emberi

  • elemeket
  • absztrakt
  • Háttér:
  • mód:
  • az eredmények:
  • következtetés:
  • A fő
  • vita
  • mód
  • GAG szigetelés
  • Baktériumok és tenyésztési körülmények
  • Sejtvonalak
  • A sejt életképességének meghatározása
  • Agglutinációs teszt
  • Sejtadhéziós kísérletek
  • Tapadás E. coli O119 a S. fyris sejtrétegekhez GAG jelenlétében
  • Statisztikai elemzés és etikai jóváhagyás
  • Nyilatkozat a pénzügyi támogatásról
  • közzététel

elemeket

absztrakt

Háttér:

A szoptatott csecsemőknél alacsonyabb az akut gastroenteritis előfordulási gyakorisága, mivel az emberi anyatejben számos fertőzésellenes tényező található. E munka célja az emberi tej glikozaminoglikánjainak (GAG) azon képességének vizsgálata, amelyek gátolják néhány gyakori kórokozó baktérium tapadását.

mód:

A GAG-okat különféle anyáktól vett tejmintákból izoláltuk a laktáció első hónapjában. Kísérleteket végeztek a GAG azon képességének tanulmányozására, hogy gátolja két bél mikroorganizmus (enteropatogén Escherichia coli 0119 szerotípus és Salmonella fyris) tapadását a Caco-2 és Int-407 sejtvonalakhoz.

az eredmények:

A tanulmány kimutatta, hogy a GAG-ok antiadhesív hatást gyakoroltak a vizsgált két patogén törzsre, különböző mértékű gátlással. Különösen a GAG emberi tej jelenlétében mindkét S. törzs Caco-2 sejtjeihez és Int-407 sejtjeihez való tapadása szignifikánsan csökkent.

következtetés:

Eredményeink azt mutatták, hogy az anyatejben lévő GAG lehet az egyik fontos védekezési tényező a szoptatott csecsemők akut hasmenéses fertőzései ellen.

A fő

Gyermekkorban különféle baktériumok, vírusok és paraziták felelősek a gasztrointesztinális fertőzésekért. Meggyőző bizonyítékok támasztják alá a szoptatás és a hasmenés alacsonyabb előfordulása közötti összefüggést. Valójában az emberi tejben számos fertőzésellenes szer található (szekréciós antitestek, laktoferrin, oligoszacharidok stb.) (1, 2). Az oligoszacharidoknak számos fontos védő, fiziológiai és biológiai szerepük van, ideértve a növekedés serkentését a hasznos bél mikrobiotikumok számára, valamint a patogének adhéziójának és immunszabályozásának gátlását (3, 4).

A glikozaminoglikánok (GAG) erősen szulfatált, komplex, lineáris természetes poliszacharidok, amelyek a diszacharid egységek ismétlődésével jönnek létre. Általában négy osztályba sorolják őket: hialuronán, keratán-szulfát, kondroitin-szulfát és d-galaktozamint tartalmazó dermatán-szulfát által képviselt szulfatált galaktozaminoglikánok, heparán-szulfáttal szulfatált glükózaminoglikánok és d-glükózamin heparin. Minden egyes diszacharid egység egy hexozamin maradékból (galaktozamin vagy glükózamin) áll, amelyet hexuronsav (glükuronsav vagy iduronsav) helyettesít, kivéve a keratán-szulfátot tartalmazó galaktózt. A szulfátcsoportokat észterezzük a szénhidrát gerincláncok különböző pozícióiban, amelyek magas heterogén szekvenciákkal és töltéssűrűségű struktúrákat eredményeznek (5).

Az oligoszacharidokkal ellentétben a GAG-ok képesek specifikusan (és specifikusan) kölcsönhatásba lépni más biológiai komponensekkel, nagyszámú szulfát- és karboxilcsoport jelenléte miatt, amelyek képesek erősen specifikus szekvenciákat létrehozni, amelyek erős anionos kölcsönhatásokat eredményeznek (5, 6, 7). Ennek eredményeként bebizonyosodott, hogy az emberi tej GAG-i oldható receptorként játszhatnak szerepet, ezért képesek gátolni a különféle kórokozók bélnyálkahártyához való kötődését, ezáltal megvédve a babát a fertőzésektől. Ezenkívül az emberi tej hialuronánjáról nemrégiben kimutatták, hogy serkenti az újszülöttek antimikrobiális védelmet (8).

Newburg és munkatársai úttörő tanulmányai után. (9), a közelmúltban jelentették be a GAG teljes mennyiségi és minőségi értékelését, mind a korai, mind a korai anyatej tekintetében (10, 11). Mennyiségileg a legmagasabb GAG-koncentrációt a kolosztrumban találták (9, 3 és 3, 8 g/l koraszülött és termikus tejben), majd az első hónap végén 4, 3 és 0,4 g/l-re történő progresszív csökkenés következett be laktáció. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a szoptatott újszülöttek naponta ugyanannyi GAG-t kapnak. Minőségi szempontból a kondroitin-szulfát, illetve a heparán-szulfát/heparin 55, ill. Az összes GAG 42% -a, míg a maradék 3% a dermatán-szulfát és a hialuronáné (12).

A tej GAG-okat az emlőmirigyben szintetizálják egy specifikus glikozil-transzferázok szekvenciális hatása révén, amelyek egy fehérje "maghoz" kötődnek és proteoglikánként szekretálódnak. A vékonybél szintjén a hasnyálmirigy-lében kiválasztódó proteolitikus enzimek hasítják a proteoglikánok "magját", felszabadítva a GAG-láncokat. Mivel a bélfal és a mikrovillusok nem tartalmaznak specifikus glikozidázokat és szulfatázokat, a szabad GAG-ek lebomlatlanok maradnak a felső gyomor-bél traktusban (13), ahol oldható receptorként működhetnek és fertőzésellenes szerepet játszhatnak, amint az az emberi tej esetében megmutatták. oligoszacharidok (14).

A vizsgálat célja annak ellenőrzése, hogy a tisztított emberi tej GAG komplex képes-e gátolni két kórokozó hasmenéses baktérium tapadását gyermekkorban, mint például az Escherichia coli és a Salmonella fyris (

A baktériumok bélsejtekhez való tapadásának gátlása glikozaminoglikánokkal (GAG). Az E. coli O119 és S. fyris tapadása (az eredeti oltóanyag százalékában) ( a ) és a Caco-2 és ( b ) az Int-407 sejteken a GAG jelenlétében (szürke sávok) és hiányában (fekete sávok). Az értékeket átlag ± SD-ként fejezzük ki. Az ábrán látható szimbólumok statisztikailag szignifikáns értékeket jeleznek a kontrollhoz képest. * P = 0, 012. ** P = 0, 0043. † P = 0, 0412.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

Az E. coli O119-gyel fertőzött Giemsa-festett sejtrétegek standard fénymikroszkópiája. Tapadás az Int-407 monorétegeken ( a ) távollét és ( b ) glikozaminoglikánok (GAG) jelenlétében: az E. coli O119 adhéziójának jelentős csökkenését figyelték meg GAG jelenlétében. Tapadás a Caco-2 monorétegeken távollétében ( c ) a ( d ) GAG: GAG jelenlétében nem figyelték meg a GAG hatását az E. coli O119 Caco-2 monorétegekhez való tapadására. Nagyítás = × 1000. Rúd = 0,01 mm.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

vita

A mikrobiális fertőzés bonyolult folyamat, amely nagymértékben függ a gazdaszervezet és a mikroba viszonyától. A tapadás általában az első lépés, amely kolonizációhoz és az azt követő fertőzéshez vezet (16). Az eukarióta sejteken és szöveteken különféle sejtkomponenseket azonosítottak a mikroorganizmusok adhéziójának célpontjaiként, és sokukat proteoglikánként jellemzik. A legújabb kutatások szerint a fehérjék helyett szénhidrátokat tartalmazó molekulák közvetítik a baktériumok kötődését az eukarióta sejtek felszínén (17). Számos szénhidrát-megkötési specifitást írtak le, és egyes esetekben az állati állati sejtekhez való bakteriális kötődést közvetlenül összefüggésbe hozták a GAG kölcsönhatásokkal (18, 19). A teljes kötési folyamat magában foglalja a sejtfelszínen elhelyezkedő szolvatált polihidroxilezett glikán és a kórokozóban lévő szolvatált fehérje-kombinációs hely (adhezin) találkozását. Az ebben a kötésben részt vevő erőket hidrogénkötés, Van der Walls kölcsönhatások, valamint töltés és dipól vonzás képviseli (20, 21), ami azt sugallja, hogy ha a glikán felülete komplementer a fehérjeegyesítő helyhez, akkor a víz kilökődhet és kötődhet bekövetkezik.

A felszínen jelen lévő receptorokat a glikoproteinek oligoszacharid-maradékai és a sejtmembránok glikolipidjei alkotják. Kimutatták, hogy ezekhez a receptorokhoz való tapadás gátolható vagy csökkenthető a sejtreceptorokéhoz hasonló szerkezetű szabad oligoszacharidok jelenlétével, így a kórokozó hozzájuk kötődik, és nem a sejtmembránhoz, csökkent patogén hatással. ig (22).

Az emberi tej oligoszacharidjainak E. coli és S. fyris elleni aktivitásáról a mai napig rendelkezésre álló adatok azt mutatják, hogy a fukozil oligoszacharidokat tartalmazó frakciók képesek gátolni az enteropatogén E. coli O119 tapadását. Ezenkívül a S. fyris-re gyakorolt ​​antiadhesiós hatást, bár meglehetősen gyenge, alacsony molekulatömegű savas és semleges oligoszacharidokkal érték el (14).

Amint azt más emberi tej (oligo) szénhidrátok esetében már bemutattuk, az exogén GAG-k a baktériumok adhéziójának kompetitív inhibitoraként mutatták ki a hatékonyságot, amelyek közül a heparint vizsgálták leginkább (3, 23). A GAG-ok lehetséges fiziológiai szerepét illetően a szoptatott csecsemők gyomor-bél traktusában fontos hangsúlyozni, hogy az emésztetlen GAG-ok a vékonybélbe kerülnek, mert a bélfalon nincsenek olyan specifikus enzimek, amelyek lebontanák őket. Ezért ezek a molekulák oldható receptorként viselkedhetnek, amelyek képesek kölcsönhatásba lépni a kórokozókkal, és versenyeznek a bélfalhoz való tapadásukért.

Ez a tanulmány megerősíti, hogy a GAG-ok hatékonyan gátolják a S. fyris Caco-2 és Int-407 sejtekhez való tapadását és az E. coli O119 csak az Int-407-hez való tapadását. Másrészt a GAG jelenléte nem gátolja jelentősen az E. coli O119 tapadását a Caco-2 sejtekhez. Az S. fyris és az E. coli O119 sejtek Int-407 sejtekhez tapadásának értékei összhangban vannak a fent megadott értékekkel, összehasonlítva a különböző sejttenyésztési konfigurációkat a bélhám modelljeként (24). Ezeknek a baktériumoknak az adhéziós aránya csökkent, amikor a sejtszuszpenziókat GAG-val együtt inkubálták, ami arra utal, hogy a GAG-k részt vehetnek a baktérium-hám sejt interakciójában.

Az E. coli O119-et és a Caco-2-hez való tapadás specifikus gátlásának hiányát illetően ez a jelenség a két sejttípusba tartozó receptorok különböző molekuláris szerkezeteivel magyarázható. Az emberi tej GAG állománya jobban hasonlíthat az Int-407 receptorokhoz, mint a Caco-2-n található GAG. Ezenkívül korábbi kutatások szerint a csökkent tapadás a fizikai gátlás helyett a tapadó fehérjék alacsonyabb szintjének tudható be (25, 26). Az Int-407 sejtekhez való tapadás különböző mértékű gátlásának mértéke a Caco-2 sejtekhez képest szintén tükrözheti a két sejtvonal eredetét (embrionális és felnőtt). Valójában a bél kórokozóinak az emberi sejtekhez való tapadásának és az enterobaktériumok citotoxicitásának vizsgálatára általánosan használt Caco-2 humán vastagbélrák sejtek fiziológiailag közelebb vannak a kórokozók természetes célpontjaihoz, mivel az enterociták, például a sejtek polaritása és az apikális határvonal 27). Másrészt az adhéziós kísérleteknél is használt Int-407 (28) emberi embrionális bélsejtek, amelyek következésképpen a receptorok molekuláris szerkezete (i) eltérhetnek a Caco-2-től.

A vizsgált emberi tej GAG-k hatékonyak, bár eltérő intenzitásúak az S. fyris és az E. coli O119 ellen. A GAG-k hatékonynak bizonyultak a GP-120 receptorhoz való HIV-kötődés gátlásában is (9). Hill és mtsai. (8) nemrégiben kimutatták, hogy az emberi tej hialuronánja gátolja az S. typhimurium sejtekhez való tapadását. A fenti eredmények azt mutatják, hogy az emberi tej GAG-i képesek külön-külön cselekedni a különböző specifikus receptorokon. Ez a hatás összefüggésben lehet az egyes poliszacharidok egyes komponenseinek heterogén összetételével, felépítésével és tulajdonságaival. A humán tej GAG azon képességével kapcsolatos jelenlegi eredményeink, amelyek gátolják az enteropatogének bélsejtekhez való tapadását, amint azt az emberi tej oligoszacharidjairól már beszámoltuk, további bizonyítékként szolgálnak arra vonatkozóan, hogy az emberi tej fertőzésellenes hatása bioaktív anyagok (makro ) molekulák, amelyek képesek megvédeni az újszülötteket a gasztrointesztinális szinten a kórokozó baktériumoktól.

Ezen eredmények alapján további kutatásokat végeznek különböző koncentrációjú GAG-ok, valamint egy tisztított komponens felhasználásával, amelyek jelen vannak az emberi tejet tartalmazó komplex GAG-okban, hogy jobban megértsék lehetséges fiziológiai szerepüket és a baktériumok adhéziós mechanizmusának gátlásában való részvételüket.

mód

GAG szigetelés

Az emberi tej GAG-jait a laktáció első hónapjában vett mintákból nyertük, és felhasználásig -20 ° C-on tároltuk. Tisztított, szabad GAG-okat kapunk és izolálunk a részletesen leírtak szerint (10). Röviden, az emberi tej egyes részeit zsírtalanítottuk acetonnal, majd centrifugálás és 60 ° C-on történő szárítás után a pelletet megfelelő pufferben oldottuk és proteolitikus enzimmel kezeltük. 10 percig tartó forralás és centrifugálás után a szabad GAG-t három térfogat etanollal kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással nyertük, 60 ° C-on szárítottuk és anioncserélő gyantával töltött oszlopon tisztítottuk. A szabad GAG-ot tartalmazó uronsav-pozitív oszlop (29) frakcióit egyesítettük, és etanollal tovább kicsaptuk. Végül centrifugálás és szárítás után a szabad tisztított komplex humán tej GAG-k tisztaságát és összetételét elemeztük, és adhéziós kísérletekhez használtuk.

A tisztított GAG-k összetételét agarózgél-elektroforézissel (30) és diszacharidok meghatározásával határoztuk meg specifikus enzimatikus kezelés után (10). A komplex GAG-k tisztasága meghaladta az 85% -ot, meghatározva az uronsav-vizsgálattal (29).