elemeket

absztrakt

Az emberi táplálékban a túlsúlyban lévő telített zsírsavak (SFA) a laurinsav (LA, C12: 0), a mirisztinsav (MA, C14: 0), a palmitinsav (PA, C16: 0) és a sztearinsav (SA, C18: 0). ). ). A vizsgálat célja annak meghatározása volt, hogy az egyedi SFA-ket tartalmazó étrendek az egyszerű szénhidrátok feleslegével együtt indukálják-e a térdízületek osteoarthritisében (OA) és a metabolikus szindróma tüneteiben patkányokban. A patkányokat vagy kukoricakeményítő-étrenddel, vagy egyszerű szénhidrát-diétával etették 20% LA, MA, PA, SA vagy szarvasmarha faggyúval 16 hétig. A szarvasmarhafaggyúval, SA, MA vagy PA táplálékkal etetett patkányok metabolikus szindróma jeleit mutatták, valamint porcbontást és OA-szerű subchondralis csontváltozásokat mutattak. Ezzel szemben az LA marhafaggyú pótlása csökkentette a metabolikus szindróma tüneteit, a csökkent porcromlás mellett. Ezenkívül a PA és az SA, de az LA nem, növeli a mátrix-szulfatált proteoglikánok felszabadulását szarvasmarha-porc explantánsok vagy emberi kondrociták tenyészeteiben. Összefoglalva, megmutattuk, hogy a hosszabb láncú étrendi SFA-k patkányokban metabolikus szindrómát és térdelváltozásokat idéznek elő, hasonlóan az OA-hoz. Így az SFA-tartalmú étrend mind az OA, mind a metabolikus szindróma kialakulásában vagy megelőzésében nagyon fontos.

Az elhízás a zsír túlzott raktározása a szervezetben, amely a metabolikus szindróma, a magas vérnyomás, a cukorbetegség, a diszlipidémia és a zsírmáj betegségének fő alkotóeleme, ami növeli a szív- és érrendszeri betegségek kockázatát 11. Bár általánosan elfogadott tény, hogy az SFA mint csoport elősegíti a hasi elhízást, a diszlipidémiát, az inzulinrezisztenciát, a csökkent glükóz toleranciát és a szisztémás gyulladást 12, az SFA ezen szerepe az elhízásban, a cukorbetegségben és a szív- és érrendszeri megbetegedésekben most megkérdőjelezhető. A legújabb tanulmányok azt sugallják, hogy az SFA által kiváltott válaszok lánchossztól függenek, a laurinsav és a palmitinsav közötti biológiai válaszokban egyértelmű különbségek vannak 13. Az egyes étrendi SFA-k szerepét azonban az OA-ban nem határozták meg egyértelműen.

Korábbi tanulmányaink arról számoltak be, hogy a fiatal hím Wistar patkányokban 16 héten át tartó magas szénhidráttartalmú, magas zsírtartalmú étrend (H, főleg fruktózt és szarvasmarha faggyút tartalmaz) utánozza az emberi metabolikus szindróma tüneteit, beleértve a hasi elhízást, a megnövekedett össztömeget és megnövekedett plazma. lipidek és vérnyomás, csökkent glükóz tolerancia és inzulinérzékenység, zsírmáj és kardiovaszkuláris átalakulás 14. Ez a tanulmány a C12-C18 SFA (laurinsav (LA; C12: 0), mirisztinsav (MA; C14: 0), palmitinsav (PA; C16: 0) és sztearinsav (SA; C18: 0) szerepét vizsgálta., valamint marhafaggyú (főleg SA és transz-zsírsavak) a metabolikus szindróma tünetei és az OA kialakulása érdekében is.

az eredmény

SFA metabolikus szindróma esetén

A magas szénhidráttartalmú étrenddel táplált patkányok, mind a telített, mind a transz-zsírokat tartalmazó faggyúval (H étrend) az emberi metabolikus szindrómához kapcsolódó változások alakultak ki, beleértve a hasi elhízást, a hiperleptinémiát, a hiperlipidémiát és a májműködési zavarokat, a kukorica diétához képest. (C diéta). Az 1. ábra szerint azonban a H patkányok nem mutattak hiperglikémiát és hiperinsulinémiát a C patkányokhoz képest. A C étrend alacsony energiasűrűségű, és valószínűleg emiatt a C-patkányoknál az élelmiszer-bevitel magasabb volt, mint az összes többi csoportnál. Bár a C patkányoknál nagyobb volt a táplálékfelvétel, az összes magas zsírtartalmú csoportban nagyobb volt az energiafogyasztás, mint a C patkányokban (HLA = H)

osteoarthritis

( A ) A térdízületek szövettani értékelése. Az összes képet 20x-os nagyítással kaptuk (n = 8 csoportonként), ami a mediális tibialis fennsíkot képviseli. A Safranin O/Fast Green festés jelzi a proteoglikán veszteség mértékét a különböző étrendi csoportok között. Reprezentatív immunhisztokémiai festés mutatja az ACAN, MMP13, COL10 pozitív sejtek számát a különböző étrendi csoportok között. A különböző étrendek közötti apoptotikus kondrociták elemzését a TUNEL assay (DAPI és TUNEL képek bemutatásával) segítségével számszerűsítettük. Az ízületi porc szakaszonkénti TUNEL-pozitív sejtek számát fluoreszcens mikroszkóppal határoztuk meg. Minden immunfestéshez negatív kontrollt vontunk be vagy az elsődleges antitest nélkül, vagy az elsődleges antitest helyett egy izotípushoz illesztett IgG-vel. ( B ) Az ízületi porc degradációjának súlyosságát Mankin pontozási rendszer alkalmazásával értékeltük. ( C ) Kvantitatív hisztomorfometriai elemzések. A porcban lévő 100 sejtre jutó összes pozitív sejtet ImageJ (NIH, Bethesda, MD) alkalmazásával számoltuk meg. Valamennyi értéket átlag ± SD-ben fejezzük ki. A skála 100 μm. (P

( A ) A patkányok teljes térdízületeinek 3D-s képe és a rekonstruált axiális keresztmetszeti képek a vizsgált régió mikro-CT CT-jéről (inzert), azaz a medialis és laterális tibialis platóról, amely megváltozott subchondralis csontépítészetet mutat (a sárga nyilak rendelleneset jeleznek) csont) morfológiai változások). Morfometriai elemzésekhez ( B ) a csonttérfogat-frakciót (BV/TV) a szegmentált csonttérfogat (BV) és a kérdéses régió teljes térfogatának (TV) arányaként számítottuk ki. Amellett ( C ), a kérdéses régió csontásványi sűrűségét (BMD) is kiszámítottuk. Valamennyi értéket átlag ± SD (P

( A ) EGY DOBOZ, ( B COL10A, ( C ) MMP13, ( D ADAMTS4, ( E ADAMTS5 a ( F A RUNX2 mRNS szintjét RT-PCR-rel értékeltük mind IL-1β-vel kezelt, mind IL-1β-vel kezelt pelleteknél. Az összes kísérleti mintát három példányban hajtottuk végre. Valamennyi értéket átlag ± SD (P

( A ) A szafranin O/Fast Green festése szarvasmarha szarvasmarha-szarvasmarha-explantánsokból mutatja a proteoglikánok elvesztését a különféle táplálkozási csoportokban mind az IL-1β-vel nem kezelt, mind az IL-1β-vel kezelt explantánsokban. ( B ) A felülúszóban az sGAG-felszabadulás mennyiségi meghatározását DMB-esszével végeztük, amely azt mutatta, hogy a PA- és SA-kezelt explantánsok mind a 3., mind a 7. napon megnövelték az sGAG-felszabadulást a táptalajba más étrendcsoportokhoz képest. Ezenkívül az sGAG kimerülési zónája ( C ) a porc explantánsokban az SA-val kezelt explantánsokban volt a legmagasabb, az IL-1β kezeléstől függetlenül (P 16. Az OA előfordulása szintén jelentősen megnőtt egy hasonló időszak alatt 17, ami jól dokumentáltan alátámasztotta azt az elképzelést, hogy az elhízás módosítható. Az elhízás és az OA prevalenciája a 65 év feletti betegeknél a legmagasabb, a világ népességének egyre növekvő része, és mivel az elhízás és az OA egyaránt csökkenti a mobilitást és növeli a kardiovaszkuláris kockázatot, a fogyás és a testmozgás az elhízott, OA-ban szenvedő betegek kezelésének kulcsfontosságú elemei 18. Ezért az elhízás és az OA közös mediátorainak megértése egyértelműen releváns az elhízással kapcsolatos OA reális és fenntartható kezelési lehetőségeinek biztosításához.

A vizsgálat korlátai közé tartozik, hogy nem mértük a szinoviális morfológiai változásokat vagy a szinoviális folyadék citokin koncentrációjának változását. Ez a két további paraméter hozzájárulhat a gyulladás okozta helyi változások megértéséhez az SFA étrendben, és ezáltal javíthatja az elhízás által kiváltott OA megértését.

Összefoglalva, ez a tanulmány bizonyítékot szolgáltat arra vonatkozóan, hogy az SFA hasonló változásokat indukálhat az OA metabolikus szindrómájában. Ezek a változások korrelálnak a leptin és az inzulin plazmakoncentrációival, amelyek elhízáshoz, 2-es típusú cukorbetegséghez és OA-hoz kapcsolódnak. Adataink arra utalnak, hogy a kókuszdió PA-ból származó LA-t tartalmazó hagyományos étrend pálmaolajból származó PA-val vagy állati zsírból származó PA-val való helyettesítése mind a metabolikus szindróma, mind az OA kialakulását súlyosbíthatja. Emellett humán klinikai vizsgálatokra van szükség annak megállapításához, hogy a PA és az SA pótlása az LA étrendben elnyomja-e vagy megfordítja-e mind az OA, mind a metabolikus szindróma, különösen az elhízás és a magas vérnyomás kialakulását.

mód

Tanulmány és étrend kialakítása

Metabolikus változók mérése

A patkányok napi egészségi állapotának figyelemmel kísérése érdekében napi méréseket végeztek a testtömegről, valamint a táplálék és a víz beviteléről. A takarmány-konverzió hatékonyságát (%) a fent leírtak szerint számítottuk 14. A 16 héten át eső százalékos súlygyarapodást a 0. és a 112. nap közötti testtömeg-különbségként számoltuk ki. A hasi kerületet 4 hetente mértük egy szokásos mérőszalaggal, könnyű altatásban, Zoletil alkalmazásával (tiletamin 10 mg/kg, zolazepam 10 mg/kg). kg ip). Virbac, Peakhurst, NSW, Ausztrália).

Orális glükóz tolerancia teszteket végeztek patkányokon a fent leírtak szerint. Röviden: a patkányoktól 12 órán át elfogyasztották az ételt, mielőtt a vércukorszint-mérés megkezdődött, majd ezt követően szájon át 40% -os vizes glükózoldattal és ismét 30, 60, 90 és 120 perc múlva végzett glükózkoncentrációval végezzük az AUC-értéket mérések. A szisztolés vérnyomást 4 hetente mértük könnyű szedációval Zoletil-lel (10 mg/kg tiletamin, 10 mg/kg zolazepam, ip) 14. Echokardiográfiát végeztek a kardiovaszkuláris szerkezet és működés mérésére14. Indirekt kalorimetriát alkalmaztunk az oxigénfogyasztás és a szén-dioxid-termelés mérésére egy négykamrás Oxymax rendszer (Columbus Instruments, Columbus, OH) alkalmazásával, kamránként egy patkányonként. A mérés során patkányok ad libitum hozzáférést kaptak az élelemhez és a vízhez. Az oxigén (VO 2) fogyasztást és a szén-dioxid (V CO 2) termelést minden kamrából külön-külön mértük. A légzési cserearányt (RER = V CO2/VO2) az Oxymax szoftverrel számoltuk ki (4.86 v.). A szénhidrátok oxidációja 1,00 RER-t eredményez, míg a zsírsavak oxidációja körülbelül 0,70 RER-értéket eredményez 38. Az energiafelhasználást az élelmiszer metabolikus feldolgozása során bekövetkező oxigén széndioxiddá történő cseréjének értékelése alapján számították ki.

A patkányokat 16 hét után leöltük Lethabarb® (100 mg/kg nátrium-pentobarbiton, ip) alkalmazásával. Az eutanázia után a vért összegyűjtöttük a plazma izolálásához, és a plazmát -20 ° C-on tároltuk a további elemzés előtt Szíveket izoláltunk, hogy Langendorff szívét felkészítsük a diasztolés merevség konstans mérésére 14. Ezt követően a szöveteket, például a májat, a bal kamrát (szeptommal), a jobb kamrát és a hasi zsírpárnákat (beleértve a retroperitoneális, epididymális és omentális elemeket) eltávolítottuk mérés céljából, és mg/mm tibialis hosszúságban fejeztük ki. A leptin, az inzulin, az összes koleszterin, a trigliceridek és a nem észterezett zsírsavak (NEFA) plazmakoncentrációit a fent leírtak szerint mértük.

Az ízületi porc értékelése

TUNEL apoptózis teszt

A terminális dezoxinukleotidil-transzferázt (TdT) dUTP Nick-End jelöléssel (TUNEL) alkalmaztuk azon sejtek azonosítására, amelyek DNS -ük apoptózis alatt történő lebomlását mutatják. A szöveti metszeteket először proteináz K-val 30 percig 37 ° C-on permeabilizáltuk. A tárgylemezeket ezután PBS-sel mostuk, és a vizsgálatot a gyártó (Roche, Németország) protokolljának megfelelően végeztük. A metszeteket pozitív kontrollként 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk DNase-sel. A félkvantitatív adatok elemzéséhez a különböző megfigyelési területekről származó pozitív sejteket megszámoltuk, és az ImageJ (NIH, Bethesda, MD) alkalmazásával minden csoport 100 sejtjére jutó sejtek számára normalizáltuk. .

A subchondralis csontelváltozások értékelése

A subchondralis csontelváltozások elemzésére mikro-CT-t végeztünk. A combcsontot és a sípcsontot mikro-CT-vel (Scanco μCT 40, Scanco Medical, Svájc) vizsgáltuk 18 μm izotróp voxelmérettel 55 kV feszültséggel és 145 μA árammal, 0,5 mm alumínium szűrővel. Az expozíciós idő 1180 ms volt, és a beépített Scanco szoftvert használták az adatfájl szegmentálására 39. Manuális érdeklődésre számot tartó régiókat (ROI) rajzoltunk az anatómiai kontúr köré a subchondralis csont régióban a mediális és laterális tibialis fennsíkon. Az érdekes volumen (VOI) egy ROI-ból állt (25 keresztmetszet). A VOI a subchondralis lemez alatt kezdődött, amely distalisan a növekedési lemez felé nyúlt. Számítsa ki a VOI csontmennyiségének és teljes térfogatának (BV/TV) és csontásványi sűrűségének (BMD) arányát.

Az oszteociták elemzése

Az átlagos üres osteocyta-laktont (Avg OS.L) és az átlagos osteocyta-magot (Avg OS.N) egységnyi területre (mm 2) számoltuk a mediális tibialis fennsík subchondralis csontterületén ImageJ (NIH, Bethesda, MD) alkalmazásával.

A kondrociták és a porc explantánsok kezelése SFA-val

Az SFA elkészítése

LA-t, MA-t, PA-t és SA-t a lehető legnagyobb tisztasággal (Sigma-Aldrich, GC-vel tisztított, kémiailag szintetizált) vásárolták meg kereskedelemben. Vivőanyagként a szarvasmarha szérum albumint (BSA) (zsírsavmentes, Sigma Aldrich) választottuk. Az SFA-BSA komplex oldatokat a fent leírt protokoll alkalmazásával készítettük 6. Az egyes SFA-kat 100% etanolban oldjuk 70 ° C-on, így 200 mM törzsoldatot kapunk. A törzsoldatot ezután 1: 10 arányban hígítottuk 10% (w/v) BSA-val, amelyet Dulbecco módosított Eagle táptalajával (DMEM) készítettünk 10 percig 55 ° C-on. tenyészetek (0, 45 μM szűrő) a fent leírt protokoll alkalmazásával 6. A kontroll hordozó (negatív kontroll) zsírsav nélküli BSA volt, azonos etanolkoncentrációval.

Kondrocita pellet és szarvasmarha explant tenyészet

A kondrocitákat enzimatikus emésztéssel gyűjtöttük össze és tenyésztettük közzétett protokolljaink 39 felhasználásával. Röviden, az ízületi porc biopsziáit olyan primer OA-betegekből nyertük, akik térdprotézis műtéten esnek át a Prince Charles Kórházban (Brisbane, QLD, Ausztrália). Az összes porcbiopsziát a combcsont felszínének egy részéből vették, amelyet a sebész úgy vél, hogy ép és egészséges porcra hasonlít. Az öt donor 60–65 éves férfi volt, és írásos beleegyezésüket adták. A tanulmányt a Prince Charles Kórház és a Queenslandi Műszaki Egyetem Humánetikai Bizottsága hagyta jóvá. Mindegyik porcmintát tovább jellemeztük és pontoztuk Mankin-pontszám szerint, további kísérletekhez csak 0–1 (egészséges porc) pontszámú mintákat használtunk.

A porcot boncoltuk a csontból, és egy éjszakán át emésztettük kollagenáz 2 oldattal (Invitrogen, Lakewood, NJ) DMEM táptalajban az izületi porc kondrociták (ACC) izolálása céljából. Az emésztést követően az ACC-ket (2,5x105 sejt) centrifugálással 15 ml Falcon csövekben pelletáltuk, és háromdimenziós (3D) pellettenyésztő rendszerben 39 14 napig kondrogén táptalajban tenyésztettük különböző SFA jelenlétében vagy hiányában.

A szarvasmarha-explantatív vizsgálatokhoz friss felnőtt szarvasmarha-térdízületeket (n = 3) nyertek a vágás napján. Ezután teljes vastagságú ízületi porc explantátumokat szedtek a subchondralis csont nélkül a térdízületekből. Ezután a porckorongokat aszeptikusan boncoltuk 4 mm-es dermális lyukasztóval. A lemezeket DMEM-ben tenyésztettük, és kiegészítettük 10% -os szarvasmarha-magzati szérummal (FBS) és antibiotikumokkal 37 ° C-on, 5% CO 2 -val 48 órán keresztül.

A pelleteket és a korongokat ezután minden egyes SFA-val stimuláltuk (végső koncentráció: 30 μg/ml, MTT assay-ből származtatva - az adatok nem láthatók). A negatív kontrollt, amelyhez SFA-t nem adtunk, csak BSA hordozóval kezeltünk. Az SFA és a gyulladásos citokinek hatásainak tanulmányozásához néhány ACC-pelletet és szarvasmarha-porckorongot IL-1β-val (10 ng/ml) kezeltünk különböző SFA jelenlétében vagy hiányában. A 3. és a 7. nap után a táptalajokat összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk a szulfatált glikozaminoglikánok mennyiségi meghatározása céljából. A porckorongokat és az ACC-pelleteket később szövettani elemzéshez és kvantitatív valós idejű PCR-analízishez (qPCR) dolgoztuk fel. Az egyes SFA-kra adott válaszok további értékeléséhez különböző koncentrációjú (10 μM, 30 μM, 60 μM és 90 μM) PA és SA koncentrációkat adtak a kondrocita pelletekhez IL-1β (10 ng/ml) hiányában és jelenlétében. ). A 3. és a 7. nap után a táptalajokat összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk a szulfatált glikozaminoglikánok (sGAG) mennyiségi meghatározása céljából. Ezenkívül az ebben a vizsgálatban alkalmazott IL-1β hatásainak értékeléséhez a kondrocita pelleteket különféle IL-1β koncentrációkkal (1-10 ng/ml) kezeltük. A 3. és a 7. napos táptalajokat összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk az sGAG mennyiségi meghatározása céljából.

Szulfatált glikozaminoglikánok (sGAG) vizsgálata

Az sGAG-felszabadulás mérése céljából felülúszókat gyűjtöttünk a szarvasmarha-porckorongokat vagy kondrocita-pelleteket tartalmazó üregekből, amelyeket SFA-val vagy anélkül kezeltünk a 3. és a 7. napon. Biocolor Ltd) a gyártó utasításainak betartásával. A porc explantánsokban az sGAG kimerülésének zónáját a Safranin O festés képeivel határoztuk meg, és ImageJ (NIH, Bethesda, MD) alkalmazásával mértük.

RNS extrakció és valós idejű PCR

Az összes RNS-t TRIzol-reagens (Invitrogen) alkalmazásával extraháltuk, DNase-sel kezeltük és a gyártó protokolljának megfelelően RNeasy Mini Kit (Qiagen) alkalmazásával tisztítottuk. A teljes RNS 1 μg-jából cDNS-t szintetizáltunk a gyártó protokolljának megfelelően, SensiFAST cDNS szintézis készlet segítségével. Valós idejű kvantitatív PCR 41-et SYBR Green detektálási kémia alkalmazásával az ABI 7500 Fast Real Time PCR rendszeren (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) végeztünk. Az összes valós idejű PCR-termék olvadásgörbe-elemzését elvégeztük, és kimutattuk, hogy egyetlen DNS-duplexet állítunk elő. Valamennyi mintát három példányban mértük, és az összes kísérleti minta átlagértékét figyelembe vettük az összehasonlító elemzéshez. Az ebben a vizsgálatban használt összes primer kvantitatív mérését a (2 -ΔΔ Ct) módszerrel határoztuk meg, belső kontrollként pedig 18 s és β-aktin expressziót alkalmaztunk, amint azt 39., 41., 42., 43. csoportunk korábban leírta. .

statisztika

A statisztikai elemzéseket a Graphpad Prism alkalmazásával végeztük. Az adatokat az összes változó átlag ± standard deviációjaként (SD) mutatjuk be, és ANOVA módszerrel elemezzük. A statisztikai szignifikancia értékeléséhez ismételt mértékű varianciaanalízist alkalmaztunk post hoc tesztekkel (Dunnett's/Bonferroni). A szignifikancia szintjét P-re állítottuk