absztrakt

Cél: Az oxidatív foszforiláció a nukleáris és mitokondriális DNS (mtDNS) kettős genetikai ellenőrzése alatt áll. Az oxidatív foszforilációs rendellenességek klinikailag és genetikailag heterogének, ami megnehezíti a genetikai hiba azonosítását, és a tüneteken alapuló protokollok, amelyek a klinikai tüneteket közvetlenül egy adott mtDNS génhez vagy mutációhoz kötik, elmaradnak. Ezenkívül becslések szerint az oxidatív foszforilációs rendellenességekben szenvedő gyermekgyógyászati ​​betegek kb. 25% -ának vannak mutációi az mtDNS-ben, és a gyakori mutációk és deléciók standard szűrési megközelítése csak néhány ilyen esetet magyaráz. Ezért egy új CHIP-alapú mtDNS szűrési módszert teszteltünk.

Módszerek: A MitoChip (Affymetrix) újraszekvenálást három tesztmintán és 28 betegmintán végeztük.

Eredmények: A hívási arány átlagosan 94% volt, a heteroplazmatikus detektálási szintek pedig 5-50% között mozogtak. Genetikai diagnózist a betegek majdnem egynegyedében fel lehet állítani, 4 naponta 8 teljes mtDNS-szekvencia potenciális kimenettel. Ezenkívül számos potenciálisan patogén, nem osztályozott változatot (UV) azonosítottak.

Következtetések: A hosszú hatótávolságú PCR-protokollok elérhetősége és az egyetlen nukleotid-szubsztitúció túlsúlya az mtDNS-ben a CHIP-szekvenálást nagyon gyors és megbízható módszerként szolgálják a teljes mtDNS mutációinak szűrésére.

A fő

Az oxidatív foszforilációs rendellenességek (OXPHOS) a teljes populáció közül legalább 8 000-et érintenek, és a leggyakoribb örökletes anyagcsere-betegségek csoportjába tartoznak. Az OXPHOS-hibák által okozott betegség megnyilvánulásai nagyon változatosak lehetnek, de általában nagy energiaigényű szöveteket tartalmaznak, mint például a szív, az izom, a vese és az endokrin rendszer. Számos jól ismert szindróma ismert, mint például a Kearns-Sayre (KSS) és a Pearson-szindróma, a neuropathia ataxia retinitis pigmentosa (NARP), a mitokondriális encephalomyopathia, a tejsavas acidózis és a stroke-szerű epizódok (MELAS), valamint a myoclonalis epilepszia (MER vörös) és o. ). Az OXPHOS-hibák azonban gyakoribb és kevésbé specifikus tünetekkel is megnyilvánulhatnak, mint például a 2-es típusú cukorbetegség, süketség, encephalopathia, myopathia és kardiomiopathia. Az OXPHOS-rendellenességek ezért jelentős morbiditást és mortalitást okoznak, és széleskörűen befolyásolják a közegészségügyet.

Az OXPHOS-rendellenességben szenvedő gyermekbetegek körülbelül 25% -ánál mutációk vannak az mtDNS-ben, de genetikai és klinikai heterogenitásuk miatt nehéz megtalálni őket. 3 Mivel az mtDNS mutációk száma több mint 250-re nőtt, és a klinikai specifitás elmaradt, a tüneteken alapuló protokollok nem elégségesek, és az egész mtDNS-re való szűrés előnyösebb. 4 A nemrég bemutatott MitoChip (Affymetrix) egy új módszer az mtDNS reszekciójára. 5, 6 Ebben a cikkben 28 OXPHOS-ban szenvedő betegnél végzett teljes mtDNS-szűréssel kapcsolatos tapasztalatainkat írjuk le MitoChip szekvencia alkalmazásával.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Beteg- és vizsgálati minták

Genom DNS-t izoláltak az izmokból Mullenbach et al. 3 hagyományosan szekvenált páciens DNS-ét, egy heteroplazmatikus 5 bp-os delécióval rendelkező beteget, 8 és 28 beteget analizáltunk az OXPHOS betegség klinikai és/vagy biokémiai fenotípusával a MitoChip-en. Ezek a betegek mind negatívak voltak a MELAS m.3243A> G, MERRF m.8344A> G és NARP m.8993T> C/G mutációk és a nagy mtDNS deléciók szempontjából.

MitoChip és kísérleti eljárás

Adatelemzés

Az Affymetrix GeneChip DNS elemző szoftver (GDAS) 3.0.1.3 béta verzióját a .CEL fájlok elemzésére használták a program alapértelmezett beállításainak felhasználásával. A riportfájlt a GDAS hozta létre, mindkét nukleotidvariáns listájával összehasonlítva a felülvizsgált cambridge-i referencia szekvenciával (RCRS). 4, 11 Mindkét chip-fragmens nukleotid-kihívásai közötti különbségeket manuálisan értékeltük. Az utolsó nagyobb változásokat egy szöveges fájlba ("output output file") írták. A második elemzést R, egy szabad szoftveres környezet alkalmazásával végeztük a statisztikai számításokhoz és grafikákhoz. 12 Az R elemzés során mindegyik chipet (.CEL fájl) külön elemeztük. Minden pozíciónál meghatároztuk a legnagyobb jelintenzitású nukleotidot, figyelmen kívül hagyva a háttérjelet. A nukleotid változásokat egy szöveges fájlba ("R kimeneti fájl") nyomtatták. Végül összehasonlítottuk és összevontuk a "kimeneti kimeneti fájlokat" és az "R kimeneti fájlokat", így az egyes mintákhoz egy listát készítettünk. A GDAS és R kimenetek közötti eltéréseket manuálisan, közvetlenül a chipkép megtekintésével vagy hagyományos szekvenálással értékeltük. Eltérő rendelkezés hiányában ebben a dokumentumban a „MitoChip elemzés” kifejezés a GDAS és R együttes elemzésére utal.

A heteroplazmatikus variációk és szintek validálása

A variánstartalmú fragmens mindkét szálát ciklikusan szekvenáltuk a BigDye Terminator v3.1 Cycle szekvenáló készlet, az ABI-PRISM 3100 genetikai elemző és a Sequence Analysis 3.7 szoftvercsomag segítségével. A heteroplazmatikus szintet mutáció-specifikus restrikciós emésztéssel határoztuk meg. Abban az esetben, ha egy restrikciós helyet megszereztek vagy elveszítettek, a fragmenseket az alapváltozatot körülvevő primerek segítségével amplifikálták, különben egy specifikus nem egyező primert terveztek egy restrikciós hely létrehozására. A PCR-amplifikáláshoz az utolsó PCR-ciklusban jelzett primert adtunk a reakcióhoz a PCR-termékek jelölése céljából. A jelzett PCR-termékeket megemésztettük és a fragmenseket ABI-PRISM 3100 genetikai elemzővel elemeztük a GeneScan Analysis 3.7 szoftvercsomaggal (Applied Biosystems). A heteroplazmatikus szintet úgy határoztuk meg, hogy kiszámítottuk a mutáns vagy vad típusú csúcs területének arányát (a restrikciós hely növekedésétől vagy veszteségétől függően a nukleotid variáció alapján), valamint a mutáns és a vad típusú csúcsok területének összegét. Elsődleges szekvenciák és reakciókörülmények kérésre rendelkezésre állnak.

AZ EREDMÉNYEK

MitoChip teljesítmény és ellenőrzés

mtDNS-variáció 28 betegnél

28 betegnél összesen 520 variációt találtak, amelyek közül 197 egyedi nukleotid szubsztitúció volt. Összesen 15 heteroplazmatikus variációt találtak összesen 11 betegnél. Ezen variációk közül négyet szekvenálással és mutáció-specifikus restrikciós emésztéssel igazoltunk (m.15939C> T 7% -nál, m.13513G> A 14% -nál, m.3243A> T 34% -nál és m.13042G> A 84% -nál ); kettőről kiderült, hogy egy bázis pár homoplazmatikus inszerciók (m.3229_3230insA és m.3158_3159insT); kettő hamis pozitívnak tűnt; az egyik homoplazmatikus polimorfizmusnak bizonyult (m.15452C> A); a maradék hatot nem tesztelték, mert nem tartották patogénnek. Az összes megtalált variáció közül három patogén mutáció volt ismert (1. táblázat), 114-et polimorfizmusként publikáltak (1. kiegészítő táblázat), 41 nem eredményezett aminosav-változásokat, és valószínűleg polimorfizmusok (1. kiegészítő táblázat), 39 pedig nem volt osztályozva (UV)., Amelyek közül néhány valószínűleg patogén (2. táblázat). Nyolc variánst lokalizáltunk a tRNS-molekulákban (1. ábra). Három betegnél ismert patogén mutációkat, 23 betegnél UV-detektálást végeztek. Öt betegnél csak polimorfizmusokat sikerült kimutatni.

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

alapú

Nyolc tRNS-mutációt (osztályozatlan variánsokat és mutációkat) 28 OXPHOS-ban szenvedő betegnél detektáltunk. M.3243A> T variáció a tRNS-Leu1-ben, m.4336T> C variáció a tRNS-Gln génben, m.5558A> G variáció a tRNS-Trp génben, m.5592A> G variáció a tRNS-Ala-ban gén, m .5850T> C variáció a tRNS-Tyr génben, m.12308A> G variáció a tRNS-Leu2 génben, valamint m.15890C> T variáció és m.15939C> T variáció a tRNS-Thr génben. A képeket egy emlősök tRNS-génjeinek összeállításával foglalkozó weboldalról adaptáltuk (//mamit-trna.u-strasbg.fr/index.html). 32

Teljes méretű kép

Az UV-ket értékelték evolúciós védelem, funkcionális jelentőség szempontjából, meghatározva a tRNS-re vagy a fehérjére gyakorolt ​​hatást, és ha rendelkezésre áll, a család szegregációjára. Hét UV-t helyeztek el hat tRNS-génben (1. ábra), 11 UV-t a 12S és 16S rRNS génekben, egy UV-t az mtDNS transzkripciós terminátor helyén és 20 UV-t a fehérjéket kódoló génekben. A nyolc tRNS-variáns közül (1. ábra) a tRNS-Thr gén m.15939C> T variációja heteroplazmatikus volt, 7% -os mutációs terheléssel. A többi tRNS-variáns mind homoplazmatikus volt, vagy csaknem homoplazmatikus (> 98% -os mutációs terhelés). A fehérjét kódoló gének két variációja 84% -os és 70% -os heteroplazmatikus volt az m.13042G> A esetében az ND5 génben és az m.14258G> A esetében az ND6 génben.

Egyetlen nukleotid inszerciókat is kimutattunk. A heteroplazmatikus m.3158A> T átmenet a CHIP-be azt mutatta, hogy a standard szekvenálás egyetlen nukleotid inszerció (m.3158_3159insT). Ezenkívül az m.3229_3230insA homoplazmatikus inszercióját eredetileg MitoChip-analízissel detektálták heteroplazmatikus m.3229T> A átmenetként.

VITA

MitoChip teljesítmény és ellenőrzés

MitoChip összehasonlítva más módszerekkel

Asztal teljes méretben

MtDNS variáció 28 klinikai mintában

Az ismétlés nemcsak az ismert patogén mutációkat vagy polimorfizmusokat fedezi fel, hanem az UV és a nem összefüggő patológiák, például a rák, az Alzheimer-kór vagy a Parkinson-kór kockázati tényezőit is. Mivel a variációk e második csoportjának jelentősége az egyes esetek és családjaik számára még mindig nem világos, és a kockázati tényezők nem magyarázhatják az elsődleges patológiát, egyértelmű, hogy ezeket az adatokat a klinikusoknak gondosan kezelniük kell. A betegeket tájékoztatni kell egyes megfigyelések bizonytalanságáról és az eredmények egyes értelmezésének nehézségeiről. Ez azonban szükséges, és nem mérlegeli a genetikai diagnózisokat. Ez egyúttal átmeneti probléma is lesz, mivel több információ áll rendelkezésre a semleges polimorfizmusokról, a valódi betegség kockázati tényezőkről és a valódi patogén mutációkról az együttes szekvenálási erőfeszítések eredményeként.

KÖVETKEZTETÉS

A MitoChip resequencing egy gyors, költséghatékony és megbízható módszer, nagy teljesítményű képességekkel a teljes mtDNS szűréshez. Az OXPHOS-ban szenvedő betegek negyede genetikailag diagnosztizálható ezzel a technikával úgy, hogy 28 betegben három patogén és három vagy négy valószínű kórokozó mutációt detektál, megerősítve a fenti százalékot. 3 Az mtDNS mutációk növekvő számának és a növekvő klinikai heterogenitásnak köszönhetően a MitoChip szekvencia a preferált módszer az mutációk mtDNS szűrésére, különösen akkor, ha a tünetekre jellemző szűrés és csak a leggyakoribb mtDNS mutációk szűrése nem éri el.

köszönöm

Ezt a kutatást a Princess Beatrix Alapítvány (támogatás száma: MAR99-0111) és a MitoCircle projekt (uniós támogatás, hatodik keretprogram, 005260. sz. Szerződés) támogatta.