elemeket

absztrakt

A virágos homeotikus transzkripciós faktorok (TF) kombinatorikusan hatnak a szerv szervi azonosságainak meghatározására. A virágszervek specifikációját szabályozó génszabályozó hálózat (GRN) felépítését és működését azonban még mindig nem ismerjük. Különösen a homeotikus TF-ek, a mikroRNS-ek (miRNS-ek) és a szervek iniciációját és növekedését szabályozó egyéb tényezők összekapcsolódását nem vizsgálták szisztematikusan. Genomikailag széles TF-kötődés, mRNS és miRNS expressziós adatok kombinációjának felhasználásával rekonstruáljuk a virág merisztémák és a szervek differenciálódásának fejlődését szabályozó dinamikus GRN-t. Meghatározzuk a virágos homeotikus TF-ek és a közös célokat szabályozó miRNS-ek által közvetített domináns hurkokat (FFL). A koherens FFL kísérleti validálása azt mutatja, hogy az ablak méretét a SEPALLATA3 által szabályozott miR319/TCP4 modul vezérli. Bemutatjuk továbbá, hogy a homeotikus faktorokhoz és a kiválasztott más TF-ekhez való kombinatorikus DNS kötődése előre jelzi a szerv-specifikus génexpressziós mintázatokat. Eredményeink értékes forrást jelentenek a molekuláris szabályozási folyamatok tanulmányozásához, amelyek a növényi virágszervek specifikációjának alapját képezik.

A virágszervek növekedését és differenciálódását más típusú TF-k tovább kontrollálják, beleértve a BELLRINGER (BLR) 22, JAGGED (JAG) 23, ETTIN (ETT) 24, 25 és a REPRESSORA GIBBERELLIC ACID (RGA) 26 alkalmazást. A BLR a TF homeodomént kódolja, és központi szerepet játszik az apikális aktivitás apikális merisztémájának kialakulásában azáltal, hogy befolyásolja a merisztémák, a filotaxok és a szervek virágmintáinak aktivitását 22. A JAG egy cink-ujj TF-t kódol, amely szabályozza a szervhatárok kialakulását és növekedését 27. Az ETT egy auxin-reagáló TF, amely a 24., 25. virágmorfogenezis számos aspektusát szabályozza, és az RGA a gibberelin jelátviteli útvonalban való részvétel révén szabályozza a virágzat fejlődését. .

A kromatin immunprecipitáció (ChIP), majd a nagy áteresztőképességű DNS szekvenálás (ChIP-seq) megkönnyíti a virágfejlődés során a fő fejlődési TF-ek által megkötött genomi régiók azonosítását29. A biológusok elkezdték megérteni a genomi TF 30, 31 és a virágképződést globálisan szabályozó komplex génszabályozó hálózatok (GRN) kötődési mintáit 32. Ezen fő szabályozók célgénhálózatainak szisztematikus elemzése azonban még mindig nem elégséges, ezért a virágszervek fejlődését szabályozó kapcsolódó hálózati komponensekkel kapcsolatos ismereteink hiányosak. E tekintetben a genomiális kötési és expressziós adatok kombinációja lehetőséget ad a virágspecifikációk alapjául szolgáló szabályozási "kód" tisztázására.

Számos tényező, például a mikroRNS-ek (miRNS-ek) játszik szerepet a virágátmenetben és a virág fejlődésében. Például a vegetatív és a szaporodási növekedés korfüggő átmenetét a MIR156 szabályozza, amely az életkor előrehaladtával fokozatosan csökken, ami megnöveli céljai, a TF SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL) kifejeződését, amelyek viszont az upstream gének aktivátorai: FM azonosságok, LFY és AP1, valamint MIR172 (33., 34., 35. hivatkozás). A MIR172 megcélozza az AP2-t és annak szorosan kapcsolódó paralógjait, ezáltal szabályozva a virágos átmenetet és a virágos homeotikus gének 16, 36 specifikus aktiválódását. Más jelentések szerint a MIR319 befolyásolja a szirom méretét azáltal, hogy szabályozza a TCP4 és TCP10 géneket 37. A MIR159, a MIR160, a MIR164, a MIR165, a MIR166 és a MIR167 szintén szerepet játszik az Arabidopsis 38 virágszerveinek morfogenezisében. A virág átmenetét és a virág fejlődését szabályozó miRNS-ekről szóló sok jelentés ellenére ezeknek a miRNS folyamatoknak a dinamikus vezérléséről még mindig nincs teljes megértés. Különösen korlátozott ismereteink vannak arról, hogyan szabályozzák magukat a miRNS-eket az input szabályozók.

Ebben az esetben elvégeztük a genommegkötési adatok integratív elemzését a fő szabályozó TF-ek genomjában, beleértve a virágátmenetet szabályozó tényezőket (FLC, FLM, SVP és SOC1), a TF FM/szerv azonosságát (LFY, AP1, AP2, AP3, PI, SEP3, AG) és a virágszervek morfogenezisének szabályozói (BLR, JAG, ETT, RGA). Az újonnan generált stádium-specifikus mRNS és miRNS adatokkal összekapcsolva az Arabidopsis-ban a reproduktív növekedést szabályozó GRN-eket készítették és vizsgálták, a hálózat miRNS-aktivitására összpontosítva. Az összes miRNS által szabályozott TF-kötő információt beépítettük a rendszerszabályozó hálózatba. Hálózati elemzést végeztünk, hogy szisztematikusan megkeresjük a dúsított hálózati motívumokat ebben a "metahálózatban", és azonosítsuk az uralkodó miRNS-közvetített fordított hurokokat (FFL). Megerősítettük továbbá a MIR319a-ból és annak TF-céljaiból álló FFL fontos szerepét a sziromnövekedés közvetítésében. Végül a gépi tanulási módszer segítségével kimutattuk, hogy a homeotikus szabályozók és más TF-ek kombinatorikus kötődése a közös célgénekhez fontos a génaktivitások fázis- és szervspecifikus aktiválásához.

az eredmény

A TF-kötés országa a virágfejlődés során

arabidopsis

Teljes méretű kép

Összességében elmondható, hogy a TF-kötőhelyek száma (TFBS; az úgynevezett "csúcsok") nagyon különbözőek különböző szabályozóknál vagy ugyanazon szabályozónál különböző szakaszokban (1c. Ábra; 2. kiegészítő adat). A BLR, az LFY és a SEP3 mutatja a legtöbb kötődési helyet, ami összhangban áll azzal a ténnyel, hogy ezeknek a TF-eknek sok és sokféle szerepük van a reproduktív fejlődésben 40, 41, 42. A SEP3 jelentős kötési helyeket szerez a virágzás fejlődési szakaszaiban, összhangban a virágszervek fejlődése során betöltött szerepével és expressziós szintjével (1c. Ábra). Másrészt az AP1 elveszíti a kötőhelyeket a fejlődési idő folyamán, ami összhangban áll az FM-identitás tényezőként betöltött fontos szerepével a virág fejlődésének korai szakaszában, és korlátozottabb expresszióval a későbbi időpontokban (csökkent ChIP hatékonyság).

Több TF elfoglalása megjósolja a génexpresszió dinamikáját

Röviden: a több TF által megkötött gének dinamikusabb kifejeződést mutatnak a virág fejlődése során. Különböző típusú szabályozó gének és meghatározott miRNS-készletek tartoznak a virágcélú fejlesztési hálózat célgénjei közé.

miRNS által közvetített GRN és gazdagított hálózati motívumok

A virág fő szabályozóinak célpontjai között gyakran azonosították a miRNS géneket (1d. Ábra), és gyakran több TF kötötte őket (2e. Ábra). Tekintettel arra, hogy a növények miRNS-célpontjainak fő kategóriája a TF-ekből áll 48, és ezeket a célokat virágmester-szabályozók is közvetlenül szabályozhatják, vonzó a virágos kulcsszabályozó TF-ekhez, miRNS-génekhez és célgénjeikhez kapcsolódó fejlődési GRN-ek tisztázása. Egy ilyen "metahálózatban" meghatározható a különféle szabályozási mechanizmusok hatása, és a köztes szereplőként szolgáló miRNS-ek további hálózati robusztussági rétegeket biztosíthatnak 49. Valójában összesen 422 előre jelzett szabályozó TF-miRNS kapcsolat és 273 poszttranszkripciós miRNS-TF kölcsönhatás létezik a 15 fő szabályozó, 144 expresszált miRNS gén és 674 TF expresszióban megváltozott gén között (3a. Ábra). Az in silico hálózatszerkezet elemzése kimutatta, hogy a hub gének törlése az interakciók gyorsabb elvesztéséhez vezet a hálózatban miRNS szabályozás nélkül, összehasonlítva a miRNS által közvetített hálózatokkal (3b. Ábra). Ez a megfigyelés azt sugallja, hogy a miRNS által közvetített szabályozás növeli 50 virágos GRN topológiai robusztusságát.

Teljes méretű kép

Teljes méretű kép

Szervspecifikus GRN

Teljes méretű kép

vita

A virág morfogenezise egy rendkívül robusztus és szabványosított modellezési folyamat, amelyet a környezeti és az endogén jelátviteli utak kombinációja indít el. Bár jól tanulmányozták, hogy a fő szabályozó TF-k, amelyek a virágzási folyamat különböző szakaszaiban működnek, összetett szabályozási hurkokat alkotnak, szabályozási kölcsönhatásuk sokkal kevésbé egyértelmű. Különösen a virágos homeotikus fehérjék szervspecifikus GRN-i maradtak titokzatosak, mivel e tényezők potenciális közvetlen célgénjeinek csak kis részét azonosították DE-ként a virágfejlődés során. Itt megmutattuk, hogy a 15 TF DNS-kötő adat szisztematikus kombinációja a virág fejlődésében szerepet játszó szabályozó szerepekkel képes megjósolni azokat a géneket, amelyek dinamikusan szabályozódnak a virág morfogenezise során. A kapott GRN transzkripciós szabályozókkal és miRNS lokuszokkal gazdagodik. A hálózat felépítése a jól tanulmányozott FFL motívum sajátos túlreprezentációját mutatja, amelyet a TF és a miRNS együttes aktivitása közvetít.

Összefoglalva, a DNS-kötő adatok szisztematikus integrálása a genomi mRNS és miRNS expressziós adatokkal lehetővé tette számunkra, hogy azonosítsuk a GRN legfontosabb szabályozó tulajdonságait, amelyek szabályozzák a virág fejlődésének korai szakaszát, beleértve a virághéj specifikációit, valamint a szervek differenciálódását és növekedését. Meghatároztunk egy új FFL-t is, amely a virágos homeotikus fehérjék után irányítja a szirom növekedését, és értékeltük a kombinatorikus génszabályozás szerepét több TF által a doménspecifikus génexpressziós minták meghatározásában. Ezeknek a hálózati megközelítéseknek az alkalmazásával új potenciális génjelölteket azonosítottunk, amelyek felelősek a különböző virágszervek különböző morfológiáinak és méretének meghatározásáért. A jövőbeni kutatásoknak szisztematikusan kísérletezniük kell a specifikus szabályozási interakciók funkcióit, pl. A cisz-szabályozó régiók és a TFBS hely-irányú mutagenezisének felhasználása.

mód

Növényi anyagok

PAP1: AP1-GR ap1 iszapnövényeket növesztőkamrában növesztettük hosszú nappali körülmények között (16 óra világos, 8 óra sötét) 120 μmol/m 2/s fényintenzitással, miközben a hőmérséklet 22 ° C-ról változott. a nap 20 ° C-ig éjjel. A virágzatot a pAP1: AP1-GR ap1 iszapüzemekből gyűjtöttük össze (kb. 2 cm magas) csavarás után, valamint az első dexametazon-kezelés után (napi 2 μM dexametazonnal, 0,01% (v/v) etanollal és 2, 4 és 8 nappal). 0,01% Silwet L-77) mRNS-seq és miRNS-seq elemzéshez.

RNS-seq és ChIP-seq adatok elemzése

Az RNS-seq és a ChIP-seq elemzésének részletes módszertanát az 1. és 2. kiegészítő megjegyzés tartalmazza.

A miRNS és más génexpresszió elemzése

A Chen 76-ban leírt RT-qPCR törzshurok módszert alkalmaztuk a miRNS expressziójának mérésére kisebb módosítással. Részletesen, a teljes RNS-t Trizollal (Thermo Fisher Scientific, USA) extraháltuk, és az RNS-t DEPC-vel kezelt vízzel, valamint 1 μl RNSse inhibitorral (Epicenter, USA) eluáltuk. Háromszáz nanogramm DNázzal kezelt RNS-t szár-hurok primerrel (100 μm) kombinálva, 10 mM dNTP-ket és RNAáz/DNáz-mentes vizet használtunk 13,5 μl végtérfogatban a törzs-hurok transzkripcióhoz. A reakcióelegyet 5 percig 65 ° C-ra melegítettük, majd 1 percig jégen hűtöttük. A reverz transzkripció végrehajtásához Super Script III enzimet (Thermo Fisher Scientific, USA) használtunk. Az mRNS gén expressziójának kimutatásához a teljes RNS-t GenUP-Plant RNS Kit-rel (Biozyme, USA) extraháltuk, és a cDNS-szintézist M-MuLV reverz transzkriptáz (NEB, USA) segítségével hajtottuk végre. A kvantitatív PCR-t az SsoAdvanced® Universal SYBR® Green Supermix (Biorad, USA) segítségével, a CFX96 Touch® valós idejű PCR detektáló rendszerrel hajtottuk végre. Az ebben a dokumentumban használt primer szekvenciák a 8 kiegészítő adatokban találhatók.

Dual-luciferáz-vizsgálat

Hálózati elemzés

A miRNS-eket tartalmazó hálózatok robusztusságának felmérése érdekében kétféle hálózat hálózati struktúráját elemeztük és hasonlítottuk össze: a TF-irányított és miRNS-közvetített szabályozásból álló „metahálózat” és a miRNS-szabályozás nélküli hálózat. Elvileg a robusztusabb hálózat nagyobb fokú toleranciát mutat a csomópontok eltávolításával szemben. Az R NetSwan csomag swan_combinatory függvényét használtuk a csomópont eltávolítás miatti hálózatok ellenállásának kiszámításához, egy lépcsőzetes forgatókönyv segítségével távolítottuk el a csomópontokat az egymás közötti csökkenő sorrendben. A kapcsolat elvesztését és az eltávolított csomópontok töredékét ábrázoltuk (3b. Ábra).

Ezután szisztematikusan megvizsgáltuk a motívumok gazdagodását a metahálózatban. Különös figyelmet fordítottunk az autoreguláció (1 csomópont), a visszacsatolási hurok (2 csomópont) és a 3 csomópont motívumainak elemzésére, amelyeknek különös biológiai vonatkozásai vannak 51. Az 1 és 2 csomópontú hálózati motívumokat egyedi kódokkal kerestük, míg a 3 csomópontú motívumok gazdagítását az 54 FANMOD algoritmus végezte. A motívumok jelentőségét úgy határoztuk meg, hogy összehasonlítottuk a megfigyelt motívumok számát az 1000 véletlenszerűen összekevert hálózatban talált számmal, ahogyan azt a FANMOD megvalósította. Annak megállapítására, hogy egy SIM-ben két célpontnak van-e fizikai kölcsönhatása, a protein-fehérje interakció (PPI) adatait a ref. 79. Minden egyes főszabályozó esetében kiszámították a hozzá tartozó SIM-motívumokban lévő potenciális PPI-kkel rendelkező célok százalékos arányát. Kontrollként a vizsgált főszabályozóval megegyező számú gént vettünk a célgének teljes listájából mind a 15 fő szabályozóra, és hasonló százalékos értéket számoltunk, mint fent. Ennek eredményeként két százalékos értékkészletet kaptunk (n = 15), és összehasonlítottuk őket egy Student t-tesztjével (3f. Ábra).

Domain-specifikus gének meghatározása

Az AP1-, AP3- és AG-domén transzlatómadatokat (TRAP-szekvenciával) a 4. (S4) és a 6. (S6) szakaszban a ref. 62. A doménspecifikusan expresszált géneket az ANOVA határozta meg P-érték 2 doménhatással az S4 vagy S6 három domén között. Összesen 6072 gént azonosítottak ebben a lépésben, amelyek közül 2311-et (38,1%) 11 kiválasztott TF több mint egy megkötött (beleértve az AG, AP1, AP2, AP3, BLR, PI, SEP3, LFY, JAG, ETT, és RGA) és további elemzéshez használták. Egy gént AP1-specifikusnak (sepal) definiáltunk, ha erősen expresszálódott (több mint kétszeres változás) az AP1 doménben, de nem az AP3 és az AG doménekben. Hasonló szabály vonatkozik az AG-specifikus (carpel) vagy AP3-specifikus génekre is. Az AP1/AP3-közös (szirom) géneket akkor definiáltuk, ha mind az AP1, mind az AP3 doménekben magas expressziót mutattak, az AG doménben azonban nem. Hasonlóképpen meghatározták az AP3/AG-közös (porzó) géneket. Ennek eredményeként 1013 szervspecifikus gént azonosítottunk, amelyek közül 678-at a 11 TF több mint egy megkötött.

A TF-kötődés és a génexpresszió modellezése

Regresszióalapú modellt fogadtunk el a génexpressziós dinamika (678 szervspecifikus gén a fent leírtak szerint) és a TF-kötődés (11 virágszabályozó) összekapcsolására, a korábbi vizsgálatokban leírtak szerint. Pontosabban, a két szerv közötti génexpresszió redőnyös változását (FC) 11 egyedi TF kötési intenzitásának lineáris kombinációjával társítottuk, és illesztettünk egy log-lineáris modellbe:

$$ \ log _2Y_i = \ mathop \ limits_ ^ \ beta _jx_ + \ varepsilon _i, $$

ahol Y i az i gén átlagos FC-értéke S4-ben és S6-ban két összehasonlított szerv között. Az i génnél a TF j-hez tartozó TF-kötési pontszám x ij meghatározta a normalizált csúcspontszámot. A TF megkötési adatait normalizáltuk és az átlagot központosítottuk a modellezés előtt. A lasso regressziót az R glmnet csomag használatával végeztük, hogy kiszámítsuk az egyes TF közvetlen hozzájárulását (azaz a β paramétert) az expresszió változásához. Az optimális modellt tízszeres keresztellenőrzés öt ismétlésével választottuk ki az R-ben szereplő caret csomag használatával. A fenti elemzést a Shiny HTPmod 80 alkalmazással hajtottuk végre. .

Statisztikai elemzés és adatmegjelenítés

Ha nincs megadva, akkor az összes statisztikai elemzést és az adatok vizualizálását R.-ben végeztük. A t-SNE (t-elosztott sztochasztikus szomszéd beágyazás) elemzést az Rtsne könyvtár végezte el, a kimenetet pedig a HTPmod online 80-as eszközünk tette láthatóvá .hu-berlin.de/shiny/app/HTPmod /). A kaptár ábrákat a HiveR könyvtár segítségével állítottuk elő. A hálózati vizualizáció az igraph könyvtár segítségével történt.

Kód rendelkezésre állása

A ChIP-seq adatelemzési folyamat a //github.com/PlantENCODE/plantGRNs webhelyről van adaptálva. Minden más egyedi számítógépes kód ésszerű kérésre a megfelelő szerzőktől kapható.

Az adatok elérhetősége

A tanulmány megállapításait alátámasztó összes adat elérhető a cikkben vagy a Kiegészítő információk fájlokban. Az mRNS-seq és miRNS-seq adatokat az NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) GSE110539 csatlakozási szám alatt helyezték el.

köszönöm

Ezúton szeretnénk köszönetet mondani Johanna Müschnernek az RNS-seq-ben nyújtott segítségért és Lei Wang-nak a Huazhong Mezőgazdasági Egyetemtől a luciferáz-riporter génkísérletekhez nyújtott segítségért. Ezúton szeretnénk köszönetet mondani a Potsdami Egyetem Informatikai és Médiakezelési Központjának (ZIM) a nagy teljesítményű számítási erőforrások biztosításáért. A KK köszönetet mond az Alexander-von-Humboldt Alapítványnak és a Szövetségi Oktatási és Kutatási Minisztériumnak a támogatásért.