célrepertoárjának

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Fehérjeszűrés és a kialakult autoantigének áttekintése
  • Egy teljes fehérjevizsgálat új PD-célként azonosítja a PDILT-t és a MAGEB2-t
  • A MAGEB2 és a PDILT mint fő gonadal autoantigének ellenőrzése
  • vita
  • mód
  • Betegminták
  • Fehérje mező szűrés
  • Statisztikai elemzések
  • PDILT és MAGEB2 radioaktív ligandum kötési vizsgálatok
  • Digitális csepp PCR expressziós vizsgálat
  • immunhisztokémia
  • A gén ontológiai dúsításának elemzése
  • További részletek
  • További információ
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő adatkészlet
  • Hozzászólások

elemeket

absztrakt

Az 1. típusú autoimmun poliendokrin szindróma (APS1) egy monogén rendellenesség, amelyet az autoimmun betegség többféle megnyilvánulása jellemez. Ennek oka az autoimmun regulátor (AIRE) gén mutációi, amelyek elősegítik a perifériás szövet antigének ezreinek expresszióját a központi immun tolerancia meghatározása szempontjából kritikus folyamatban. Itt proteom mezőket használtunk az APS1 autoimmun célpontjainak átfogó vizsgálatához. A bevezetett autoantigének kihallgatása az autoantitestek rendkívül megbízható kimutatását tárta fel, és több mint 9000 fehérjét tartalmazó panel vizsgálatával tovább azonosítottuk a MAGEB2-t és a PDILT-t az új fő autoantigénekként az APS1-ben. A teljes proteom értékelése a szövetspecifikus immuncélok jelentős gazdagodását tárta fel, tükrözve az AIRE szelektivitását e génkategória vonatkozásában. Eredményeink azt is sugallják, hogy az APS1 immunrendszere a proteom csak egy nagyon korlátozott részét célozza meg, ellentétben az AIRE-hiányhoz társuló tímikus megnyilvánulás széles hibájával, és új kérdéseket vet fel, hogy milyen egyéb tényezőkre van szükség a tolerancia romlásához.

az eredmény

Fehérjeszűrés és a kialakult autoantigének áttekintése

Teljes méretű kép

Az APS1-ben szenvedő betegek autoimmun megnyilvánulások komplex kombinációit fejlesztik ki. Kiértékeltük a kialakult autoantitestek közötti összefüggéseket, hogy jobban megértsük, hogyan kapcsolódtak egymáshoz az egyes autoimmun válaszok. Két, egymással szorosan kapcsolódó 1-es típusú interferonhoz tartozó autoantitesteket határoznak meg; Az IFNW1 és az IFNA1 erős korrelációt mutatott (Spearman-féle ρ = 0,79). Hasonlóképpen, összefüggéseket figyeltünk meg az autoantitestek között a GAD2 és a GAD1 között (ρ = 0,70), amelyek glutaminsav-dekarboxilázok, hasnyálmirigy-szigeti sejtekben és gamma-amino-vajsavat (GABA) termelő idegsejtekben együtt expresszálódnak. Érdekes módon összefüggést találtunk a különböző enzimcsaládokba tartozó TPH1 és DCC (ρ = 0,70) között is, de mindkettő részt vesz a monoaminok szintézisében, és együtt expresszálódik a központi idegrendszer és a belek szerotonint termelő sejtjeiben. (1c. Ábra).,

Egy teljes fehérje vizsgálat új PD-célként azonosítja a PDILT-t és a MAGEB2-t

Kiértékeltük a teljes, több mint 9000 emberi fehérjét tartalmazó panelt, hogy meghatározzuk az APS1-ben szenvedő betegek fő immuncéljait. Első szűrésként kizártunk minden olyan célpontot, amely a vizsgált szérumok egyikében sem érte el 5000-nél magasabb, vagy a negatív mintában 2000-nél nagyobb jelintenzitást (csak detektáló reagenssel és szérummal nem vizsgált mező). A betegspecifikus jelek kiválasztásához ezután összehasonlítottuk a pozitív egyének gyakoriságát az APS1-ben szenvedő betegek és az egészséges kontrollcsoport között Fisher-pontos teszt segítségével (cut-off = átlagos egészséges + 3SD). A legjelentősebb jelek közül a nyomtatás során számos szennyeződést találtak és kizártak. A proteommező szűrés során a fő immuncélpontok jegyzetcsoportunkba ezután tizenegy 1. típusú interferont, további hat ismert autoantigént (IL22, TPH1, DDC, GAD1, GAD2 és GIF), transzglutamináz 4-et (TGM4) 32 és három új jelölt autoantigént - here fehérje-diszulfid izomeráz (PDILT), a B2 melanóma (MAGEB2) és MAGEB4 antigének családja expresszálja. Az autoantitest jeleket Spearman-korrelátumuk szerint csoportosítják a kötések teljes hierarchikus csoportosításával. Távolság = 1 - összefüggés.

Teljes méretű kép

A MAGEB2-t és a PDILT-t meghatározták fő immuncélpontként a proteomtéri szűrés során. A MAGEB2 autoantitesteket 51-ből 21-ben (41%) észlelték APS1 autoantitesttel és PDILT-vel 51-ből 19-ben (37%) APS1-ben szenvedő betegből, míg a kontroll csoportokban hiányoztak (cut-off = átlagos egészséges + 3 SD) ( a ). Radioligand kötési vizsgálatokat, idiopátiás meddőségben szenvedő férfiakat (n = 114) alkalmaztunk a MAGEB2 és PDILT autoantitestek ellenőrzésére a felfedezett kohorszban, 42 APS1-ben szenvedő beteg replikációs kohorszában és olyan kontrollcsoportokban, amelyek korai petefészek-elégtelenségben szenvedő nőket tartalmaztak (n = 114). = 76) és egészséges egyének (n = 91) ( b ). Összességében a MAGEB2 autoantitesteket 92 APS1-ben szenvedő 92 betegből (34%) 31-ben, idiopátiás meddőségben szenvedő férfiakban és korai petefészek-elégtelenségben szenvedő nőknél észlelték, és minden egészséges kontrollban hiányoztak. A PDILT autoantitesteket 93-ból 28-ban (30%) észlelték APS1-ben, és nem voltak jelen minden egészséges és minden kontroll betegségben (cut-off = index értéke 15).

Teljes méretű kép

A MAGEB2 és a PDILT mint fő gonadal autoantigének ellenőrzése

Digitális csepp PCR-rel igazoltuk a MAGEB2 és a PDILT mRNS szöveti eloszlását egy tizenegy emberi szövetből álló panelen. A MAGEB2 és PDILT transzkriptumokat magas szinten detektálták a hereszövetben, és hiányoztak a nem nemi nemi szövetekben (4a. Ábra és további S12. Ábra). A herékben a MAGEB2 és a PDILT sejteloszlásának meghatározásához immunfestést végeztünk emberi hereszöveten. MAGEB2 antiszérummal jelölt csírasejtek a differenciálódás minden szakaszában. A PDILT antiszérumot főleg a csíranövény lumen közelében elhelyezkedő csírasejtek egy részére festették, amely megfelel a spermatogenezis késői differenciálódási fázisának sejtjeinek, a korábbi 34 beszámolóknak megfelelően (4b. Ábra). Összességében megállapításaink azt sugallják, hogy a MAGEB2 és a PDILT az APS1 fő gonadal autoantigénje.

A MAGEB2 és a PDILT mRNS eloszlását tizenegy emberi szövetmintában digitális csepp PCR-rel vizsgáltuk. A MAGEB2 és PDILT transzkriptumokat kimondottan kimutatták a herék szövetében ( a ). A herékben a MAGEB2 és a PDILT sejteloszlásának vizsgálatához immunhisztokémiát végeztünk emberi szeminális szöveten ( b ). MAGEB2 antiszérummal festett csírasejtek a differenciálódás minden szakaszában. A nem specifikus nukleáris pozitivitást is megfigyelték. A PDILT-antiszérumot főleg a csírasejtek egy részén festették, a szemcső lumenje közelében. Negatív kontroll szerepel, ha az elsődleges antitestet festették.

Teljes méretű kép

vita

Az APS1-nek több szervi autoimmunitása és autoantitest-válasza van a különféle szövetek ellen. Bár különféle vizsgálatokban több immuncélpontot határoztak meg, az APS1 autoimmun expresszióját még nem sikerült átfogóan rögzíteni. Ebben a tanulmányban a B-sejt válaszát több mint 9000 emberi fehérje összevetésével értékeltük, hogy lehetővé tegyük az ismert autoantigének részletes profilozását és az új immuncélok azonosítását az APS1-ben. Több bevált autoantigén áttekintése rendkívül robusztus autoantitest-kimutatást tárt fel, és a teljes mező vizsgálatával további két új autoantigént, a MAGEB2 és a PDILT-t azonosítottunk, amelyeket független módszerekkel és replikációs kohorszban is meg lehetett erősíteni.

Az APS1-en és annak állatmodelljén végzett vizsgálatok rávilágítottak arra a folyamatra, amelynek során az immunrendszer megtanulja az önjelentést 12. Még mindig hiányos megérteni, hogy az AIRE-hiány központi tolerancia-hibája hogyan alakul autoimmun válaszokká, mivel az APS1 vagy Aire-hiányos egerekben korábban nem végeztek átfogó tanulmányokat az autoimmun célpontokról. A B-sejtes célok széles körű jellemzése új módszereket kínál ezen események értékelésére.

Számos magyarázatot kell megfontolni, hogy miért tűnik az autoimmun válasz egy nagyságrenddel korlátozottabbnak, mint azt az AIRE-függő antigén bemutatásának hibájától várnánk. Először is el kell ismerni, hogy az antigénfelismerés az MHC-től függ, és várhatóan csak az önantigének egy részének lesznek meg a szükséges követelményei ahhoz, hogy hatékonyan mutassák be az MHC-nek és erős immunválaszokat váltsanak ki. Figyelembe kell venni a B-sejt tolerancia és perifériás tolerancia mechanizmusok lehetséges hatásait is, amelyek további szűrőket szolgáltathatnak az autoimmun válaszok kialakulásához. Az APS1-ben szenvedő betegek közelmúltbeli tanulmányai szintén tisztázták a perifériás antigén bemutatásának szerepét az autoimmun megnyilvánulásokban 32. Megállapították, hogy a prosztata-specifikus enzimhez tartozó autoantitestek csak férfiaknál fejlődnek ki, és csak a pubertás korú prosztata érés után az autoimmun válasz kialakulásához perifériás antigén expresszió jelzésére volt szükség. A nemi dimorf autoantigénnek ez a ritka példája azt sugallja, hogy az AIRE-függő géneknek a periférián elegendő szinten kell expresszálódniuk az autoantitest-válaszok kiváltásához.

Megvizsgáltuk azt is, hogy az APS1 autoprotigének megosztják-e a funkcionális jellemzőket szövetspecifikusan, és kerestük a gén ontológia túlreprezentált kifejezéseit a képernyőn megjelenő fő immuncélok között. A leggyakrabban használt ontológiai kifejezés az aminosavak és származékaik metabolizmusára és a sejtsejtek jelzésére vonatkozik. A neurotranszmitter bioszintézis és a vitamin-kötés kifejezések gazdagodtak az immuncélpontok között (lásd az S3. Kiegészítő táblázatot).

A MAGEB2-t és a PDILT-t új fő autoantigénekként azonosítjuk az APS1-ben. Érdekes módon mind a MAGEB2, mind a PDILT specifikusan expresszálódik az ivarmirigy sejtjeiben. A MAGEB2 egy olyan géncsalád tagja, amely az X-kromoszóma érzékeny nemi forgalmának dózistól függő régiójában csoportosul, és here- szövetekben, valamint különféle daganatokban expresszálódik35. A PDILT egy here-specifikus fehérje, amely homológiát mutat a 33, 34, 41 diszulfid izomerázokkal. A PDILT egy ivarsejt-specifikus chaperon komplexben működik, amely elengedhetetlen a hím termékenységhez 41. Különösen a látszólagos here-specifikus expresszió ellenére a MAGEB2 és a PDILT autoantitestek egyaránt voltak jelen APS1-ben szenvedő férfiaknál és nőknél. Ez a megfigyelés az APS1 32 prosztata autoantigénnel szerzett tapasztalataival együtt felveti a kérdést, hogy a MAGEB2 és a PDILT kifejezhető-e női szövetekben is. A MAGEB gének valóban expresszálódnak a női csírasejtekben, és úgy tűnik, fontos szerepet játszanak a női gametogenezisben 36. Úgy gondolják, hogy sok látszólagos here-specifikus expressziójú gén expresszálódik a női ivarsejtekben is, és hogy a petefészek durva szöveti elemzése során az ovocita expresszióját könnyen figyelmen kívül hagyják. .

A MAGEB2 és a PDILT gonadal specifikus expressziója kérdéseket vet fel, hogy ezek az antigének szerepet játszhatnak-e az APS1 meddőségben. A meddőség mind az APS1-ben szenvedő férfiaknál, mind nőknél gyakori. A női meddőséget a legtöbb esetben a korai petefészek-elégtelenség és a petefészek-szteroid-termelő sejtek elleni autoimmunitás magyarázza. A prosztata autoimmunitását a közelmúltban az APS1 egyik fő megnyilvánulásaként azonosították, amely potenciális szerepet játszik a férfi meddőségének kialakulásában 32. A MAGEB2 és a PDILT azonosítása feltárja a nemi ivarsejteket mint fő immuncélpontokat az APS1-ben, és leír egy másik autoimmun komponenst, amely potenciálisan hozzájárulhat az APS1-ben szenvedő férfiak és nők meddőségéhez.

mód

Betegminták

Minden beteg megalapozott beleegyezést adott a részvételhez.

Fehérje mező szűrés

A fehérje mező szondázását és szkennelését (ProtoArray® v5.0 PAH0525020, Life Technology) az Invitrogen BioMarker immunválasz profilálási protokoll szerint hajtottuk végre az ajánlott detektáló reagens (Alexa Fluor® 647 Goat anti-humán IgG A21445, Invitrogen) és blokkoló puffer ( blokkoló puffer) pufferkészlet PA055, Invitrogen). A mezőket szérummal vizsgáltuk 1: 2000-es hígítással. A mezőket egy GenePix 4000B microarray szkennerrel szkenneltük, és a GenePix® Pro microarray szoftvert (v6.1) alkalmaztuk az összehangoláshoz és az adatgyűjtéshez.

Statisztikai elemzések

A proteomtéri adatok statisztikai elemzését log-transzformált intenzitással végeztük. Fisher pontos tesztjét alkalmazták az APS1 beteg és az egészséges kontroll csoport között eltérő fehérjetér-célok osztályozására. Egy jelet akkor tekintettünk pozitívnak, ha az intenzitás értéke meghaladja az átlagos egészséges + 3SD értéket.

PDILT és MAGEB2 radioaktív ligandum kötési vizsgálatok

A PDILT és a MAGEB2 elleni autoantitesteket radioligand kötési vizsgálatokkal mértük. A PDILT (SC306958, Origene, belépési szám: NM_174924) és a MAGEB2 (SC122625, Origene, belépési szám: NM_002364) humán cDNS-klónjait a pTNT (L5610, Promega) expressziós vektorba klónoztuk, és in vitro átírtuk és transzláltuk 35 S metionin jelenlétében TNT rendszerek). Az immuncsapást 96 lyukú szűrőlemezeken (Millipore) hajtottuk végre. Minden lemezhez pozitív standardot, ismert reaktivitású APS1 betegszérumot és negatív standardot, 4% BSA-t adtak. 30 000 CPM rádióval jelölt fehérjét és 2,5 μl szérummintát adtunk mindegyik üreghez. Az összes szérumot kétszer elemeztük. Az éjszakai inkubáció során a szérum antitesteket immobilizáltuk a protein A Sepharose (nProtein A Sepharose TM 4 Fast Flow, GE Health Care) ellen. A radioaktivitást egy mikro-béta számlálóban (1450 Microbeta Trilux, Wallac) mértük. Az autoantitest-index értékeit az alábbiak szerint számoltuk: (minta értéke/negatív standard érték)/(pozitív standard érték/negatív standard érték) × 100.

Digitális csepp PCR expressziós vizsgálat

Az Origene teljes RNS-ét a Life Technologies kettős szálú cDNS-szintézis készletével és véletlenszerű hexamerekkel (N8080127, Life Technologies) készített protokollval alakítottuk át cDNS-be az első szál szintéziséhez. A Bio-Rad ddPCR szupermixjét próbákhoz (186-3040, BioRad) alkalmaztuk, és a cseppképzést a BioRad szabványos protokollja szerint hajtottuk végre TagMan szondákkal PDILT és MAGEB2 és β2M-ként kontrollként (1206926, 4351372 és 4448489, Life Technologies). A mintákat Quantalife ddPCR gépen futtattuk, és Quantasoft szoftvert használtunk az adatok összegyűjtésére és elemzésére.

immunhisztokémia

A MAGEB2 és a PDILT festését formalinnal rögzített paraffinba ágyazott humán hereszöveten hajtottuk végre az Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával. A szövetlemezeket először Ultra V blokkkal (TA-125-UB, Thermo Fisher Scientific, Inc.) inkubáltuk 5 percig, majd anti-MAGEB2-vel (49-718, ProSci) inkubáltuk 1: 1750-es hígítással vagy anti-antioxidánssal. PDILT (HPA041923, Sigma) 1: 1000 hígítással 30 percig. A tárgylemezeket ezután 30 percig inkubáltuk jelzett torma-peroxidáz-polimerrel, majd 2x5 percig 3,3'-diaminobenzidin (DAB) oldattal. A tárgylemezeket Mayers hematoxylinben (01820, Histolab) ellenfestettük 5 percig az Autostainer XL (Leica) alkalmazásával, majd lítium-karbonát-vízzel (telített oldatból 1: 5 arányban hígítva) 1 percig öblítettük. A tárgylemezeket dehidratáltuk osztályozott etanolban, majd utólag fedjük le (PERTEX, Histolab) egy automatizált üveg fedőlap segítségével (CV5030, Leica). A diákat az Aperio XT (Aperio Technologies) automatizált letapogató rendszerrel szkenneltük.

A gén ontológiai dúsításának elemzése

A tömbben jelen levő autoantigénekhez hozzárendelt statisztikailag felülreprezentált gén ontológiai kifejezések (GOa-humán adatbázis) megtalálásához az online GOstat szoftvert használtuk 45. Annak elkerülése érdekében, hogy az interferonok a GO kifejezésen végzett dúsítási elemzés során teljesen kizárják a többi gént, az interferonokat csak az IFNA13 és az IFNW1 képviselte.

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Landegren, N. és mtsai. Az autoimmun célrepertoár egész fehérjére kiterjedő felmérése 1. típusú autoimmun poliendokrin szindrómában. Sci. ismétlés. 6., 20104; doi: 10.1038/srep20104 (2016).

További információ

PDF fájlok

Kiegészítő adatkészlet

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával elfogadja az Általános Szerződési Feltételeinket és a közösségi irányelveket. Ha bármi sértőnek vagy összeegyeztethetetlennek tűnik a feltételeinkkel vagy irányelveinkkel, jelölje meg nem megfelelőként.