elemeket

absztrakt

A fő

Az elmúlt években kimutatták, hogy a farnesoid X receptor (FXR, más néven NR1H4), egy magi epesav érzékelő receptor, kulcsszerepet játszik az epesav homeosztázisának fenntartásában. 2, 3, 4 Az FXR részt vesz az epesav szintézisének szabályozásában a májban és az epesav transzportban enterohepatikus keringéssel. Ez a magreceptor a májban és a belekben expresszálódik, valamint más szervekben és szövetekben, például a mellékvesékben és a zsírszövetekben. 5, 6 Aktiválása után a máj FXR elnyomja az epesav szintézist azáltal, hogy transzkripciós úton lefelé szabályozza a Cyp7A1, 7, 8 enzimet, amely az elsődleges epesav szintézis kaszkád első és sebességszabályozó lépéseit katalizálja. Laboratóriumunk korábbi vizsgálata azt mutatta, hogy az FXR-null egerek a várakozásoknak megfelelően a májban megnövekedett cyp7A1 génexpressziót mutattak. Ezenkívül ezeknek az egereknek kimutatták a megnövekedett kolinsavszintézis sebességét és a kolinsav-készlet nagyobb méretét. 3

Az aktivált máj FXR gátló hatása mellett azonban a Cyp7A1-et számos más FXR-függő és független mechanizmus szabályozza. Számos ÓRA-függő transzkripciós faktor vesz részt a Cyp7A1, azaz a Dbp, a Rev-erb és az E4BP4 cirkadián expressziójának fenntartásában. 9, 10, 11 Ezenkívül érdekes egy FXR által közvetített módszer a máj Cyp7A1 expressziójának szabályozására, amelyet közvetett vékonybél szignalizáció közvetít. Az epesav által indukált bél FXR-aktiváció indukálja az egér fibroblaszt 15 növekedési faktor (Fgf15) 12 és humán ortológus FGF19 expresszióját. A legtöbb más Fgf fehérjével ellentétben az Fgf15/19 gyenge kötődési affinitással rendelkezik a heparin iránt, lehetővé téve az extracelluláris mátrixokban történő előzetes befogást. Ennek eredményeként a bélből nyert Fgf15 képes elérni a májat és endokrin faktorként hat. Májreceptorának aktiválása után az Fgf-receptor (FGFR4) 4. izotípusát, amelyhez az optimális funkcionalitás érdekében p-Klotho-t kell társreceptorként használni, a Cyp7A1 expresszió elnyomja. 14, 15

Kim és mtsai. A közelmúltban összehasonlították az epesav anyagcserét a máj- és bélspecifikus FXR knockout egerekben, hogy megvizsgálják a máj és a bél FXR-ek relatív hozzájárulását az epesavszintézis szabályozásában. Kim és mtsai 16 következtetései azonban csak viszonylag kicsi különbségeken alapulnak a génexpresszió szintjén. Ebben a tanulmányban az FXR-Fgf15 út viszonylagos hozzájárulását a máj epesav szintéziséhez nem csak a génexpressziós szintek változásainak vizsgálatával, hanem ami még fontosabb, a bél szelektív FXR deléciójának fiziológiai paraméterekre gyakorolt ​​hatásának meghatározásával foglalkozunk. mint az epeképződés és az enterohepatikus epesav-keringés kinetikája. Ezenkívül a bél FXR-Fgf15 jelátviteli útjának relatív hozzájárulását az epesav-ellátás modulációja során határozzuk meg epesav-táplálással és epesav-szekvenálással. Az Fgf15 hozzájárul az egerekben az epesav szintézisének szabályozásához, főleg a sötét fázis alatt. A keringő epesav-raktárak bővülése és az epesav-megkötés csökkenti az FXR-Fgf15 béljelzés szerepét az epesav-szintézis és az epesav-termelés szabályozásában.

AZ EREDMÉNYEK

A bélszelektív bélszelektív Fxr knockout egér jellemzői

Az Fxr és Fgf15 vékonybél mentén mRNS expressziós profilját RT-PCR-rel elemeztük. Amint az 1. ábrán látható, az Fxr mRNS expressziója várhatóan a WT egerek disztális vékonybélében volt a legnagyobb. Az Fgf15 főleg a WT egerek disztális ileumában expresszálódott, de expressziós mintázata nem egyezett teljesen az Fxr expresszióval. Az IFXR-KO egerek gyakorlatilag teljes hiányt mutattak az Fxr-ben, és a bél mentén erőteljes csökkenést (átlagos csökkenés: 82%) mutattak az Fgf15-expresszióban. Az FXR célpontokat három bélszegmensben (proximális, középső és disztális) elemeztük, és megállapítottuk, hogy alacsonyabb szinten expresszálódtak az iFXR-KO egerek vékonybélében, azaz az Ibabp és az Ost-α expresszió a disztális irány felé nőtt, és iFXR-KO egerekben a terminális ileum 87 és 49% -kal csökkent (az adatokat nem közöljük). Az Asbt ilealis expressziója, amelyről ismert, hogy az egerekben az FXR nem szabályozza, 4 disztális irányban növekszik anélkül, hogy a két csoport között különbségeket mutatna. Kimutatták, hogy az Shp, a máj fontos FXR célgénje, mindkét csoportban túlnyomórészt a vékonybél proximális részén expresszálódik, és nem volt kimutatható különbség az iFXR-KO és a kontroll egerek között.

közvetített

A gén expressziójának relatív mintázata a vékonybél mentén. Vad vad típusú (WT) hím egerek vékony belét (nyitott körök, n = 3) és hím bél szelektív FXR knockout egereket (szilárd körök, n = 3) PBS-sel mostuk, és hat szegmenst kivágtunk; 0, 33, 66, 83, 90 és 100% (relatív távolság a gyomortól a disztális ileumig). Az Fxr és Fgf15 gének relatív expressziós szintjét a 18S-hez képest RT-PCR-rel elemeztük. Az értékeket átlag ± sd-ben fejezzük ki

Teljes méretű kép

3 hónapos korban az iFXR-KO egerek test- és májtömege szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a WT alomtársak súlya (1. táblázat), de a máj és a test tömegaránya nem különbözött csoportonként. A megfigyelt testtömeg- és májtömeg-különbségek konzisztensek voltak, azaz minden korosztályban megfigyelhetők voltak 4–28 hétig, és specifikus étrendek etetése után is megmaradtak (az adatokat nem mutatjuk be és az S2 kiegészítő táblázat). A TCA által kiváltott relatíve enyhe növekedésen kívül a plazma AST és ALT aktivitásában nem volt különbség az iFXR-KO és a kontroll egerek között (1. táblázat és S2 kiegészítő táblázat). Ezenkívül nem figyeltek meg különbségeket a máj morfológiájában a csoportok között (2. ábra). Az 1. táblázat azt is mutatja, hogy az iFXR-KO egerekben a csökkent testsúly nem a csökkent táplálékfelvétel következménye. A teljes test FXR-hiányos egereknél a plazma lipidszintje megemelkedett, 3, 4 magas plazma koleszterin- és trigliceridszinttel. Ezzel szemben nem találtunk szignifikáns különbséget a plazma vagy a máj lipidtartalmában a táplálékkal táplált WT és iFXR-KO egerek között (1. táblázat).

Asztal teljes méretben

A máj morfológiája a takarmányon, 0,5% TCA vagy 2% Colesevelam HCl dúsított étrend, táplált WT és bélszelektív FXR knockout egerekkel. A máj morfológiájának szövettani vizsgálatát hematoxilin/eozin festéssel értékeltük (lásd: „Anyagok és módszerek”). A WT és a bélben kiválasztott FXR knockout egerek májmorfológiája, 0,5% TCA vagy 2% Colesevelam HCl dúsított étrend 20-szoros nagyítással jelenik meg. '*' Periportális hepatocitákat képvisel; # a pericentrális hepatocitákat jelöli.

Teljes méretű kép

A bélszelektív Fxr hiány időfüggő hatása a máj cyp7A1-re és az Fgf15 bél expressziójára \ t

A máj Cyp7A1 expressziójának jól ismert napi ritmusa, 3, 13, 23 miatt négy különböző időpontban, azaz 0100, 0700, 1300 és 1900 órakor vizsgáltuk a bél FXR hiányának a napi máj Cyp7A1 expressziójára gyakorolt ​​hatását. . Nem figyeltek meg különbségeket a nemek között (a férfi adatokat nem közöltük).

A sötét periódus kezdetén (1900 óra) a Cyp7A1 máj expressziója mindkét csoportban a legmagasabb volt, a várakozásoknak megfelelően (3. ábra). A Cyp7A1 expresszió csak éjszaka (1900 - 0700 óra) volt szignifikánsan magasabb az iFXR-KO egerekben a WT kontrollokhoz képest. A kolinsav termeléséhez szükséges Cyp8B1 expresszió nem mutatott egyértelmű változást egyik napról a másikra, és az iFXR-KO egerekben nem volt szignifikáns hatással. Ezenkívül nem figyeltünk meg különbségeket a máj Fxr és Shp expressziójában a két csoport között. Megfigyelve az IFXR-hiány ezen időfüggő hatását a Cyp7A1 expresszióra, megkérdeztük, hogy a bél FXR és Fgf15 jelátvitel hiánya transzkripciós faktorokon (Dbp, Rev-erbα és/vagy E4bp4) keresztül hat-e a Cyp7A1 cirkadián ritmusának szabályozásában. kifejezés. A 3. ábra azt mutatja, hogy ezek a transzkripciós faktorok kifejezett cirkadián profilt mutattak expressziós profiljukban, de az expressziós minták mindkét törzsben nagyon hasonlóak voltak. Csak a Dbp és a Rev-erbα mutatott megnövekedett expressziót WT egerekben egy időpontban (1900 óra), ami egyértelműen nem magyarázza a Cyp7A1 expressziójának különbségeit .

Az epesav szintézis szabályozásában részt vevő gének cirkadián expressziós profilja. A génexpressziós szinteket (összehasonlítva a 18S expresszióval) négy időpontban (0700, 1300, 1900 és 0100 óra) mértük 6-7 nőstény vad típusú kontrollban (nyitott körök) vagy női bél szelektív FXR knockout egerekben (zárt körök). Az adatokat úgy mutatjuk be, hogy a Cyp7A1 és a Cyp8B1 átlag ± sd kulcsfontosságú enzimek az epesav szintézisben, Shp az FXR és Dbp második hírvivője, a Rev-erbα és az E4bp4 részt vesz a Cyp7A1 expresszió cirkadián ritmusának fenntartásában. A '#' szignifikáns különbséget jelent a P-vel szemben

A bél gén expressziójának cirkadián profilja. A génexpressziós szinteket (18S-hez viszonyítva) négy időpontban (0700, 1300, 1900 és 0100 óra) mértük az ileocecalis záróizomhoz legközelebb eső cm 4 cm-es terminális ileumban vad típusú kontroll nőstényekben (nyitott körök) vagy női belekben - szelektív FXR knockout egerek (zárt körök); N = 4. Az adatokat átlagként fejezzük ki ± sd. Fgf15 egy növekedési faktor, amelynek expresszióját aktív bél FXR indukálja; Az Ibabp, az ilealis epesav megkötő fehérje, egy bél FXR célgén. A '#' szignifikáns különbséget jelent a P-vel szemben

Epeáramlás ( a ) és biliárdgyártás ( b - d ) vad típusú (WT) egerekben és bélszelektív FXR knockout egerekben táplálékkal dúsított táplálékkal, 0,5% TCA-val vagy 2% Colesevelam HCl-vel táplálták. TCA-val dúsított 0,5% -os vagy 2% Colesevelam HCl-tel dúsított 2% -os étrend után három, illetve 7 napig egereket (N = 5) epekanulálásnak vetettünk alá. Ennek eredményeként sikerült elérni az epeáramlást és az epeutak teljesítményét. Nyitott oszlopok: WT alomtársak, zárt oszlopok: bélszelektív FXR knockout egerek. Az értékeket átlagként ± sd '*' fejezi ki. Statisztikai szignifikanciát jelent. P # statisztikai szignifikancia (P

A bélszelektív FXR-hiány hatása a [2H4] -kolát lebontására ( a ), a tartály mérete b ), a részleges forgalmi ráta c ) és a szintézis sebessége ( d ). Az egereket epe kanülálásnak vetettük alá, a kísérleti eljárások részben leírtak szerint. ( a - d ) a vad típusú (WT) plazmában és a bélszelektív FXR knockout egerekben végzett [2H4] kolát izotóp dúsulás méréseiből származnak. N = 6 törzsenként: WT egerek (nyitott rudak) és bélszelektív FXR knockout egerek (zárt oszlopok). Az adatokat átlag ± SD # szignifikáns különbségként (P 30-szoros) és Fgf15 (> 30-szoros) expresszióként fejezzük ki a kontroll terminális ileumjában. egér. Viszonylag kis mértékben nőtt az Shp expresszió a májban, kizárólag iFXR-KO egerekben. A 7. ábra azonban a Cyp7A1 és a Cyp8B1 expresszió egyértelmű le-szabályozását mutatja mind a kontroll, mind az iFXR-KO egerekben, bár a Cyp7A1 downregulációja nem érte el a statisztikai szignifikanciát WT egerekben.

Megfigyeltük a testtömeg következetes enyhe csökkenését az iFXR-KO egerekben (

15%), amelyeket Kim és mtsai nem említettek. 16 Mivel a táplálékbevitelben vagy a széklet energiatartalmában nem találtunk különbséget (az adatokat nem közöljük), ez valószínűleg az iFXR-KO egerek energiafogyasztásának változását tükrözi. Az iFXR-hiány ezen váratlan következményeit jelenleg vizsgálják.

Köztudott, hogy a máj Cyp7A1 expressziója markáns napi ritmust mutat. Kimutatták, hogy a 3, 13, 23 Cyp7A1 expressziója kizárólag az iFXR-KO egerekben nőtt az aktív éjszakai időszakban, amikor az Fgf15 expresszió magas a WT egerekben. Mivel a máj Fxr és Shp expressziójában nem tapasztaltunk különbséget a két csoport között, az iFXR-KO egerekben a Cyp7A1 ezen növekedése azoknak az egereknek tulajdonítható, akik alacsony bélbéllel expresszálják az Fgf15-et, ami a bél FXR-hiányának közvetlen következménye, amint megerősítette. a bél Ibabp expressziójának vizsgálata. Megállapítottuk, hogy az Fgf15-n keresztüli bél FXR főleg éjszaka szabályozza az epesav szintézist, ami összhangban áll Houten és mtsai. 25, aki kimutatta, hogy a bél FXR az éjszaka folyamán a legaktívabb a transzgénikus egér FXR luciferáz riporter segítségével. 25

A Cyp7A1 expresszióra gyakorolt ​​időfüggő hatás ellenére az iFXR-KO egerek összességében megnövekedett kolinsav-készleteket mutatnak. Ennek eredményeként az epesav szekréciója megnövekedett, ami viszont fokozott epeáramlást és foszfolipid kibocsátást eredményezett. Ez összhangban áll Yu és mtsai. Ezek a szerzők arról számoltak be, hogy az Fgfr4-hiányos egerek, azaz a máj Fgf15-jelátvitele nélkül az epesav-készletek nagyobb mérete és a hepatobiliaris epesav-szekréció nagyobb arányú, mint a kontrolloké.

Enyhe epesavval dúsított étrend etetése után az epesav-szekréció mindkét csoportban megnövekedett, fokozott foszfolipid- és koleszterinszekrécióval társulva. Mivel az iFXR-KO egerekben a bél FXR károsodott, nem számítottunk a máj Cyp7A1 expressziójának csökkenésére ezekben az egerekben. Az epesavak növekedése azonban a Cyp7A1 alacsony szintű szabályozásához vezetett, amely mindkét genotípusban nem érte el a statisztikai szignifikanciát a WT egerekben és a Cyp8B1-ben. Az ilealis Fgf15 expresszió kismértékű növekedése a máj Shp expressziójának növekedésével kombinálva magyarázhatja a Cyp7A1 expresszió megfigyelt csökkenését az iFXR-KO egerekben. Ennél is fontosabb, hogy a két törzs között az epeképződésben megfigyelt különbségek többségét minimalizálták, ami azt jelenti, hogy a májon keresztüli epesav fluxus meglehetősen enyhe növekedése (+ 30%) elsőbbséget élvez a bél Fgf15 szabályozó szerepével szemben.

Az epesav megkötése után a bélrendszerben az epesav-szekréció mindkét csoportban csökkent, ami csökkentette az epe- és foszfolipidáramlást, valamint a koleszterin szekrécióját. A TCA-val dúsított étrendnek megfelelően a két törzs közötti táplálkozási állapotban észlelt különbségek többségét minimalizálták. A génexpresszió szintjén az epesav megkötése a bél Fgf15 expressziójának csökkenését okozta, ami megnövelte a máj cyp7A1 és Cyp8B1 mRNS szintjét. A WT egerekben azonban nem zárható ki a csökkent máj Shp expresszió hozzájárulása .

Vizsgálatunk azt mutatja, hogy a bél FXR által közvetített Fgf15 termelése hozzájárul az epesav szintéziséhez, különösen sötétben, amikor a bél FXR aktivitása magas. A bél FXR megzavarása megnöveli a kolinsavtartály méretét, ami fokozott epesav-szekréciót és ezáltal fokozott epe- és foszfolipidkiválasztást eredményez. Az epesav-raktárak modulálása az epesavak kiegészítésével vagy szekvenálásával a bélrendszerben minimalizálja a bél FXR-Fgf15 jelátvitelének szerepét a normál étrendi körülmények között.