zsírsav

  • absztrakt
  • A fő
  • mód
  • Mintavétel.
  • MCD, ACC és AMPK immunoblot elemzése.
  • Minta kiválasztása.
  • Adatelemzés.
  • AZ EREDMÉNYEK
  • Beteg demográfia.
  • Az MCD kifejezésének életkorral kapcsolatos változásai.
  • Korfüggő változások az ACC expresszióban és a foszforilációban.
  • Az életkorral kapcsolatos változások az AMPK kor expressziójában és foszforilációjában.
  • A miokardiális hipertrófia hatása az MCD expressziójára, valamint az ACC és AMPK expressziójára és foszforilációjára.
  • VITA
  • Tanulmányi korlátozások.
  • szójegyzék

absztrakt

Szállítás után a malonil CoA-szintjének drámai csökkenése a zsírsav oxidációjának gyors érleléséhez vezet. Korábban kimutattuk, hogy a malonil-CoA csökkenése a megnövekedett malonil-CoA-dekarboxiláz (MCD) aktivitásnak és az acetil-CoA-karboxiláz (ACC) aktivitás csökkenésének köszönhető, amelyek enzimek lebontják és szintetizálják a malonil-CoA-t. A csökkent ACC aktivitás az 5'-AMP-aktivált protein kináz (AMPK) megnövekedett aktivitásának felel meg, amely foszforilálja és gátolja az ACC-t. Ezeket a változásokat késlelteti a szívizom hipertrófiája. Mivel a zsírsav oxidáció sebessége befolyásolhatja a szív képességét, hogy ellenálljon az iszkémiás károsodásoknak, megvizsgáltuk az MCD, az ACC és az AMPK expresszióját az újszülött emberi szívben. Kamrai biopsziákat szívműtéten átesett gyermekektől nyertek. Az immunoblot analízis pozitív korrelációt mutatott az MCD expresszió és az életkor között. Ezzel szemben negatív összefüggést figyeltek meg az ACC és az AMPK expressziója és az életkor között. Valamennyi kamrai minta bizonyos fokú hipertrófiát mutatott, de a mérsékelt és a súlyos hipertrófia között nem találtunk különbséget az enzim expressziójában. Ez arra utal, hogy a megnövekedett MCD expresszió, valamint az ACC és AMPK expresszió csökkenése fontos szabályozója a zsírsav oxidáció érésének az újszülött emberi szívben.

A fő

A zsírsav-anyagcsere szabályozása a szívben. Az ACC-t inaktiválja a P-AMPK foszforilezése. Az aktív ACC katalizálja az acetil-CoA karboxilezését malonil-CoA-vá, amely gátolja a mitokondriális zsírsavak sebességkorlátozó enzimét, a CPT-1-et. Az MCD katalizálja a malonil-CoA dekarboxilezését acetil-CoA -vá, ezáltal eltávolítva a CPT-1 gátlását, (a) az aktív formát, (i) az inaktív formát, (+) stimulálja, (-) gátolja.

Teljes méretű kép

A szív zsírsavainak oxidációját különböző patofiziológiai állapotok, például a szívizom hipertrófiája befolyásolhatják. Felnőtteknél a szívizom hipertrófiája drámai változásokkal jár az energia-anyagcserében, különösen a magzati glikolitikus fenotípusra való áttéréssel (20–22). Az újszülöttnél a szívizom hipertrófiája késlelteti a zsírsav oxidáció érését a tartósan megemelkedett CoA malonil-szint, megnövekedett ACC-aktivitás és csökkent AMPK-aktivitás miatt (17). A zsírsav-oxidáció érlelésének ez a késése oda vezethet, hogy az újszülött szív a glikolízisre, mint az ATP elsődleges forrására támaszkodik, és metabolikus eltolódás figyelhető meg a hipertrófiás felnőtt szívben is (20–22).

A szívizom hipertrófia veleszületett szívelégtelenségben szenvedő gyermekkorú betegeknél fordulhat elő, például fallot tetralógiában (TOF), bal szív hipoplasztikus szindrómában (HLHS), atrioventricularis septumhibákban (AVSD), kamrai septum defektusokban (VSD) vagy jobb kamrai kiáramló traktus obstrukciójában. (RVOTO). Nem ismert, hogy a miokardiális hipertrófia megváltoztatja-e az enzimek expresszióját, amelyek szabályozzák a Malonyl CoA szintjét, és ezáltal a zsírsav oxidáció érését az újszülött emberi szívben.

mód

Mintavétel.

A törvényes képviselő beleegyezésével a szívizom műtéten áteső csecsemőktől a szívizom jobb kamrájának 18 és 200 mg közötti nagyságú 26 mintáját vették a veleszületett szívhibák kijavítására. A mintákat a sebészeti beavatkozás részeként általában reszektált és eldobott mintákból nyertük. A műtéteket és mintákat vettük az Alberta Egyetem Kórházában, a Walter C. Mackenzie Egészségtudományi Központban, Edmontonban, Alberta, Kanada. Az etikai jóváhagyást az Alberta Egyetem Etikai Egészségügyi Kutatási Etikai Tanácsa adta meg, 4876-os fájl. Az összes szövetet azonnal folyékony N2-ben lefagyasztották, és -80 ° C-on tárolták, amíg fel nem használták őket biokémiai elemzésre.

MCD, ACC és AMPK immunoblot elemzése.

A biokémiai elemzéshez 25 ± 2 mg szövetet homogenizáltunk 0,05 M Tris-HCl-t, 0,25 M mannitot, 1 mM EDTA-t, 1 mM EGTA-t, 50 mM nátrium-fluoridot, 5 mM nátrium-pirofoszfátot, 1 mM ditiotreitolt tartalmazó pufferben, 0,1%. (vol/vol) emlős szöveti proteáz inhibitor (Sigma Chemical Co. Aldrich, Oakville, ON), 1% (vol/vol) foszfatáz I inhibitor koktél (Sigma Chemical Co.-Aldrich, Oakville, ON), foszfatáz II inhibitor koktél ( Sigma Chemical Co.-Aldrich, Oakville, ON) és 10% (w/v) glicerin. A homogenátumokat centrifugálással tisztítottuk, és a felülúszót biokémiai elemzés céljából összegyűjtöttük. A fehérjét Bradford módszerrel számszerűsítettük. Western immunblotokat a korábban leírtak szerint hajtottunk végre (16). Az MCD-t anti-MCD antitesttel (házon belül készített H2-40 antitesttel) immunblotoltuk. Az ACC-t nyúl anti-foszfo-ACC (Ser79) antitesttel (Upstate Cell Signaling Technologies USA, Charlottesville, VA) vagy peroxidázzal konjugált streptavivdin antitesttel (KPL, Gaithersburg, MA) immunizáltuk. Az AMPK-t antifoszfo-AMPK antitesttel (Thr 172) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) vagy antiAMPK antitesttel (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) immunblotoltuk.

Minta kiválasztása.

Mivel a szívizom hipertrófiája súlyosságával arányos módon csökkentheti a zsírsav oxidációját (26), a mintákat a hipertrófia súlyossága alapján rétegeztük. A hipertrófiát az enyhe szívgyermeksebészek enyhe, közepes és súlyos kategóriába sorolták, figyelembe véve az elváltozás típusát és a beteg életkorát. Ahol lehetséges, a jobb kamrai falvastagság számszerűsítését M-módú/kétdimenziós echokardiográfiával végeztük, akár hosszú, akár rövid tengely nézetben úgy, hogy az elülső él az él felé ugyanazon a szinten van, mint a bal kamrai papilla izmok. Abban az esetben, ha echokardiográfiai feljegyzések nem álltak rendelkezésre, a hipertrófiát kizárólag az elváltozás típusa és a beteg kora szerint osztályozták.

Adatelemzés.

A nagy mintaméret miatt 3 gélt hajtottak végre minden megfigyelt enzimnél (MCD, P-ACC, ACC, P-AMPK és AMPK). A nyugati immunblotolás során alkalmazott primer és szekunder antitestek titerében enyhe változásokra van lehetőség. Ennek eredményeként az összes nyers érték logaritmusát figyelembe vették az adatok torzításakor (2-4. Ábra). Minden csoport esetében elvégeztük az átlag ± SD normalizálását az egyes gélek közötti kis különbségek eltávolítása érdekében, lehetővé téve a közvetlen összehasonlítást. Így 26 mintaméretet kaptunk 0,2-10 hónapos csecsemők mintáival. Az enzim expressziójának életkorfüggő változásait lineáris regressziós analízissel határoztuk meg. Szükség esetén az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Az MCD, az ACC és az AMPK expressziójának különbségeit a klinikailag enyhe és súlyos hipertrófia között Mann-Whitney U-teszttel becsültük meg. Az eredményeket a p

Normalizált MCD expresszió a jobb kamrai miokardiális szövetekben 0,2-10 hónapos csecsemőknél (n = 26), ami az MCD expressziójának életkorfüggő növekedését mutatja (r = 0,42, p = 0,03). A betét reprezentatív nyugati immunblotokat mutat.

Teljes méretű kép

AZ EREDMÉNYEK

Beteg demográfia.

Összesen 26 jobb kamrai biopsziát (10 mintát betegektől és 16 mintát férfitól) nyertünk 5 napos (0, 2 hónapos) és 10 hónapos újszülöttektől, akiknél VSD, HLHS, AVSD, TOF műtéti korrekciót hajtottak végre. vagy RVOTO (1. táblázat). Ezeket a mintákat használták az MCD expresszió korfüggő változásainak, valamint az ACC és AMPK expresszió és foszforiláció korfüggő változásainak értékelésére. Valamennyi betegnek volt bizonyos fokú miokardiális hipertrófiája. Az RVOTO-ban szenvedő betegeknél általában súlyos hipertrófiát találtak (1. táblázat). A miokardiális hipertrófia MCD, ACC és AMPK expressziójára gyakorolt ​​hatásainak jellemzésére a hasonló korú (medián életkor = 3,5 hónap), közepes vagy súlyos hipertrófiában szenvedő betegek (csoportonként n = 5) alcsoportját választották (lásd 4.8 pont). lent).

Asztal teljes méretben

Az MCD kifejezésének életkorral kapcsolatos változásai.

Először értékelték az életkornak a malonil CoA acetil CoA-ká történő dekarboxilezéséért felelős enzim, a szív MCD expressziójára gyakorolt ​​hatását. Jelentős (p = 0,03) korfüggő növekedést figyeltek meg az MCD expressziójában (2. ábra), ami arra utal, hogy a gyermek érésével az MCD expresszió növekedése valószínűleg csökkenti a CoA malonil-tartalmát, és ezáltal gátolja a CPT-1-et, ami megengedő hatások a hosszú láncú szívizom zsírsavak oxidációjára. A korlátozott minta-hozzáférhetőség miatt azonban a kamrai biopsziákban a malonil CoA-szinteket nem mértük ebben a vizsgálatban.

Korfüggő változások az ACC expresszióban és a foszforilációban.

Kiértékeltük továbbá az életkornak a szív ACC expressziójára gyakorolt ​​hatását. Bár a szív mind a 265, mind a 280 kD ACC izoformákat expresszálja, a 280 kD izoform túlsúlyban van, és a 265 kD izoformát nem sikerült Western immunblotolással kimutatni. Jelentős (p = 0,002), életkorfüggő csökkenés volt megfigyelhető az ACC expresszióban (3. ábra), ami arra utal, hogy a szív érlelődésével az ACC expresszió csökkenése valószínűleg csökkenti a malonil CoA szintézist. Mivel az ACC foszforilezhető a szerin-79-nél, és gátolható az AMPK-vel, ezért mi is mértük a P-ACC szintet egy foszfo-specifikus antitesttel. Az ACC foszforiláció mértékében nem voltak életkorral összefüggő változások. Ez arra utal, hogy a malonil CoA szintézisét és a zsírsav oxidációjának érését valószínűleg az ACC expresszió szintje szabályozza, és nem az újszülött emberi szív ACC foszforilációs állapota.

Normalizált ACC expresszió a jobb kamrai miokardiális szövetekben 0,2-10 hónapos csecsemőknél (n = 26), ami az életkor függő csökkenését mutatja az ACC expressziójában (r =, 0,66, p = 0,002). A betét reprezentatív nyugati immunblotokat mutat.

Teljes méretű kép

Az életkorral kapcsolatos változások az AMPK kor expressziójában és foszforilációjában.

Ennek további vizsgálatához tovább értékelték az életkor AMPK expresszióra gyakorolt ​​hatásait. Jelentős (p = 0,04) korfüggő csökkenés volt megfigyelhető az AMPK expresszióban (4. ábra). Nem történt életkorfüggő változás az AMPK foszforiláció (aktiváció) mértékében, amelyet úgy határoztak meg, hogy a P-AMPK-t normalizálták az egyes kamrai biopsziás mintákban kimutatott AMPK teljes mennyiségéhez.

Az AMPK normalizált expressziója a jobb kamrai szívizomszövetben 0-10 hónapos csecsemőktől (n = 26), ami az AMPK expressziójának életkorfüggő csökkenését jelzi (r =, 0,41, p = 0,04). A betét reprezentatív nyugati immunblotokat mutat.

Teljes méretű kép

A miokardiális hipertrófia hatása az MCD expressziójára, valamint az ACC és AMPK expressziójára és foszforilációjára.

A vizsgálatban szereplő összes kamrai biopsziás minta a szív hipertrófiájának változó mértékét mutatta (1. táblázat). A klinikailag enyhe (n = 1) és a mérsékelt hipertrófia (n = 2) besorolású kamrai biopsziás minták korlátozott száma kizárja az MCD, ACC és AMPK expresszió lehetséges változásainak statisztikai elemzését. A hipertrófia hatása az MCD, az ACC és az AMPK expressziójára a kamrai biopsziás mintákra korlátozódott, amelyek klinikailag enyhe vagy súlyos hipertrófiának minősülnek. Az MCD, az ACC és az AMPK expresszióját két csoportban (n = 5 csoportonként) értékelték 2-6 hónapos korosztályban, klinikailag enyhe vagy súlyos hipertrófiával (2. táblázat). Nem figyeltek meg különbséget az MCD, az ACC vagy az AMPK expressziójában az enyhe és a súlyos hipertrófia között. Azonban a súlyos hipertrófiában szenvedő betegeknél a mérsékelt hipertrófiában szenvedőkhöz képest (3. táblázat) szignifikáns (p = 0,03) csökkenés mutatkozott a β-AMPK (aktív) és a teljes AMPK arányában.

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

VITA

Ez a tanulmány megvizsgálta az életkor és a szívizom hipertrófia hatását a szív MCD expressziójára, valamint a szív ACC és AMPK expressziójára és foszforilációjára. A 0,2-10 hónapos gyermekgyógyászati ​​betegek kamrai biopsziás mintái fokozták az életkorfüggő MCD expressziót. Ezzel szemben az életkortól függően az ACC és az AMPK expressziója anélkül történt, hogy bármilyen életkorfüggő hatással lenne az újszülött emberi szív bármely enzimjének foszforilációjára. A hipertrófia (súlyos hipertrófia az enyhe hipertrófiával szemben) nem befolyásolta az MCD expressziót, az ACC expressziót és a foszforilációt. Noha az AMPK expressziójában nem volt szignifikáns különbség a súlyos és a mérsékelt hipertrófia között, az AMPK foszforilációja csökkent volt a súlyos hipertrófia kezdetekor. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az MCD, az ACC és az AMPK expressziójának változásai valószínűleg alátámasztják a CoA malonil-tartalmának változásait (ebben a tanulmányban nem értékelték), különös tekintettel az újszülött emberi szív zsírsav-oxidációjának érlelésére az öregedés során. Ezek az adatok azt is sugallják, hogy az AMPK foszforilációjának (azaz az aktiválásának) változásai, de nem az AMPK expressziója okozhatja a zsírsav oxidáció érési sebességének különbségeit, amelyeket az újszülött emberi szív különböző fokú miokardiális hipertrófiájában figyeltek meg.

Az MCD expressziójának vizsgálata életkorfüggő növekedést mutatott ki a születés után. Ez a megnövekedett expresszió valószínűleg szabályozza a zsírsav-oxidáció érését, mivel az MCD-tartalom növelése növelheti a malonil-CoA lebomlását, és ezáltal gátolhatja a mitokondriális zsírsavak sebességkorlátozó enzimét, a CPT 1-t. Ezt támasztják alá az újszülött nyúlszív korábbi megállapításai, ahol a malonil-CoA-tartalom 1-7 napos korban drámai csökkenést mutat, összhangban a zsírsav-oxidáció 10-szeres növekedésével. Az MCD aktivitása önmagában nem változik az újszülött szívbe történő zsírsav-szállítás különbségei miatt (27). Bár a kamrai biopsziákban a minták korlátozott jellege miatt nem tudtuk meghatározni az MCD aktivitást, korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az MCD aktivitása növekszik az újszülött szív életkorának növekedésével (11). Bár ebben a tanulmányban nem értékelték az MCD expressziót (11), ez alátámasztja az MCD expresszió változásainak potenciális jelentőségét, amelyek az MCD aktivitásának változásai mögött állnak, és így szabályozzák a malonil CoA-tartalmat és a zsírsav oxidáció érését az újszülött szívében.

Az MCD, az ACC és az AMPK expressziója hasonló korú betegek kiválasztott csoportjában nem mutatott különbséget az enyhe és a súlyos hipertrófia között. A hipertrófiát életkor és a sérülés típusa szerint osztályozták a szívbiopszia után, amikor a jobb kamrai falvastagságot nem befolyásolták az in vivo kardiális hemodinamikai és nyomásparaméterek. Bár egy korábbi jelentés az újszülöttek hipertrófiájában szenvedő sertésszínekben a zsírsav-oxidáció érlelésének késedelmét írta le (akár 21 napos korig), részben az ACC-aktivitás fenntartása és az AMPK katalitikus α-alegység expressziójának csökkenése miatt (17), a rendelkezésre álló kamrai biopsziás minták hiánya mindenféle hipertrófia nélkül kizárta az ilyen hipertrófiát. Érdekes módon az AMPK foszforilációjának expressziója és mértéke nem különbözött önmagában a mérsékelt és a súlyos hipertrófia között, de a β-AMPK jelentősen csökkent, mivel az AMPK megfigyelt összmennyiségére normalizálódott. Ez arra utalhat, hogy a hipertrófia mértéke befolyásolhatja a foszforilációt és ezáltal az AMPK aktiválódását. A hipertrófia ezen hatását azonban körültekintően kell értelmezni, mivel ez a különbség, bár statisztikailag szignifikáns, nem lehet fiziológiailag releváns, mivel az össz- és foszforilált AMPK-ban az enyhe és a súlyos hipertrófia között bekövetkezett jelentős változásokból adódik (3. táblázat).

Tanulmányi korlátozások.

Összefoglalva, ez a tanulmány az MCD expressziójának életkorfüggő növekedését, valamint az ACC és AMPK expresszió életkorfüggő csökkenését mutatta be a jobb kamrai biopsziás mintákban, amelyeket műtéten átesett csecsemőktől kaptak a különböző veleszületett szívhibák korrigálása céljából. Mivel az ACC és az AMPK foszforilációjában nem voltak életkorral összefüggő változások, ez arra utal, hogy az expresszió szintje, nem pedig az aktivitás, fontos szabályozója lehet a zsírsav oxidáció érésének az újszülött emberi szívben, változó fokú hipertrófia jelenlétében.,