elemeket

absztrakt

A fő

A makroautofágia (a továbbiakban autofágia) erősen konzervált katabolikus folyamat, és különféle sejtfunkciókban vesz részt. Fiziológiai körülmények között, bazális szinten fordul elő, és szerepet játszik a sejtek homeosztázisában azáltal, hogy lebontja a rosszul összeállított fehérjéket és a sérült organellumokat. A lebontandó anyagot autofagoszómák néven ismert vezikulákban izolálják, amelyek végül a lizoszómákkal társulnak. Az autofágia az öregedésben eltérõen szabályozott, és részt vesz patofiziológiai folyamatokban, beleértve a rákot is. Az 1, 2, 3 A kanonikus autofágia különféle tényezők révén reagál a környezeti ingerekre, amelyek elsősorban az eredetileg élesztőben azonosított génhomológokhoz (atg) tartoznak. A kanonikus autofágia szabályozásának két fő szabályozója a rapamicin-komplex (mTOR) 1 (mTORC1) emlős célpontja, amely negatívan szabályozza az autofág aktivitást, és a Beclin1/III foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI3K) komplex. Az autofagosomális membrán nukleációjához szükséges osztályok. A membrán tágulását két ubiquitin-szerű konjugációs rendszer (ATG12-ATG5 és ATG8/LC3) és az ATG18 WD fehérje család tagjai végzik, amelyek 1-3 foszfoinozidid interakciós doménnel (WIPI1-3) rendelkeznek (az autofágia szabályozása 7. hivatkozás).

A közelmúltban azonban nem kanonikus autofág útvonalakat fedeztek fel, amelyek abban különböznek a kanonikus jelzésektől, hogy nem feltétlenül igénylik az ATG fehérjék és fehérjekomplexek hierarchikus működését. Például a Beclin1 vagy mTORC1 és ULK1 komplextől független nem halogén autofág útvonalak 9, 10, 11, 12 néven ismertek, de végső soron mind autofagoszómák fúziójához vezetnek lizoszómákkal és a szubsztrátok lebomlásához ezekben a savas rekeszekben.

Az autofágikus utak eddig leírt összetettségével összhangban az autofágia számos következménnyel jár a patofiziológiai folyamatokban. Az autofágia befolyásolja például a tumor korai kialakulását és a tumor fenntartását, valamint a terápiás beavatkozás hatékonyságát. 13., 14., 15., 16. Megváltozott ATG fehérje expressziót és megváltozott autofág aktivitást mutattak ki számos rákos szövetben, a glioblastoma őssejtektől az emlőrákos sejtekig. Nemrégiben kimutatták, hogy a ko-chaperone Bcl-2-asszociált athanogén 3 (BAG3), amely modulálja az életkorral kapcsolatos autofág aktivitást, csökkenti az autofágia szelektivitását a szelektív autofágia révén, és erősen expresszálódik ösztrogénreceptor-pozitív neuroblasztómában és emlőrákban. sejtek. 17, 18, 19, 20, 21

Ebben a tanulmányban bizonyítékokat szolgáltatunk arra vonatkozóan, hogy az ERα a ligandkötéstől és annak ERE-közvetített transzkripciós faktor által közvetített aktivitásától függetlenül nem kanonikus autofágiát vált ki különböző megállapított ER-expresszáló tumorsejt-modellekben és emberi emlőrákos szövetekben. Kimutattuk, hogy a BAG3 leütés autofág aktivitásának csökkentése és a lizoszomális degradáció blokkolása érzékenyíti az ER α-pozitív sejteket a stresszre. Az itt bemutatott autofág útvonal részletes elemzése új stratégiákat nyithat az ER-pozitív α-emlőrák sejtek kezelésében, amelyek nem reagálnak az AE vagy aromatáz inhibitorokkal történő kezelésre.

az eredmény

Az ER-expresszió differenciálisan szabályozza az autofágia-kapcsolódó gének transzkripcióját

Az ER-k vagy transzkripciós faktorok, amelyek közvetlenül lépnek kapcsolatba az ösztrogénválasz (ERE) elemeivel és más transzkripciós faktorokkal való kölcsönhatás révén, vagy aktiválják a citoplazmatikus jelátviteli kaszkádokat. Mivel az ER α és β általában együtt expresszálódnak, az egyes receptorok funkcióinak differenciális elemzése kísérletileg kihívást jelent. Jól jellemzett neuroblasztóma sejtvonalat (SK-N-MC) használtunk anélkül, hogy az ál expressz plazmiddal (SK-01), az ösztrogén receptor α (SK-ER α) vagy a ösztrogén receptor β (SK-ER p . ). 28., 29., 30. Ezek a sejtvonalak lehetővé teszik számunkra, hogy kontrollált és jól leírt körülmények között tanulmányozzuk az ER differenciális funkcióját tumorsejtekben. 21, 28, 30, 31, 32, 33, 34 Ezen túlmenően az MCF-7 betegből származó emlőrák sejtvonalat is alkalmaztuk az ERα-t endogén módon expresszáló emlőrák ER-pozitív modelljeként, az ERβ-t azonban nem. Valamennyi sejtvonalat PCR analízissel jellemeztük az ER expresszióhoz (további 1a. Ábra). Amint azt a fentiekben leírtuk, az ER expresszió, valamint a fokozott autofág aktivitás hozzájárul a metasztatikus potenciálhoz és a rezisztenciához a rák különféle típusainak kezelésében. 18, 35

nem-kanonikus

Az ösztrogén receptorok differenciáltan szabályozzák az autofágia társult gén expresszióját. ( a ) Az SK-01, SK-ER α, SK-ER β és MCF-7 sejtek összes RNS-ét a Humán Autophage Primer 1 könyvtár (HATPL-1) felhasználásával jellemeztük, és az ER-t expresszáló sejteket hasonlítottuk át transzfektált plazmid kontrollokkal ( SK-01). A piros számok 1,5-szeresnél magasabb szabályozást, a kék számok 1,5-szeresnél nagyobb szabályozást, a sötétvörösek a P-értéket jelzik

Azt is megvizsgáltuk, hogy az ERα-szintek csökkentése az MCF-7 sejtekben megváltoztatja-e az autofág aktivitást, de a kopogtató ER és nem változtatta meg jelentősen az autofág fluxus vagy a BAG3 expresszió szintjét. Nyilvánvaló, hogy az ERα expresszió maradék mennyisége az RNAi leütése után még mindig elegendő ahhoz, hogy szerepet töltsön be a nem kanonikus autofágia fokozásában (5b. Kiegészítő ábra). Ezt az értelmezést alátámasztják azok a megfigyelések, amelyek szerint az ERα átmenetileg túlzott expresszálása az ER hiányzó natív SK-N-MC sejtekben (SK-01, SK-ER és SK-ER β sejtek prekurzorai) fokozott autofág fluxushoz és megnövekedett BAG3 fehérjéhez vezet. szintek (5b. kiegészítő ábra).

Annak megerősítésére, hogy az autofág markerek fokozott expressziójának megállapítása ER α sejtekben a megnövekedett autofagosomális biogenezist tükrözi, nem pedig az autofagosomális clearance csökkenését, egy expressziós vektort (ptfLC3) használtunk, amely vörös fluoreszcens fehérjéhez (RFP) és zöld fluoreszcens fehérjéhez (GFP) fuzionált LC3-at kódolt párhuzamosan (GFP-RFP-LC3). Megmutattuk, hogy az összes sejtvonal vörös fluoreszcens defekteket mutat a megfelelő jel nélkül a zöld csatornában kontroll körülmények között, ami az autofagoszómák és a lizoszómák intakt fúzióját jelzi. A 2a. És b. Ábra Western-blot-eredményeivel összhangban megfigyeltük az autofagosómák fokozott felhalmozódását az ER-pozitív sejtekben (3a. Ábra). Az egyes sejtvonalakban a GFP-RFP-LC3 puncta kvantitatív meghatározása (3b. Ábra) tovább erősíti eredményeinket, és az ERα-expresszáló sejtekben lényegesen nagyobb mennyiségű autofagolizoszóma képződést mutat be.

A késői fázisú autofágia BafA 1 általi gátlása fokozott sejthalált eredményez az ER-expresszáló sejtekben és H 2 O 2 -indukált oxidatív stressz hatásának kitéve. Az SK-01, SK-ER és SK-ER és MCF-7 sejteket 24 órán át kezeltük vivőanyag kontrollcsoporttal vagy 400 μM és 600 μM H 2 O 2 -val BafA 1-gyel vagy anélkül (500 nM), és a sejtpusztulást számszerűsítettük áramlási citometriával propidium-jodid festés után. Az egyes panelek három független kísérletének értékeit átlag ± SEM-ként fejezzük ki, és a kísérletek reprezentatív adatait a FACS szórásdiagram-profilokban adjuk meg. (*) az oszlopokon a P 2, 17, 21, 47 statisztikai szignifikanciát képviseli. A Knockdown BAG3-at csökkent LC3-II szint kísérte a lizoszomális gátlás után az ER-α-pozitív sejtekben és kisebb mértékben az SK-01 sejtekben, jelezve, hogy a A BAG3 jelentősen rontja az autofág áramlást (6a – c. Ábra). Érdekes módon az siRNS által közvetített BAG3 leütéssel és H 2 O 2 kezeléssel nem találtunk változásokat a sejthalálban a kontroll sejtekben, de az érzékenység jelentős növekedését mutattuk az ER α-expresszáló sejtekben (6d-f. Ábra), amelyek összességében még magasabbak voltak mint az autofágia BafA 1 kezeléssel történő gátlása után (5b. ábra ad).

A BAG3 monitorozott hatása a sejtek túlélésére az autofágiában betöltött szerepével magyarázható, de annak oka lehet antiapoptotikus funkciója is. Úgy gondolják, hogy ezeket a receptorokat a BAG3 és az antiapoptotikus BCL2 faktor kölcsönhatása szabályozza, ami a sejtek védelmét eredményezi az apoptotikus sejthaláltól, 53. míg a BAG3-ról azt is megállapították, hogy gyengíti a proteotoxicitást, ami indukálható rezisztenciát eredményez a tumorsejtekben. Továbbá beszámoltak arról, hogy a tumorsejtek apoptózisát a BAG3 csendesítése indukálja, és fokozza a neoplasztikus sejtek gyógyszer által kiváltott aplastosisát. 56, 57 Továbbá beszámoltak arról, hogy a BAG3 befolyásolja a hősokk-protein 70 (HSP70) útja által szabályozott intenzív útvonalakat, amelyek szintén összefüggenek a rákos sejtek túlélésével és az apoptózissal. 58

Legfrissebb eredményeinkkel összhangban a proteomikai elemzés eredményei megmutatták a BAG3 és a fő Vault Protein szerepét, mint hatékony túlélési tényezőket, amelyek hozzájárulnak a kemoterápiás rezisztenciához az emlőrákos sejtekben. 59

Korlátozott adatok állnak rendelkezésre olyan biomarkerekről és célfehérjékről, amelyek általában megjósolják az autofágia-gátlók hatékonyságát az emlőrákban. Ezért hatékony autofág boncolásra van szükség. Az autofág hálózatok és az egyedi "autofágia-lábnyomok" bevezetése a betegek számára potenciálisan javíthatja az autofág útvonalú gyógyszeres terápia hatékonyságát, mivel speciális kábítószer-kanonikus és mTOR/PI3K-függő kanonikus autofágia alkalmazható. Ez nagy kihívást jelent az orvostudomány és a biomarkerek személyre szabott fejlesztése szempontjából, ugyanakkor új terápiás lehetőséget jelent a rákos betegek számára is.

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra

Humán SK-N-MC sejteket (ATCC HTB-10) és MCF-7 sejteket az American Type Cell Collection-ből nyertünk, és a fent leírt módon tenyésztettük. Az összes kezelési reagenst feloldottuk dimetil-szulfoxidban (DMSO), és a következő koncentrációkban és időintervallumokban használtuk: 10 nM 17β-ösztradiol (E2, Sigma-Aldrich, Seelze, Németország) 24 órán át; 1 μM ICI 182780 (Tocris Biosciences, Bristol, Egyesült Királyság) 24 órán át; 500 nM Bafilomycin A1 (Enzo Life Science, Farmingdale, NY, USA) 6 órán át; egyidejű kezelés 1 μM Wortmanninnal (Sigma-Aldrich) és 100 nM bafilomicin A1-vel 20 órán át és 50 μM U0126-tal (Promega, Madison, WI, USA) 48 órán át. Kettős kezelés esetén 1 órát végeztek. Előkezelés gátló szerrel.

transzfekció

Kalcium-foszfát módszerrel a sejteket 6 lyukú lemezekre szélesztettük 24 órával a transzfekció előtt. Az összes reagenst szobahőmérsékletre (RT) állítottuk, és 10 μg plazmid DNS-t vagy 20 μg siRNS-t összekevertünk 105 μl vízzel és 15 μl CaCl2-val, és 5 percig inkubáltuk. Összesen 120 μl 2x HEPES puffert adunk hozzá, és 30 percig inkubáljuk. A szuszpenziót közvetlenül a táptalajra vittük át, és 24 óra múlva friss tápközeget adtunk hozzá. A GFP-RFP-LC3 plazmidot (ptfLC3, Addgene, Cambridge, MA, USA) használtuk az autofág aktivitás vizualizálására. További 24 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük, vagy immunocitokémiának vetettük alá. A pIRES-ER α és pIRES-ER β képződését a 29., 30. pontban leírtuk, és a pIRES plazmidot a Clonetech Laboratories-től (Mountain View, CA, USA) szereztük be.

Az siRNS által közvetített túlexpresszió és leütés céljából a sejteket kalcium-foszfát vagy FuGENE módszerrel (Promega) transzfektáltuk. A részleteket a kiegészítő információk tartalmazzák. A hatalmas siRNS-t (5'-AUUCUCCGAACGUGUCACG-3 ') siMAX-ként vásároltuk az MWG-től. az anti-BAG3 siRNS-t Sigma-Aldrich (SASI_Hs02_00337266) szállította. anti-DRAM1 siRNS-keveréket az MWG szállította (No. 1: 5'-ACACCUCCAGAGAGUGGUA-3 '; No. 2: 5-GGAUUAAUGUAUAUCACGUA-3').

Western blot elemzés

Western-blot analízist a fent leírtak szerint hajtottunk végre. 2 Az elemzést Fusion-SL 3500 WL rendszerrel (Peqlab, Erlangen, Németország) és Aida Image Analyzer v.4v26 szoftverrel (Raytest, Straubenhardt, Németország) végeztük.

immunocitokémia

A sejtek immunocitokémiáját a fent leírtak szerint hajtottuk végre. 2 paraffinba ágyazott daganatmintát deparaffinizáltunk, majd xilollal rehidratáltuk, majd az alkoholok (100% -70% alkohol) csökkenő tartománya következett be. A rehidratációt a legelőnyösebb vízzel végzett inkubálással állítottuk le, és a szakaszokat vízben tároltuk, amíg az antigént kimutattuk. Ezután immunfestést hajtottunk végre a fent leírtak szerint. 2 A sejteket és szöveteket mikroszkóposan elemeztük egy fordított Leica TCS SP5 (Wetzlar, Németország) és egy Zeiss LSM710 meta konfokális mikroszkóppal (Oberkochen, Németország), és a képeket Adobe Photoshop CS5 (San Jose, Kalifornia, USA) és Leica LAS AF alkalmazásával dolgoztuk fel. (Leica Microsystems (UK) Ltd, Milton Keynes, Egyesült Királyság). A GFP-RFP-LC3 foltok képződését (a fenti GFP-RFP-LC3 expressziós plazmid felhasználásával vizualizáltuk) a transzfektált sejtvonalaknak megfelelő konfokális lézeres pásztázó mikroszkópos képeken és Bafilomycin A1 (500 nM, 6 h sejtvonalonként legalább 56 sejt.

Transzmissziós elektronmikroszkópia

A minta előkészítését és a transzmissziós elektronmikroszkópos elemzést a fent leírtak szerint hajtottuk végre 63, és a képeket Adobe Photoshop CS5-vel dolgoztuk fel.

antitestek

Ebben a vizsgálatban az immunocitokémiához, valamint a Western blot elemzéshez használt antitestek a következők voltak: ATG7 (8558, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA); BAG3 (ab47124, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság); BCL2 (sc-492, Santa Cruz, Dallas, TX, USA); ERa (RM9101S0, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA); ERK1/2 (9102, Cell Signaling Technologies); p-ERK1/2 (9106, Cell Signaling Technologies); LC3B (L7543, Sigma-Aldrich); mTOR (OP97, Millipore, Billerica, MA, USA); p-mTOR S2448 (ab51044, Abcam); NBR1 (00004077-M01, Abnova, Tajpej, Tajvan); SQSTM1 (GP62-C, Progen, Heidelberg, Németország); PI3K III. Osztály (4263, Cell Signaling Technologies); Tubulin (T9026, Sigma-Aldrich); WIPI1 (HPA007493, Sigma-Aldrich); Beclinl (ab51031; Abcam); p70S6K (9202, sejtjelzés); p70S6K Thr389 (9206, sejtjelzés). A másodlagos antitestek anti-egér/nyúl/tengerimalac antitestek voltak konjugálva a DyLight 488, 649 és Cy3 (immunfluoreszcencia, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) vagy HRP (immunoblotting, Jackson ImmunoResearch) konjugálásával.

Emberi emlőrák szövet

Az emberi emlőrák daganatmintákat műtéti úton nyerték rákos betegeknél. A rákos betegekkel kapcsolatos részletek az 1. kiegészítő táblázatban találhatók. Tájékoztatott beleegyezést kaptunk minden alanytól, és a vizsgálatokat a Frankfurti Egyetem Tumor Gerrants Együttműködési Központjának (UCT) intézményi felülvizsgálati testületei és etikai bizottsága hagyta jóvá.

PCR, reverz transzkripciós PCR és valós idejű kvantitatív PCR

A PCR-t és a valós idejű kvantitatív PCR-t a 21. leírás szerint hajtottuk végre a HATPL-1 (Biomol, Hamburg, Németország) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint. Az SK-ER α, SK-ER és MCF-7 sejtek SK-01 sejtekhez viszonyított változásainak és P értékeinek áttekintését az SK-01 sejtekhez képest az Q 2-tól származó RT 2 Profiler PCR Array Data Analysis Template v4.0 (Venlo, The Hollandia)). A mátrixlemezre töltött mind a nyolc gént nyolc belső kontrollként használtuk. Csak azok a gének változnak, amelyek többszörösen változnak, mint +1, 5 vagy -1, 5 és P-értéke P 64). A transzfektálást a fent leírtak szerint hajtottuk végre. 24 óra múlva a sejteket 17 β-ösztradiollal (10 nM) és/vagy ICI-vel (1 μM) stimuláltuk 24 órán át. Ezt követően a sejteket Luciferase Assay System (Promega, kat. Sz. E4030) alkalmazásával gyűjtöttük össze. A fehérjekoncentrációkat BCA-val határoztuk meg a fent leírtak szerint, és a lumineszcencia-leolvasásokat automatikus számlálóval rendeltük (Wallac Victor2, PerkinElmer, Waltham, MA, USA). A transzfekciós kísérleteket három példányban hajtottuk végre, háromszor megismételtük és normalizáltuk az azonos fehérjetartalomra.

Túlélési kísérletek fluoreszcenciával aktivált sejtválogatással (FACS)

Huszonnégy órával a stimuláció előtt az SK-01, SK-ER a, SK-ER β és MCF-7 sejteket 24 lyukú lemezekre oltjuk. Bafilomycin A1-gyel (500 nM) vagy DMSO-val végzett 1 órás előzetes inkubálást követően a sejteket 24 órán át 400 µM vagy 600 µM H 2 O 2 (Sigma-Aldrich) vivőanyag-kontrollal kezeltük. A kezelés után a sejtek felülúszóját összegyűjtöttük, a sejteket tripszin-emésztéssel feloldottuk a lemezekről, és ismét inkubáltuk a korábban összegyűjtött felülúszóval. 5 perces centrifugálást (800 g) követően a sejteket 100 μl PBS-ben oldottuk. Minden lépést jégen hajtottunk végre. A sejtek életképességét a sejtek propidium-jodiddal (PI) (1 μg/ml) történő festésével mértük. A PI fluoreszcenciát FACScan Flow Cytometer-mel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) határoztuk meg. A sejtpopulációkat előre szétterítettük előre szórással (FSC-magasság) és oldalsó szórással (SSC-magasság). Ezt követően az eredményeket a BD CellQuest Pro Analysis szoftverrel elemeztük.

Statisztikai analízis

A kvantitatív adatokat átlagként ± SEM-ként fejezzük ki. A kísérleti csoportok közötti statisztikai összehasonlításokat Student-féle t-teszttel végeztük. A P ≤0,05 valószínűségi értékeket szignifikánsnak tekintettük.