- elemeket
- absztrakt
- A fő
- Anyagok és metódusok
- Méhnyálkahártya szövetminták és betegek
- RNS extrakció
- Valós idejű reverz transzkripció és kvantitatív PCR
- A PTEN expresszióvesztés immunhisztokémiai elemzése
- Statisztikai analízis
- az eredmény
- MikroRNS expresszió klinikai mintákban
- Az endometrium rák biomarkerként optimalizált MicroRNS-panelje
- PTEN státusz az endometrium szövetmintáiban és összefüggés a mikroRNS expresszióval
- vita
elemeket
- Endometrium rák
- Gén expresszió
- miRNS
absztrakt
Megvizsgáltuk a gyakran deregulált mikroRNS-ek (miRNS-ek) és az enodometrikus patológia közötti kapcsolatot annak érdekében, hogy megtaláljuk a legmegbízhatóbb miRNS-eket vagy miRNS-kombinációkat a normál, hiperplasztikus és rosszindulatú endometrium szövetek azonosítására. Megvizsgáltuk ezen miRNS-ek és a PTEN státusz közötti kapcsolatot is. Mértük hat miRNS (miR-21, 182, 183, 200a, 200c és 205) expresszióját 75 normál rögzített, paraffinos normál, hiperplasztikus és rosszindulatú endometrium szövetblokkban Taqman-alapú valós idejű PCR vizsgálatokkal. A PTEN expresszió elvesztését ugyanazokban az endometrium szövetekben értékeltük immunhisztokémiai módszerrel. Öt miRNS expressziója (miR-182, 183, 200a, 200c és 205) szignifikánsan magasabb volt az endometrium carcinomában (CA), összehasonlítva a komplex atipikus hiperpláziával (CAH), az egyszerű hiperpláziával (SH) és a normál endometrium szövetével (P 1 a National Registry 2., 3. daganata, az endometrium rák előfordulása Koreában is jelentősen megnőtt 1991 és 2005 között.
A klinikopatológiai és epidemiológiai vizsgálatok alátámasztják az endometrium hiperplázia malignus potenciálját és a proliferatív mirigyelváltozások folytonosságának koncepcióját, amelyek egyes esetekben CA-val tetőznek. 4 Ezen precancerózus elváltozások pontos diagnosztizálása és kezelése ugyanolyan fontos az endometrium rákos megbetegedéseinél, mint a méhnyakrákoknál. Az endometrium hiperpláziájának osztályozása azonban nem optimális, például curettage mintavételi hibák és a WHO szubjektív osztályozása. Az ilyen rák előtti endometrium hiperplázia diagnózisa, különösen a citológiai atypia kritériumai, amelyek a CA, 6, 7, 8 progresszió jelentősen megnövekedett kockázatát jelentik, nagyon szubjektív a patológusok körében, és a legtöbb esetben alacsony reprodukálhatóságot mutat az interszerverek között 5, 7 Az eredmények megakadályozzák az endometrium hyperplasia WHO szerinti osztályozását, hogy hatékonyan irányítsák a betegek klinikai kezelését és kezelését. 5.
A mikroRNS-ek kicsi, nem kódoló RNS-ek, amelyek részt vesznek a tumor fejlődésében. Vagy a mRNS lebontásával, vagy a transzlációs represszióval szabályozzák a célgén expresszióját. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 Minden mikroRNS (miRNS) általában akár több száz célgént képes szabályozni. 9., 17. A daganat fejlődése során az aberrált miRNS expresszió vagy inaktiválhatja a tumor szuppresszor génjeit, vagy aktiválhatja a 10., 11., 12., 14., 15., 16., 18. onkogéneket, ezáltal elősegítve a tumor kialakulását. 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18 Mivel a miRNS expresszió szövetspecifikus, 10 kimutatható a vérben 19 és korrelál a rákkal kapcsolatos klinikai viselkedéssel, 20 miRNS potenciálisan értékes biomarker.
Egészen a közelmúltig számos tanulmány kimutatta az uregulált vagy az alulszabályozott miRNS-eket az endometrium szövetmintáiban. A globális profilalkotás 21., 22., 23., 24., 25., 26., 27., 28., 29. módszerét vagy a miRNS jelölt 30., 31., 32., 33., 34., 35., 36. megközelítését alkalmazták, és kimutatták, hogy az aberrált miRNS expresszió összefügg a tumor szövettana, a 26., 27., 28. reakcióba lépve a 24. szteroid terápiával vagy a kemoterápiával 29. és túlélve. 21, 22, 25 A legtöbb vizsgálat azonban meghatározta a miRNS expresszióját a normál méhnyálkahártya vagy a rák szövetében, és az esetleges miRNS expresszió az endometrium hiperpláziájában nagyrészt ismeretlen.
A PTEN-ek mutációit a hiperpláziák több mint 20% -ában találták, atipiával vagy anélkül, és az endometrium CA-k 30-80% -ában, ami arra utal, hogy a PTEN-változások az endogén tumorigenesis viszonylag korai szakaszában fordulnak elő. 4 A miRNS és a PTEN célgén komplex kapcsolatának jellemzése endometrium elváltozásokban segíthet a karcinogenezist vezérlő molekuláris utak további meghatározásában. Ezért úgy döntöttünk, hogy megkeressük a hat miRNS differenciál expresszióját, amelyekről a 21., 22., 23., 25., 27., 28., 29., 31., 36. és PTEN endometrium rákban leggyakrabban számoltak be különböző endometrium szövetekben, hogy megértsük az endogén karcinogenezist és ezeket expressziós profilokat alkalmazzák a kóros diagnosztikai területen. Ezek a biomarkerek elősegítik az endometrium hiperplázia diagnosztikai reprodukálhatóságát, és javítják a komplex atipikus hiperplázia (CAH) és az endometrium CA közötti diszkriminációt. Ezektől a biomarker expressziós profiloktól elvárható, hogy azonosítsák azokat az endometrium hiperpláziában szenvedő betegeket, akik egyidejűleg CA-val rendelkeznek, vagy fennáll a kialakulásuk veszélye.
Anyagok és metódusok
Méhnyálkahártya szövetminták és betegek
Összesen 75 archivált formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) szövetblokk kapott normál méhnyálkahártyát (10 eset), egyszerű hiperpláziát (SH, 21 eset), CAH-t (22 eset) és endometrium CA-t (22 eset). A Bucheon St Mary Kórház patológiai osztálya 1994 és 2004 között. A betegek életkora 29 és 77 év között volt, a medián 47 év. A 22 CA közül 16 volt invazív a myometriához, 15 beteg volt az IA szubsztituensben, 5 az IB szubsztituensben és 2 a IIIC1 szubsztituensben a Nemzetközi Nőgyógyászati és Szülészeti Szövetség szabványai szerint.
A szövettani diagnózisokat két független patológus vizsgálta. A normál szöveteket olyan betegektől nyertük, akiknél a méh jóindulatú kóros megállapításai miatt hysterectomia történt, például leiomyoma, adenomyosis vagy méhpraps. Csak 80% -nál több hiperpláziát vagy CA-tartalmat tartalmazó szövetblokkokat használtunk erre a vizsgálatra. Az endometrium CA-k esetében csak jól differenciált (1. fokozatú), endometrium típusú endometrium CA-kat választottunk ki, mert ezek a fő célok, amelyeket meg kell különböztetnünk a CAH-tól.
RNS extrakció
Az FFPE szövetekből származó teljes RNS-t a RecoverAll teljes nukleinsav extrakciós készlet (Ambion, Texas, USA) alkalmazásával extraháltuk a gyártó protokollja szerint. Az RNS koncentrációját és tisztaságát UV spektrofotométerrel határoztuk meg.
Valós idejű reverz transzkripció és kvantitatív PCR
Valós idejű reverz transzkripciót és kvantitatív PCR-t végeztünk a következő miRNS-ekre: miR-205, miR-183, miR-200c, miR-200a, miR-182 és miR-21 TaqMan MicroRNA reverz transzkripciós készlet és TaqMan tesztek segítségével. . három példányban (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). U6 kis mag 2-t (RNU6b) alkalmaztunk a bemenő összes kis RNS normalizálására. Az egyes miRNS-ek, valamint az RNU6b abszolút mennyiségi meghatározását egy standard görbe alkalmazásával hajtottuk végre, amelyet a VK2 sejtekből kivont reverz transzkripcióval írt teljes RNS soros hígításával állítottunk elő, és mindegyik miRNS expresszióját a miRNS és az RNU6b (RQ) arányaként tüntettük fel.
A PTEN expresszióvesztés immunhisztokémiai elemzése
Statisztikai analízis
Kruskal-Wallis teszttel hasonlítottuk össze a miRNS expressziójának RQ-ját a betegek kóros eredményeinek vonatkozásában. A patológiai diagnosztikát standard referenciaként alkalmazták. Összeállítottunk egy jellegzetes vevő-kezelő görbét, és kiválasztottuk az egyes miRNS és az összetett miRNS panelek határértékeit, amelyek nagy általános pontosságot eredményeztek. Az egyes korlátozásokhoz kiszámítottuk az érzékenységet és a specificitást a CA és más szövetek megkülönböztetésében, valamint a CA és a CAH megkülönböztetését. Megbecsülték a vevő működésére jellemző görbe alatti területet (AUC) is. A legjobb összetett miRNS panel meghatározásához Akaike információs kritériumokat használtunk, amelyek a valószínűségi teszt és a modell paramétereinek száma alapján meghatározzák a legmegfelelőbb modellt. A kóros csoportok közötti PTEN expresszió különbségét χ 2 teszttel, a miRNS expressziójának különbségét pedig a PTEN minták és az expresszorminták között Mann-Whitney teszttel teszteltük. Az összes elemzés statisztikai szignifikanciáját a kétfarkú 0,05 tesztszint határozta meg.
az eredmény
MikroRNS expresszió klinikai mintákban
Az öt miRNS (miR-182, 183, 200a, 200c és 205) expressziós szintje szignifikánsan magasabb volt az endometrium CA-ban a CAH-hoz, az SH-hez és a normál endometrium szövethez képest (P
( a - f ) A miRNS-182, 183, 200a, 200c és 205 expressziós szintje szignifikánsan magasabb volt az endometrium carcinomában (CA) a normál endometriumhoz (n1), az egyszeres hyperplasiahoz (SH) vagy a komplex hyperplasiahoz képest. A vízszintes vonal az átlagértéket jelzi. * P
( a - g ) A miRNS expressziós szint görbéjének vevő és kezelő jellemzői görbéje (ROC). Az egyes miRNS-ek ROC-görbe alatti területe (AUC) jelzi annak pontosságát az endometrium rák és az endometrium hyperplasia vagy normális endometrium megkülönböztetésében. Minden P érték
( a - g ) A miRNS expressziós szint görbéjének vevő és kezelő jellemzői görbéje (ROC). Az egyes miRNS-ek ROC-görbe alatti területe (AUC) jelzi annak pontosságát az endometrium carcinoma és a komplex atipikus hyperplasia megkülönböztetésében. Minden P
a - d ) A PTEN immunhisztokémiai vesztesége a ) normál méhnyálkahártya (PTEN veszteség, heterogén); b ) egyszerű hiperplázia (PTEN veszteség, heterogén); ( c ) komplex atipikus hiperplázia (PTEN elvesztése, negatív); a ( d ) endometrium carcinoma (PTEN elvesztése, negatív). A fehér nyíl egy reprezentatív PTEN-nulla mirigyet, a fekete nyíl pedig a PTEN-t kifejező mirigyet jelöli.
Teljes méretű kép
Meglepő módon a hat miRNS közül ötben szignifikáns különbségeket találtunk a normál endometrium vagy hiperplasztikus szövet és az endometrium CA között. A miR-182, 183, 200a, 200c és 205 magasabb expresszióját figyelték meg az endometrium CA-ban, összehasonlítva a CAH-val, az SH-vel és a normál endometrium-szövetekkel. Mind a hat miRNS statisztikailag elkülönülő erőt mutatott az endometrium CA és más szövettípusok között, a miR-183 különösen 80% -nál nagyobb érzékenységet és specifitást mutatott. Azt is megállapítottuk, hogy statisztikailag a hat miRNS-ből álló összetett panel volt a legjobb biomarker.
Klinikai szempontból bizonyos esetekben különösen nehéz megkülönböztetni a CAH-t és a CA endometriumot, és a helyes patológiai diagnózis döntő fontosságú e betegek kezelésében. Vizsgálatunk során a hat miRNS közül ötnél magasabb volt az expresszió az endometrium CA-ban, mint a CAH-ban. Az AUC elemzés alapján az egyes miRNS-ek alapvetően informatívak. Azonban a miR-182, 183, 200a és 200c alkotta négy miRNS-ből álló összetett panel volt a legjobb kombinált biomarker az endometrium CA és a CAH megkülönböztetésére.
90% feletti magas érzékenysége és specifitása miatt bonyolult esetekben kiegészítő diagnosztikai eszközként használható.
A PTEN a miR-219, 41 megerősített célpontja, valamint a miR-200c és 183 jósolt célpontja. A megjósolt célokat a //microrna.sanger.ac.uk/sequences címen vizsgáltuk. 21 Számos tanulmány arról számolt be, hogy a PTEN immunhisztokémiai expressziós mintái diagnosztikai markerként használhatók a normális, hiperplasztikus és neoplasztikus endometrium megkülönböztetésére. 8, 42, 43 Pavlakis et al. 44 azt javasolta, hogy az endometrium biopsziákban az EIN PTEN vesztesége és nukleáris atypiaja megjósolhassa az egyidejű endometrium CA fennállását. Néhány más tanulmány azonban nem mutatta ki, hogy a PTEN expresszió hiányának specifitása és reprodukálhatósága klinikailag hasznos lenne biomarkerként. 7, 45, 46 Ezért elhatároztuk, hogy meghatározzuk a PTEN tumor szuppresszor gén szerepét az endometrium tumorokban, valamint a miRNS változásokhoz való viszonyát, beleértve a specifikus miRNS-eket is, amelyeket PTEN tumor szupresszor gének célpontjának tekintettek. 9, 21
Ebben a tanulmányban a PTEN veszteség százalékos aránya, beleértve a PTEN-negatív és heterogén eseteket is, szignifikánsan magasabb volt a CA és a CAH endometriumban az SH-hez és a normál endometriumhoz képest. Érdekes módon a miR-200c jelentősen fel van szabályozva a különböző PTEN-negatív endometrium szövetekben. Adataink alapján azonban, amelyek eltérést mutattak a PTEN veszteség és a CAH-ban található miR-200c expresszió között, más mechanizmus vagy miRNS vonható be az endogén karcinogén útvonal PTEN veszteségének folyamatába. Bár a PTEN a miRNS-21 megerősített célpontja, és úgy gondolják, hogy a miRNS-21 szerepet játszik az endometriózis 24, 47 és az ösztrogén receptor hálózat patogenezisében, vizsgálatunkban a miRNS-21 nem tűnik szerepet játszani az endogén tumorgenezisben.,
Nincs jelentés a miRNS és PTEN expressziós profilok hisztopatológiai differenciáldiagnosztikájáról az egyszerű CAH és az endometrium CA között. Reméljük, hogy ezeknek a biomarkereknek az expressziós profilja segíthet abban, hogy az endometrium elváltozások több kategóriájának egyikét nagyobb biztonsággal válasszuk ki, különösen a CAH és a jól differenciált endometrium CA közötti különbségtételben.