méregtelenítését

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • A koffein lebomlása H. hampei
  • A mikrobiom biogeográfiai elemzése H. hampei
  • Koffeint lebontó baktériumok a bélben H. hampei
  • Oxigén profilok a belekben H. hampei
  • A koffein bomlásának helyreállítása H. hampei
  • vita
  • mód
  • Rovarminták
  • DNS-extrakció, PCR-amplifikáció és nagy áteresztőképességű szekvenálás
  • A 16S rRNS gének elemzése
  • A koffeint lebontó baktériumok izolálása és azonosításuk
  • Génszűrés ndmA izolátumokban és H. hampei
  • O 2 mérések mikroelektródákkal
  • Diéta-átmeneti idő H. hampei
  • Antibiotikumos kezelés és újrafertőzés
  • Koffein kimutatása üreges mintákban
  • Az antibiotikumok hatása a szaporodásra H. hampei
  • növekményekkel
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • videók
  • Kiegészítő film 1
  • Excel fájlok
  • Kiegészítő információk 1
  • Hozzászólások

elemeket

  • rovartan
  • Mikrobiális ökológia
  • mikrobiom

absztrakt

A bogyós kávéfúró (Hypothenemus hampei) a világ legpusztítóbb rovarkártevője, amely megfertőzi a rovarokat és akár 80% -kal is csökkenti hozamukat. A koffein egy alkaloid, amely mérgező lehet a rovarokra, és úgy gondolják, hogy védekező mechanizmusként működik, amely gátolja a növényevő. Itt megmutatjuk, hogy a koffein lebomlik a H. hampei belében, és hogy a bél mikrobiota kísérleti inaktiválása kiküszöböli ezt a tevékenységet. Megmutatjuk, hogy a hét nagy kávétermelő országból és laboratóriumi nevelésű kolóniából származó H. hampei minták bélmikrobiotumai megegyeznek a mikroorganizmusok magjával. A bél mikrobiota globálisan mindenütt jelen lévő tagjai, köztük a kiemelkedő Pseudomonas fajok, egyedüli szén- és nitrogénforrásként a koffeinen élnek. A Pseudomonas koffein-demetiláz gének in vivo expresszálódnak a H. hampei belében, és az antibiotikummal kezelt rovarok újraoltása egy izolált Pseudomonas törzzsel visszaállítja a koffein lebontásának képességét, megerősítve kulcsfontosságú szerepüket.

Rovarokban, mint más állatokban, a koffein lebomlását a 20, 21 citokróm P450 enzimek katalizálhatják. Egyetlen másik metazoánról sem számoltak be, amely ellenállna a koffein koncentrációinak, amelyeknek a H. hampei ki van téve, ugyanakkor túléli és teljes életciklusát kizárólag zöld kávébabon teljesíti. Feltételeztük, hogy a H. hampei koffein lebomlását elsősorban a bél mikrobiotájának aktivitása közvetíti. Itt mutatjuk be a H. hampei mikrobiom első vizsgálatát és annak szerepét a rovarok koffein méregtelenítésében. A koffein átalakításához szükséges mikrobiális komponens felfedezésének és a H. hampei kávébabon való létezésének fontos következményei vannak e nagy kártevő anyagcseréjének és ökológiájának megértésében.

az eredmény

A koffein lebomlása H. hampei-ban

Annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy a koffein lebomlása mikrobiálisan közvetített folyamat H. hampei-ban, hét földrajzilag szétszórt kávétermelő régióból nyertünk mintákat: Kenya (Kiambu), Indonézia (Kelet-Jáva), India (Karnataka), Puerto Rico (Adjuntas), Hawaii (Kona), Guatemala (Coatepeque) és Mexikó (Chiapas). Az Indiából származó mintákban mindkét domináns Coffea fajból (C. arabica és C. canephora) vett mintákat vettek be. Laboratóriumban termesztett telepeket is használtunk, eredetileg a kolumbiai H. hampei populációból és három másik rákfajból, amelyek képtelenek kávébabon élni (H. crudiae, H. eruditus és Scolytodes maurus).

Először teszteltük a koffein lebomlását a rovar belében való áthaladás után, és megállapítottuk, hogy a bél mikrobiota felelős-e ezért a folyamatért. Ezt a hipotézist egy H. hampei kolónia alkalmazásával tesztelték egy kontrollált kísérletben tenyésztett laboratóriumban, olyan mesterséges étrendet alkalmazva (amelyet itt minimális étrendnek nevezünk), amely a C. arabica zöld kávébabot tartalmaz, 8 8,2-2,2 mg végső koffeinkoncentrációval. -1. A Hypothenemus hampei mintáit ezt az étrendet tartalmazó ampullákba vittük, amelyek tipikus unalmas aktivitást (1. kiegészítő film) és frakciótermelést mutattak. Az elfogyasztott élelmiszer mennyiségét és az élelmiszer tartózkodási idejét a H. hampei emésztőrendszerében fluoreszcens gömbmutatók beépítésével határoztuk meg az étrendben. A tartózkodási idő jellemzően 3 óra volt (1. kiegészítő ábra), és megfelelt a súlynak

Asztal teljes méretben

a ) A kontrollminta és az antibiotikumok koffein-koncentrációinak kísérleti tervezése és elemzése a H. hampei mintában. A H. hampei mikrobiom antibiotikum által közvetített kimerülése kiküszöböli a koffein átalakulását és növeli a koffein kiválasztását. b ) FTIR profilok a tiszta koffeinhez (fekete), a kontrollhoz (antibiotikummentes rovarok - piros) és az antibiotikummal kezelt rovarfragmenshez (zöld). A megjelenített profilok az összes mérés átlagát képviselik (n = 6).

Teljes méretű kép

A H. hampei mikrobiom biogeográfiai elemzése

A H. hampei bélbaktérium azon tagjainak azonosításához, amelyek hozzájárulhatnak a koffein lebomlásához, elemeztük a H. hampei mikrobaközösségek bakteriális összetételét, 16S rRNS gén szekvenálást használva a főbb kávétermelő régiók mintáiból (1. kiegészítő adat). A filogenetikai β-sokféleség és a hierarchikus csoportosítás megmutatta a mikrobák földrajzi eredet szerinti szétválasztását (4. ábra). Nemparametrikus permutációs többváltozós szórásanalízist alkalmaztunk a mikrobiális összetétel varianciájának elosztására a kulcsfontosságú tényezők között. A földrajzi elhelyezkedés magyarázta a baktériumösszetétel szórásának nagy részét (45%) (4. ábra). Azokon a helyeken, ahol a kávéfajták változtak (India; C. arabica és C. canephora), a kávéfajták a mikrobiális összetétel szórásának 78% -át tették ki. Noha a domináns mikrobiális taxonok földrajzilag is változtak, a hálózati elemzés kimutatta az összes helyen kimutatott organizmusok magját (2a. Ábra). Ezeket az organizmusokat többek között a Pseudomonadales, Enterobacteriales, Turicibacteriales, Rhizobiales, Alteromonadales, Actinomycetales sorozatokkal társították; mivel a pszeudomonadalisok nagyon sokak voltak az összes vett mintában (2b. ábra).

a ) A filogenetikai hálózat elemzése domináns baktériumcsoportokat mutat be, amelyek a hét fő kávétermelő ország H. hampei mintájához kapcsolódnak. A mexikói rovarok közé tartoztak a H. hampei-től eltérő fajú rovarok is. ◊, H. hampei, - S. maurus; A, H. crudiae; □, H. eruditus . b ) A Pseudomonas spp. Részvényei szekvenciák az összegyűjtött minták mikrobiomjában.

Teljes méretű kép

Koffeint lebontó baktériumok a H. hampei belében

a ) Koffeingradiens lemez, amely a H. hampei gyomor-bél traktusából izolált baktériumtelepeket és azonosságukat filogenetikai elemzésekkel határozza meg. A kapott izolátumok fő csoportja a P. fulva volt . b ) Filogenetikai fa a koffein-alfa-demetiláz (NdmA) alfa-alegység-szekvenciáihoz, amelyeket izolált baktériumokból (sárga) és a H. hampei (zöld) mezei mintáiból kivont RNS-ből nyertek. c ) Négy hetes, korábban antibiotikumokkal kezelt H. hampei mintákat oltottunk be P. fulva-val annak érdekében, hogy helyreállítsuk a koffein lebontásának képességét, amint azt a koffein FTIR és GC-MS frakcióikban végzett mérése bizonyítja (lásd 1. táblázat).

Teljes méretű kép

Oxigénprofilok a H. hampei belében

Az oxigéngradienseket a H. hampei belében mikroelektródák alkalmazásával mértük. Valamennyi mérést a bogár elülső felében végeztük (lásd 1. kiegészítő ábra). Ezen eljárások során az elektróda hegyét a bélfal felszínére hoztuk, és addig tartottuk a helyzetben, amíg a mért O2-koncentrációk stabilizálódtak. Minden esetben, amikor a hegy behatolt a bélfalba, az oxigénkoncentráció meredek gradiensekkel csökkent a mikroaerofil állapotoktól a redukált anaerob magig (4. ábra).

Az ábra a bogarak három belének oxigénprofilját mutatja. Vegye figyelembe az átmenetet a mikroaerofil régióból az anaerob magba az elülső középső bél lumenében (lásd a 1. kiegészítő ábrát).

Teljes méretű kép

A koffein lebomlásának helyreállítása H. hampei-ban

Az antibiotikumokkal kezelt H. hampei laboratóriumi mintákat először 1 héten keresztül táplálták minimális étrendben, amely P. fulva-t tartalmazott. A rovarokat ezután frissen elkészített, steril, minimális étrendbe helyezték, és 4 órán át hagyták táplálkozni, mielőtt a frakció összegyűlt volna, és a koffein koncentrációkat meghatározták. A GC-MS és az FTIR analízis a koffeintartalom majdnem teljes kimerülését mutatta az újrafertőzött rovarfrakcióban (3c. Ábra, 1. táblázat). Az antibiotikumokkal és a P. fulva-val kezelt rovarok reproduktív képességét is tesztelték. A rovarok a P. fulva-oltás után nem állították helyre szaporodási képességüket (3. kiegészítő ábra).

vita

Bár más rovarokat néha kávémaggal tápláltak 24, a H. hampei az egyetlen olyan rovar, amely kizárólag a 16, 25 bogyókban található kávébabok táplálására és az egész életciklus befejezésére szakosodott. Az ebben a környezetben való túlélés során H. hampei krónikus expozíciónak van kitéve a toxikus 3, 5, 7, 9, 10 alkaloid néven ismert koffein hatására, így ez a rovar vonzó modellrendszerré válik, amelyben felmérhető a mikrobák szerepe az állatok alkalmazkodásában szokatlan környezetbe. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a koffein lebomlását a H. hampei-ban közvetíti-e a rovarok bélmikrobiotája.

A H. hampei bélmikrobiota tagjait hét kávétermelő országból és laboratóriumi telepről gyűjtött rovarokból azonosították. A β-diverzitás eloszlás és variancia számított elemzése azt mutatta, hogy a H. hampei mikrobiom összetétele szignifikánsan összefüggésben állt a kávé földrajzi eredetével, valamint a kávé típusaival, ahol azok változtak (lásd 1. Kiegészítő adatok). A morfokriptikus egységek képződését korábban kimutatták a különböző kávétermelő országokból vett H. hampei mintákban mikroszatellit markerek és COI 30 génszekvenciák elemzésével. Ezek a jelentett "fajkomplexumok", valamint a H. hampei mikrobaközösségek földrajzi variációinak megállapításaival együtt jelezhetik a rovarok és mikrobáik együttes evolúcióját. A koffeintartalom jelentősen változik az értékelt kávéfajok között 31, és bár itt még nem tesztelték, a koffeinkoncentráció a H. hampei bélmikrobómák összetételét befolyásoló másik fontos tényező lehet.

A P. fulva in vivo koffeinbontásban betöltött szerepének megerősítésére antibiotikummal kezelt laboratóriumi mintákat újból megfertőztek P. fulva-val. Ezután a rovarokat steril minimális táplálékkal etették és frakcióikat koffein mennyiségi meghatározás céljából összegyűjtötték. Ez bebizonyította, hogy a P. fulva újbóli beoltása visszaállította a H. hampei képességét a koffein lebontására (3c. Ábra, 1. táblázat), megerősítve ezzel a bélmikrobiota ezen tagjának fontosságát a koffein-méregtelenítés folyamatában. Annak tesztelésére, hogy a P. fulva önmagában segítheti-e a H. hampei-t reprodukciós alkalmasságának regenerálásában, az antibiotikummal kezelt rovarok egy harmadik csoportját beoltják P. fulva-val és felhasználják az alkalmasság értékelésére. A rovar azonban az oltás után sem nyerte vissza szaporodási képességét. A szaporodáshoz hasonlóan bonyolult folyamat megkövetelheti a rovarok megfelelő táplálkozási állapotát, amely részben a társult mikrobák metabolikus aktivitására támaszkodik, vagy más bakteriális endoszimbólumok jelenlétét igényelheti, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a reproduktív egészséget 34. A további kutatások fontos témája a minimális mikroorganizmus-készlet meghatározása a reproduktív erőnlét helyreállítása érdekében, valamint a különböző koffein-koncentrációjú kávéfajok H. hampei-hoz társuló mikrobaközösségekre gyakorolt ​​hatásának összehasonlítása.

Itt bemutatjuk, hogy a H. hampei, a kávétermelő országok legpusztítóbb kártevője közös bélmikrobiota maggal rendelkezik, amely megoszlik a különböző földrajzi területekről származó egyedek között, és hogy ezen szervezetek közül sok létezhet a koffeinben, mint egyetlen forrásukban. szén és nitrogén. Kimutattuk azt is, hogy a H. hampei microbiota felelős a koffein lebontásáért a rovarok emésztőrendszerében. A mikrobiális közösségek fontos szerepet játszanak minden ökoszisztémában, a talaj tápanyag-ciklusában való részvételtől kezdve az emberi immunrendszer kialakulásáig 35, 36, 37 A bélmikrobiota szerepének bemutatása a H. hampei koffein méregtelenítésében fontos következményekkel jár e fontos kávé-kártevő anyagcseréjének és ökológiájának megértésében. Ez új lehetőségeket kínál a biokontroll stratégiák kidolgozására is, ahol a mikrobiom új célt jelent, mivel a társult mikroorganizmusok szerepe a gazda javult túlélési és uralkodási képességében egy ellenséges környezetben.

mód

Rovarminták

H. hampei mintákat (n = 68; további 1. adat) Kenyából (Kiambu), Indonéziából (Kelet-Jáva), Indiából (Karnataka), Puerto Ricóból (Adjuntas), Hawaii-ról (Kona), Guatemaláról (Coatepeque) és Mexikóról ( Chiapas További információk 1). Az indiai rovarokat C. arabica és robusta hibridből (C. congensis × C. canephora) gyűjtötték. A H. obscurus, a H. crudiae és a S. maurus a mexikói Chiapas-ból származó Cecropia levéltörzsekből származik. A biogeográfiai vizsgálat és összehasonlítás céljából a mesterséges élelmiszer-termesztésű kávés bogyókat 38 (laboratóriumi rovarok) is bevonták. Az összes gyűjtőhelyen az egyes rovarokat életben helyeztük RNAlater tartalmú csövekbe (Ambion, Grand Island, NY, USA), és laboratóriumba küldtük elemzés céljából.

DNS-extrakció, PCR-amplifikáció és nagy áteresztőképességű szekvenálás

A 16S rRNS gének elemzése

A koffeint lebontó baktériumok izolálása és azonosításuk

Az ndmA gén szűrése izolátumokban és H. hampei

O 2 mérések mikroelektródákkal

Diéta-átmeneti idő H. hampei-ban

Antibiotikumos kezelés és újrafertőzés

Koffein kimutatása üreges mintákban

Két stratégiát alkalmaztak a koffein koncentrációjának meghatározására az antibiotikummal kezelt, antibiotikummal fertőzött bogarak és a kontroll bogarak mintáiban: a koffein mérése nyers forgácsban FTIR segítségével és a faaprítékból kivont koffein mérése GC-MS-sel,

Az FTIR és a GC-MS elemzésekhez a kezelések (kontroll, antibiotikumokkal kezelt és antibiotikumokkal kezelt/újra beoltott) közötti szignifikáns különbségeket egyirányú varianciaanalízissel és a legkisebb szignifikáns különbségekkel határoztuk meg az R 53 szoftveres környezet alkalmazásával. .

Az antibiotikumok hatása a H. hampei szaporodására

Száz nőstény jelent meg nemrégiben, amikor a felnőtteket 20 hímmel rendszeres étrendet tartalmazó ampullákba helyezték, és 14 napig inkubálták a párzás maximalizálása érdekében. A kezdeti párzási inkubáció után az egyes nőket egy rendszeres étrendet (kontroll) vagy antibiotikumokkal kiegészített étrendet tartalmazó injekciós üvegbe (a fent leírtak szerint) helyeztük, és 44 napig inkubáltuk. A párosodott nőstények harmadik csoportját 3 hétig antibiotikumokkal kezelték, P. fulva-val diétázták, és szintén 44 napig inkubálták. Az egyes kezelésekből tizenöt fiolát destruktív módon gyűjtöttünk minden mintavételi időpontban (14., 24., 34. és 44. nap), és megvizsgáltuk tojásokat, lárvákat, bábokat és felnőtteket. Logikai regressziót hajtottunk végre az egyes fiolák összes fázisának összegén. Ezután a modell csak a fő hatásokkal volt megfelelő (DIET - kontroll, antibiotikumok, fertőzés és MINTA - mintavételi idő), ahol a túlzott diszperzió szerepelt. Mindkét fő hatás szignifikáns volt, vagyis a kontrollhoz képest jelentős a DIET hatása, és a minta jelentős hatása is van (a későbbi mintáknak nagyobb volt a száma).