (Q1, Q3) a normál és normálisan elosztott folytonos változók esetében. Ezt követően összehasonlították a monocita gének expressziós profilját szegény és elhízott gyermekeknél, és a két csoport közötti szignifikáns különbségeket a folyamatos változókra vonatkozó Mann Whitney U tesztekkel és a bináris változók X2 tesztjével értékelték.

Másodszor, a monocita génexpressziós profilokat hasonlítottuk össze az R. Limma csomag segítségével. Röviden: a Limma csomag empirikus Bays módszereket használ a génexpressziós mikrosávok adatainak elemzésére, és kifejezetten kisebb adatsorok elemzésére szolgál 33. Ehhez az elemzéshez a gének kimeneti változókként (függő változók) és az elhízás állapota determinánsként (független változó) működtek. Kovariátumokként az életkor és a nem szerepelt a modellben. Ezenkívül a Benjamini Hochberg (BH) korrekciót alkalmazták a többszörös teszteléshez. A mikroarray elemzés eredményeinek szemléltetésére hőtérképet készítettünk a hőtérkép függvény segítségével. 2 R.-ben. A hierarchikus klaszterezést egy teljes csomópont alkalmazásával hajtottuk végre.

Harmadszor, lineáris regresszióval vizsgálták az elhízás állapota és a génexpresszió (függő változó) kapcsolatát. Ehhez az elemzéshez két modellt készítettek; a nyers modell (1. modell) és az a modell, amelyben az életkor és a nem szerepel kovariátként (2. modell) (2. kiegészítő táblázat).

Negyedszer, a qPCR által validált 5 gén és a klinikai változók közötti kapcsolatot tanulmányozták az egész gyermekcsoportban (n = 51), valamint az elhízott alcsoportban (n = 35) és a felnőttek csoportjában (n = 351) lineárisan regresszióanalízis (3. és 4. kiegészítő táblázat). A gyermekcsoport egész életkorában végzett elemzéshez a nemet és a BMI-SD-t kovariátumokként, míg az elhízott életkor és a nem alcsoportjába tartozó elemzéseket kovariátumokként vettük fel. P kétoldalas