Absztrakt

A pitvari natriuretikus peptid (ANP) a natriuretikus peptidrendszer fontos eleme. A hízósejtek nagy szerepet játszanak számos szabályozási rendszerben. Eközben ezeknek a sejteknek az ANP-aktivitásban való részvételét nem vizsgálták kellőképpen. Ebben a munkában bemutattuk az ANP jelenlétét patkány peritoneális hízósejtekben. A tiszta hízósejt-frakciót úgy nyertük, hogy a patkány peritonealis sejtjeit Percoll-sűrűség-gradiensen szétválasztottuk. Két, 2,5 kDa és 16,9 kDa molekulatömegű ANP-immunreaktív fehérjét detektáltunk ezekből a hízósejtekből származó lizátumokban Western-blottolással. Az elektronmikroszkópos immunarany jelölés feltárta az ANP-immunreaktív anyag jelenlétét a hízósejt-granulátumok tárolásában, szekréciójában és felszabadulásában. Eredményeink arra utalnak, hogy a patkány peritonealis hízósejtjei tartalmazzák mind az ANP prohormont, mind az ANP-t. Mindkét peptid a hízósejt szekréciós sejtjeinek granulátumában helyezkedik el, és degranulációs mechanizmus útján szabadul fel. Megvitatták, hogy sok hízósejt-funkció oka annak lehet, hogy ezek a sejtek termelik a natriuretikus peptideket.

A pitvari natriuretikus peptid (ANP) diuretikus, natriuretikus és értágító tulajdonságokkal rendelkező hormon. Ezt a peptidet elsősorban pitvari kardiomiociták termelik 1. Az ANP kardiomiociták általi szekrécióját specifikus szekréciós vezikulák, úgynevezett pitvari szemcsék jelenléte jelzi ezekben a sejtekben. A pitvari szemcsék tartalma felszabadul a túlterhelés, az oxigénhiány és a szívizom számos más fiziológiai és kóros folyamata miatt. Az ANP-t a 2. szívinfarktusba beszivárgó juh-fibroblasztok, a patkány és a szarvasmarha vezetőképző rendszerének sejtjei 4, a patkány agyi neuronjai 5, a patkány thymus sejtjei 6, a szarvasmarha szaruhártyája 7 sejtjei, a patkány simaizom sejtjei 8 és az egér makrofágjai 9 is előállítják. .

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Hízósejtek izolálása

A tiszta hízósejt-frakciót a patkány peritonealis sejt-szuszpenziójából izoláltuk úgy, hogy a sejteket Percoll-sűrűség-gradiensen elválasztottuk, a 14. részletes protokoll szerint. Hat 250-300 g tömegű felnőtt Wistar patkányt használtunk. Éteres érzéstelenítés és lefejezés után 10 ml PBS-t injektáltunk az állat hashártyájába; gyengéd hasi masszázs során a hashártya üregét kinyitották, és Pasteur-pipetta segítségével összegyűjtötték a sejtmosást. 6 patkány mosását centrifugáltuk 120 x g sebességgel 10 percig, az üledéket újraszuszpendáltuk 0,5 ml PBS-ben, és a kapott sejtszuszpenziót 88% -os Percoll gradiensre rétegeztük. A Percoll-gradienst 0,7 ml 10-szer tömény RPMI (Gibco BRL) hozzáadásával 200 mM Hepes/1 M NaOH-hoz (pH 7,0) adtuk, és 17 000 x g-vel 20 percig centrifugáltuk. Az előformázott Percoll gradienst a tetejére rétegzett sejtszuszpenzióval 15 percig 450 x g sebességgel centrifugáltuk. A hízósejt-frakciót, amely most a cső alját foglalta el, összegyűjtöttük és kétszer PBS-ben mostuk. A sejtszuszpenzió elektronmikroszkópos mintáit vettük (1. minta) és az elválasztás után (2. minta) Percoll-ban. Az izolált sejteket Western blot analízissel és elektronmikroszkópos immunocitokémiával vizsgáltuk.

Western blot elemzés

A tisztított hízósejteket a következő összetételű (mM) pufferoldatban lizáltuk: 10x Tris-HCl, pH 7, 4, 150 NaCl, 0,5% Nonidet-P40, 0,2 aprotinin, 0,2 leupeptin, 1 Na-ortovanadát, nátrium 1 -fluorid. 0,2 fenil-metil-szulfonil-fluorid és 20% glicerin. A lizátumfehérjéket 20% -os SDS-sel választottuk el poliakrilamid gél elektroforézissel 15, majd egy nitrocellulóz membránra 16 helyeztük át. Az ANP-immunreaktív fehérjék kimutatását primer poliklonális nyúl patkány antitest szintetikus C-terminális ANP-vel (99-126. Aminosavak, Peninsula Lab. Inc., Bachem) hígítottuk 1: 1000 arányban, és torma-peroxidázhoz konjugált torma szekunder antitestet egér IgG-n. (Sigma). Az immunblotokon lévő fehérjéket fokozott kemilumineszcencia módszerrel detektáltuk. Kereskedelmi ANP patkány (Sigma) szolgált kontrollként. A kalibráláshoz 2,5 és 17 kDa közötti molekulatömegű készletet (Sigma) használtunk.

Elektronmikroszkóp immunocitokémia

A következő antitesteket alkalmaztuk: ugyanaz a primer antitest, mint a Western-blotolásnál, 1: 1000 arányban hígítva és arany konjugált (10 nm) A-fehérje (Sigma) hígításával 1:20 arányban másodlagos antitestként.

A sejteket 2,5% glutáraldehiddel rögzítettük 0,1 M nátrium-kakodilát pufferben (pH = 7,4) 1 órán át, utólag fixáltuk 1% Os04-gyel, egyenként uranil-acetáttal festettük, dehidratáltuk és az Epon-Araldit-ba helyeztük a szokásos eljárás szerint. Az ultravékony részeket gyémánt késsel vágták és nikkelrácsokra rögzítették. A felszeletelt rácsokat vízzel kezeljük, majd egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáljuk az elsődleges antitesttel, majd 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk a szekunder antitesttel. A készítményeket uranil-acetáttal és ólom-citráttal festettük, és JEM 7A elektronmikroszkóp alatt vizsgáltuk 80 kV-on. Az immunfestés specifitását a következő kontroll alkalmazásával értékeltük: az elsődleges antiszérum lépés kihagyásával és a szekunder antitest önmagában történő alkalmazásával. A kontroll negatív eredményeket adott, azaz jelentéktelen véletlenszerű aranyrészecskék lerakódása a metszeteken. Az 1. és 2. mintában a hízósejtek arányát fénymikroszkóppal számítottuk metilénkékkel festett pollenszelvényeken. Minden sejthez 300 sejtet elemeztünk.

AZ EREDMÉNYEK

sejtkutatásban

A hízósejtek (nyilak), többek között, a patkány peritoneális üregében laktak (1. minta a frakcionálás előtt Percoll-ban). Metilénkékkel festett szemitinrész. Bár = 5 um.

Teljes méretű kép

Hízósejtek Percoll-ban történő izolálás után (2. minta). A szemitin metilén-kékkel festett szakasz. Rúd = 5 μm.

Teljes méretű kép

A hízósejt elektronmikrográfiája degranulációs állapotban. A sejtben a homogén anyagot tartalmazó tároló granulátumok között a szervezetlen mátrixú kisülési granulátumok és a felszabaduló szemcsék (r) figyelhetők meg a sejtfelszín közelében. N, mag. Rúd = 1 μm.

Teljes méretű kép

Western blot elemzés

Az ANP-immunreaktív fehérjék azonosítása a peritoneális hízósejt-lizátumban (4. ábra) két antitest által felismert fehérje jelenlétét mutatja az ANP C-terminális részén. Ezeknek a fehérjéknek a molekulatömege körülbelül 2,5 kDa és 16,9 kDa volt. Az alacsonyabb tömegű fehérje helyzete megfelelt a kontroll patkány ANP helyzetének.

A patkány peritonealis hízósejtjeinek (A vonal) és a szintetikus patkány ANP peptidjének (B vonal) Western-blot-ját reagáltattuk anti-patkány C-terminális ANP antitestekkel (99-126), miután az SDS-t poliakrilamid-gélelektroforézissel elválasztottuk. Két sáv - 2,5 kDa és 16,9 kDa - jelzi az érett ANP és a proANP jelenlétét.

Teljes méretű kép

Elektronmikroszkóp immunocitokémia

Az ANP-immunreaktív anyag intracelluláris lokalizációját elektronmikroszkóp szinten, immunarany jelöléssel igazoltuk. Megállapították, hogy az immunfestés mind az első, mind a második mintából hízósejt szekréciós granulátumokra korlátozódik. A granulátumok, valamint a hízósejtek felszíne közelében fekvő (7. ábra) tárolását (5. ábra) és kiválasztását (6. ábra) feltüntettük. Nem mutatták ki az immunarany részecskék lokalizációját a citoszol vagy bármely hízósejt-organella felett, kivéve a granulátumokat. Az eozinofil szemcsék gyengén immunreaktívak voltak az első minta sejtjeinek ultravékony szakaszaiban is (8. ábra). Az eozinofil szemcsék központi részét sűrű szerkezetű kristályoid elektronok foglalták el. A jelet egyformán helyezték el a granulátum összes alkotóelemén. Más sejtekben nem figyeltek meg választ. A kontroll készítmények (primer antitest kezelés nélkül) negatív eredményt mutattak.

Immunelektron-mikrográf, amely az ANP-immunreaktív anyag jelenlétét mutatja a hízósejt-tároló granulátumokban. Ugyanazokat az aranyrészecskéket nyilak jelölik. Rúd = 0,2 μm.

Teljes méretű kép

ANP-pozitív immunfestés szekretált hízósejt granulátumokban. Ugyanazokat az aranyrészecskéket nyilak jelölik. Rúd = 0,2 μm.

Teljes méretű kép

Az ANP megjelölése felszabadult hízósejt granulátumokban. Ugyanazokat az aranyrészecskéket nyilak jelölik. Rúd = 0,2 μm.

Teljes méretű kép

Az eozinofil granulátumok gyengén immunjelöltek az ANP számára. A nyilak a szemcsékre rakódott aranyrészecskéket jelzik. Rúd = 0,5 μm.

Teljes méretű kép

VITA

Percoll gradiensen végzett frakcionálás után a sejtszuszpenzió 98% hízósejtből állt. Ennek a populációnak a tisztasága garancia arra, hogy a Western blot segítségével kimutatott ANP-immunreaktív anyag hízósejtekből származik. Az ANP köztudottan nagy molekulatömegű prekurzor, 126 aminosavból álló proatrialis natriuretikus peptid (proANP). Ennek a molekulának a C-terminális fragmense az ANP (99-126) érett formáját képviseli, amely a prohormon hasításából származik (lásd: 17. felmérés). A hasítatlan proANP azonban a vérbe is felszabadul, és érett ANP18-mal kering. A proANP (1-126, 16, 9 kDa), de nem érett ANP (99-126, 2, 5 kDa) jelenlétét patkány pitvari szövetkivonatokban mutatták ki 3. Megállapítottuk, hogy két ANP-immunreaktív fehérje van jelen a patkány peritoneális hízósejtjeiben. Az egyik molekulatömege megegyezett az érett ANP-2,5 kDa-val, míg a másik fehérje molekulatömege 16,9 kDa volt, ami megfelel a teljes hosszúságú patkány proANP tömegének. Adataink szerint tehát a patkány peritonealis hízósejtjei érett ANP-t és annak prekurzorát egyaránt tartalmazzák.

Az elektronmikroszkóp immunocitokémia kimutatta, hogy az ANP-immunreaktív anyag jelen van a hízósejt granulátumában. A jelölt anyag jelenléte a tároló, kiválasztó és felszabaduló granulátumokban azt jelzi, hogy az ANP kiválasztódása a hízósejtekből a degranuláció klasszikus mechanizmusával történik.

A hízósejtek testben való elterjedése szinte az összes gerinces szövetben okozhatja az ANP kimutatását 19. A hízósejtek számos biológiai funkciója, mint például az immunregulációs potenciál 20, a daganatellenes hatás 21 és mások, az ANP-k létrehozásának köszönhetők.

A hízósejtek fontos sajátossága, hogy képesek olyan transzmittereket előállítani, amelyeknek ugyanazzal a folyamattal ellentétes hatása van. Például a hízósejtek mind a hisztamint, amelynek gyulladáscsökkentő hatása van, mind a heparint, amely gyulladáscsökkentő hatású. A közelmúltban kimutatták, hogy a patkányszív hízósejtjei és a HMC-1 sejtek (humán hízósejtvonal) renint tartalmaznak, a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer 22 aktivátorát és egy természetes ANP antagonistát 23, 24. A diuretikus ANP-vel ellentétben a renin antidiuretikus hatást fejt ki. Azt a nézetet fejezik ki, hogy a kardiovaszkuláris homeosztázist a natriuretikus peptidrendszer és a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer közötti egyensúly tartja fenn 25. Így bizonyos mennyiségű renin és/vagy ANP kiválasztásával a hízósejtek hatékonyan szabályozhatják ezt az egyensúlyt.

A peritoneális hízósejtek fontos szerepet játszanak a hasi kóros folyamatokban. Ezért védő funkciót látnak el a szeptikus peritonitis 26 patogenezisében. A hasi műtétekről kimutatták, hogy a hízósejtek degranulációját indukálják, és növelik a hízósejtből származó tényezőket a peritoneális folyadékban A peritoneális hízósejtekben kimutatott ANP jelenléte egyrészt megmagyarázhatja ezeknek a sejteknek számos ismert funkcióját, másrészt megjósolhatja azoknak a még fel nem tárt biológiai hatásainak néhányát, amelyek kiterjesztik a hízósejtek funkcionális tartományát. A patkány peritoneális hízósejtekről kiderült, hogy az ANP 28, 29 hatására válaszul hisztamint (gyulladáscsökkentő faktort) szabadítanak fel. Feltételezhető, hogy az intraperitoneális gyulladás során ez a folyamat autokrin módon megy végbe, az ANP felszabadulása miatt az aktivált hízósejtekből. Érdekes módon az ANP csökkenti a gyulladásos mediátorok szekrécióját a makrofágokban, ezért gyulladásgátló potenciállal rendelkezik 30. Ezek az adatok ismét megmutatják a hízósejtek funkcionális dualizmusát. Biológiai hatásai miatt a hízósejtekből származó ANP nagy jelentőséggel bírhat a hasi szervek fiziológiai állapotának szabályozásában. Például a jelentések szerint az ANP befolyásolja a petefészek működését a 31 egerekben .

Munkánk során kiderült, hogy az eozinofil granulátumokban jelen van az ANP-immunreaktív anyag, ennek oka lehet e peptid ezen eozinofilek általi termelése és/vagy más sejtek, valószínűleg hízósejtek által felszabadított ANP. Ezt az utolsó javaslatot megerősítik azok az adatok, amelyek azt mutatják, hogy az eozinofilek képesek felszívni a felszabadult hízósejt-granulátum termékeket 32 .

köszönöm

Nagyon hálásak vagyunk Dr. Leonid Z PEVZNER az angol szöveg helyesbítéséért. Ezt a munkát részben az Orosz Alapkutatási Alapítvány támogatja (05-04-49393 támogatás).