kezelése

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • Az RNS módosításának pontos multiplex meghatározása A-tól I-ig az emberi agyban
  • Nagy szerkesztési tartomány a webhelyeken és az egyéneken keresztül
  • Szerkesztési minták a glutamaterg és a szerotonerg rendszerben
  • Differenciális rokon a használat izoformák ADARB1 ASD-ben szenvedő egyéneknél
  • Szoros kapcsolat a kódolás és a splicing között a három AMPA és filamine-A receptorban
  • Cis a ford a szerkesztési helyek közötti kapcsolatok
  • vita
  • Az adatok elérhetősége
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • További információ

elemeket

  • Epigenetika az idegrendszerben
  • RNS szerkesztés

absztrakt

A bázis-specifikus adenozin-inozin (A-I) RNS-ek konverziói, amelyeket az RNS enzim enzim adenozin-deamináz (ADAR) hajt végre, pontos regionális specifitást mutatnak az agyban, és modulálják a komplex viselkedést a modell organizmusokban. Az RNS 1-től 2-ig történő szerkesztése A-ból I-ig hatékony eszköz az RNS-komplexitás növelésére, ezáltal a génfunkciók és az adagolás finomhangolására. A sejtszintű mechanizmusok felismerik az inozint guanozinként, így az A-I kodonszerkesztési és -illesztési jelek közvetlenül módosítják a 6, 7, 8, 9, 10, 11 fehérjét kódoló gének működését, míg a mikroRNS 12, A 13., 14. és kötőhelyeik 15. megváltoztatják a génexpressziót. Ez különösen fontos az emberi agyban, a sejtdiverzitás, az összekapcsolhatóság, a morfogenezis és a környezeti ingerekre adott válaszok legösszetettebb szervében. 16.

Kevéssé ismert az emberek A-I RNS-szerkesztése, de úgy gondolják, hogy ez az egyik molekuláris mechanizmus, amely összeköti a környezeti inputokat és a viselkedési outputokat. 18, 25 Megnövekedett szerkesztés emberekben 26 más állatokhoz képest, 27 beleértve a főemlősöket is, 28 úgy tervezték, hogy kiváltsák a molekuláris komplexitást, amely a magasabb rendű ismeretek alapját képezheti. 18 Ezért az A-I szerkesztés jellemzése tipikusan és atipikusan fejlett egyéneknél fényt deríthet a környezettől függő epigenetikai mechanizmusokra, amelyek központi szerepet játszanak az emberi idegsejtek fejlődésében.

Az autizmus spektrum rendellenességei (ASD; MIM 209850) komplex genetikai etiológiájú, nagyon öröklődő, gyakori neurodevelopmentális rendellenességek, amelyeket a kölcsönös társadalmi interakció hiányai és az ismétlődő viselkedés jellemeznek. 29 Számos tanulmány jellemzi az ASD szinaptikus rendellenességeit. 29, 30, 31, 32 A gén-környezet kölcsönhatások mechanizmusai és azok hozzájárulása a megfigyelt szinaptikus változásokhoz azonban még mindig nem ismert. A jelölt gének száma gyorsan, 33, 34, 35-rel növekszik, és a fő kihívás az a kontextus azonosítása, amelyben kockázatot jelentenek az ASD-re nézve. A legújabb ikervizsgálatok azt sugallják, hogy a környezeti tényezők hozzájárulása az ASD-hez nagyobb, mint azt eredetileg gondolták, alacsonyabb a monozigóta megegyezés becslése (77–88%) és meglepően magas, 31% -os dizygotikus egyezés (szemben a testvérek 19% -os megismétlődési arányával) . ). 36, 37 Ezért az ASD szempontjából releváns gén-környezet kölcsönhatásokat szabályozó mechanizmusok meghatározása informatív lehet a kockázatértékelés szempontjából. Az A-ról I-re történő RNS-szerkesztés potenciálisan egy ilyen mechanizmus, amely egyesíti a környezeti ingereket a szinaptikus transzmisszióval.

Számos bizonyíték támasztja alá az A-I és az ASD kiigazítások közötti kapcsolat vizsgálatát. Először is, a megváltozott AII szerkesztéssel rendelkező modell organizmusok az ASD, 2, 39 jellemző maladaptív viselkedést mutatnak, néha 1, 40 rohamokkal vagy Prader-Willi tünetekkel, amelyek közül 41 általában az ASD-s gyermekek 25% -ában található meg., 42, 43 Másodszor, a HTR2C szerotoninreceptor megváltoztatott szerkesztését találták az autizmus 44 egérmodelljében, valamint olyan rendellenességekben, amelyek az ASD, 45 családokban aggregálódtak, beleértve a 46-os skizofréniát és a súlyos depressziót is. 47 Harmadszor, a Fragile X szindróma repülési modellről, amely az ASD 48 leggyakoribb egyetlen gén oka, a közelmúltban kimutatták, hogy a módosításokban jelentős változásokat mutat a Fragile X dFMR1 gén és a dADAR szerkesztő enzim közötti közvetlen interakció révén. 49 Végül a független genomikai vizsgálatok a szinaptikus gének variánsait vonják maguk után, amelyek a legtöbbet szerkesztett gének, 17 mint visszatérő téma az ASD-ben. 29, 30, 31, 32

Itt a neurodevelopmentálisan szabályozott A-I szerkesztésre koncentrálunk, amely közvetlenül megváltoztatja a szinaptikus funkciót. Pontosan számszerűsítjük és összehasonlítjuk az egyének közötti szerkesztési szinteket, és jellemezzük az emberi agyban ható 10 szinaptikus gén különböző szerkesztési országait, ellentétben az agyakkal, amelyek az ASD-től szenvedő egyedektől izolált agyú, tipikusan fejlett egyedektől származnak. Ezután (i) specifikusan megvizsgáljuk a glutamaterg és a szerotonerg rendszerek módosulási mintáit, (ii) a módosításokat korreláljuk izoformák segítségével, és (iii) azonosítjuk a korrelált helyek klasztereit. Fontos megállapítani, hogy az ADARB1 szerkesztő enzim diszfunkcionális formájának relatív használata szignifikánsan magasabb az ASD-ben.

az eredmény

Az RNS módosításának pontos multiplex meghatározása A-tól I-ig az emberi agyban

Ez a megközelítés olyan adatkészletet nyújtott, amely nagy megbízhatósággal szinaptikus RNS-t szerkesztett A-tól I-ig ASD-s egyénektől és a megfelelő neurotípusos egyedektől, átlagos konfidencia intervallum hossza 95% (CI) 0,0338. A független validáláshoz ugyanazt a cDNS-t és gDNS-t elemeztük párhuzamos befogással és szekvenálással.> 3000 × Illumina hat helyen minden egyén között (további információk). A két kiigazítási detektálási módszer szoros összefüggését a 4. kiegészítő ábra és a 4. táblázat mutatja, átlagos korrelációs együtthatóval 0,923.

Nagy szerkesztési tartomány a webhelyeken és az egyéneken keresztül

25 helyszín korrekciós szintjét határozottan mértük, és megállapítottuk, hogy 2,5 és 99,6% között mozog (1a. Ábra és 5. kiegészítő ábra). A beállítási szintek váratlanul széles eloszlását találták a neurotípusos egyének és az ASD-vel gondosan illeszkedő egyének között azokon a helyeken, amelyek korábban 23 egérben neurodevolúciósnak bizonyultak (átlagos variációs koefficiens (CV) 54,8%). Csak egy helyszínen, a GRIA2 Q/R-ben mutattak hasonló kiigazítási szinteket minden egyén számára (CV = 0,5%), összhangban azzal a jelentéssel, hogy ezen a helyen szükségesek a módosítások, és a fejlesztés során változatlanok. 23, 65 Nem találtak összefüggést a kiigazítás szintje és az életkor, a nem, a faj, a post-mortem intervallum vagy az RNS integritása között (6. ábra).

ASD-s egyének a 25 népesség közül 20-ban a népesség eloszlásának extrém eloszlásában. ( a ) A webhelyek átlagos korrekcióinak magas dinamikus tartománya, 99,6% -kal a kimutatási határ alatt. A lilával ábrázolt Sd oszlopok a gondosan párosított egyedek közötti neurodevelopmentálisan szabályozott szerkesztés nagy változatosságát jelzik. b ) Az összes SD átlagos kiigazítási szintjének egyéni SD-je azt mutatja, hogy a népesség-kiigazítás eloszlásának szélsőségei általában ASD-vel (narancssárga háromszögekkel) rendelkező egyének, és jelentősen hozzájárulnak a cikkben említett nagy változékonysághoz. a ). A vízszintes vonalak az egyén hátsó kiadásának standardizált 95% -os CI-eloszlását jelzik. A szinaptikus kiigazítás szintje, legalább két sd az átlagtól, nagyon informatív az ASD-vel kapcsolatban, pozitív prediktív értéke 78%.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

Az egyéni hátul beállítási sűrűségek ellenőrzésénél az összes lokalizáción (5. kiegészítő ábra) észrevettük, hogy a legtöbb kezelési eloszlás szélsőségei ASD-s egyének. Ennek a megfigyelésnek a számszerűsítéséhez az egyes helyszínek kiigazítási szintjeinek becsléseit az egyes helyeken Z-ponttá alakították, és a 2 vagy  - 2 értékeket szélsőségesnek tekintették, amelyek az átlagtól legalább két sd-t kitevő kiigazítási szinteket jelentenek. A 25 helyszín közül 20-nál az ASD-vel rendelkező egyének a szélsőséges módosítási spektrumban voltak megfigyelhetők az adott helyen (1b. Ábra). A szinaptikus szerkesztés extrém szintjei rendkívül informatívak az ASD-vel kapcsolatban, pozitív prediktív értéke p (ASD || Z szerkesztés |> 2) 0, 78. A különböző helyeken szereplő outlierek különböző ASD-s egyének (5. és 7. kiegészítő ábra) és Az átlagtól háromnál több sd-n végzett kiigazítások ASD-s egyénekre voltak specifikusak (7. kiegészítő ábra). Az ASD teljes szerkesztői varianciája több mint kétszeresére nőtt a neurotípusos egyénekhez képest (ASD variancia = 0,58, az ugyanolyan nagy alcsoportok neurotípusos varianciája = 0,24, Brown-Forsythe P = 5, 6e-3). A fokozott diszperzió fő oka az ASD-ben szenvedő betegek 30% -a (8. kiegészítő ábra).

Szerkesztési minták a glutamaterg és a szerotonerg rendszerben

Ezenkívül azokat a szerkesztési mintákat, amelyekről kimutatták, hogy szerepet játszanak az ASD-ben, kifejezetten megvizsgálták a glutamaterg és szerotonerg rendszerekben. A 29., 66., GRIK2, amelynek genomi lokuszát többször összekapcsolják és társítják az ASD-vel, három helyen módosul, ennek eredményeként nyolc fehérje-izoform képződik, amelyek különböznek kalcium-permeabilitásukban. 23 A GRIK2 differenciális szerkesztését ASD-s és neurotípusos egyedek között a 2. ábra mutatja, egy helyen és a teljes izoform szintjén egyaránt. Kolmogorov-Smirnov vizsgálattal értékeltük a különbségek jelentőségét a folyamatos mérésekben, például azokban, amelyek a neurotípusos és az ASD egyedek szintjét állítják be. Pearson 2. tesztjét használtuk olyan diszkrét eloszlások összehasonlítására, mint a kombinatorikus RNS-kezelés eredményeként kapott GRIK2 vagy HTR2C izoformák száma. A GRIK2 izoformák relatív gyakorisága szignifikánsan különbözött az ASD-ben szenvedő és a neurotípusos egyének között (P

Különbségek a mediált GRIK2 izoformák szerkesztésében a neurotípusos (kék) és az ASD-s (narancssárga) egyedek között. A GRIK2-et három helyen szerkesztik: I/V, Y/C (a TM1 mindkét része) és Q/R (TM2), amelyek megváltoztatják a kalcium receptor permeabilitását. Megállapítást nyert, hogy ezeken a helyeken a korrekciók szorosan összefüggenek egymással (5b. Ábra). ( a ) A GRIK2 kiigazítások nagy változékonysága az összes helyszínen, minden egyén között. A megfigyelt nyíróspektrumok szélsőségei ASD-s egyének. További részletekért lásd az 5. kiegészítő ábrát. b ) A három hely együttes kezelése nyolc különböző molekuláris tulajdonságú izoformát eredményez. Jelentős csoportkülönbségeket azonosítottunk a GRIK2 izoformák eloszlásában az ASD-s egyének és a neurotípusos egyének között (P 2, 6), amelyek mindegyike alulreprezentált az ASD-ben (3. ábra). Az ASD varianciája azonban sokkal nagyobb, mint a neurotípusos és az ASD közötti szórás egyének azt javasolják, hogy ezt a megállapítást körültekintően mérlegeljék, és nagyobb mintanagysággal értékeljék újra.

A HTR2C izoformák relatív számának különbségei ASD-s és neurotípusos egyének között (P 2 teszt). Öt HTR2C hely kombinatorikus módosításával előállított lehetséges 24 izoformából 21-et detektáltunk. A legnagyobb különbség az IDV, az MNV és az ISI izoformákban mutatkozott, amelyek mindegyike több mint kétszeresére nőtt az ASD-ben.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

Az ADARB1 izoform differenciális relatív használata ASD-s egyénekben

Különbségek az ADARB1 inaktív formájának relatív használatában az ASD-s és neurotípusos egyének között (P = 3, 0e - 3, Mann - Whitney U-teszt). Ennek az izoformának nincs enzimkötő kettős szálú doménje, és bebizonyosodott, hogy nem transzlálódik. 68 Az ADARB1 az ebben a vizsgálatban elemzett helyek domináns szerkesztő enzime. ( a ) Az ADARB1 izoformák (NR_027672, 122 bp termék) (NR_027672, 122 bp termék) (AD_BB) relatív gyakoriságának mérésére szemikvantitatív reverz transzkripciót használtunk primerek (fekete háromszögek) segítségével, amelyek mindkettőt kimutatták. b ) A diszfunkcionális ADARB1 izoform átlagos relatív gyakorisága 46,3 ± 5,6% volt ASD-ben és 26 ± 4,5% neurotípusos egyéneknél, hasonlóan a neurotípusos emberi agyban korábban megfigyelt gyakorisághoz. 68 Ez az elemzés az RNS módosítási felmérésbe bevont mind a 25 mintát is magába foglalta. A diszfunkcionális izoform relatív gyakorisága korrelál az általános beállítási szintekkel (Pearson P = 3, 2e - 2). Ezenkívül a diszfunkcionális forma bőségét TaqMan® génexpressziós tesztekkel számszerűsítettük ASD-ben szenvedő alanyokban (P = 7, 3e - 3, Mann - Whitney U-teszt, 12. kiegészítő ábra), szignifikáns korrelációval a kvantitatív és a szemikvantitatív PCR eredmények (Pearson's P = 2.0e-5).

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

Szoros kapcsolat a kódolás és a splicing között a három AMPA és filamine-A receptorban

Hosszú 454 leolvasást (2. ábra) használtunk az emberi RNS-módosítás szabályozási jellemzőinek tanulmányozására, ideértve a korábban megjósolt 6, 69 összefüggéseket a három AMPA (GRIA2, GRIA3 és GRIA4) és a filamine-A szelekciója és a kódoló szelekció között. (FLNA) receptorok. A GRIA2, GRIA3 és GRIA4 két egymást kizáró exont tartalmaz, amelyek modulálják az anesztézia kinetikáját, úgynevezett flip és flop. 7 Az exon 3'-végén lévő, közvetlenül a flip/flop modul előtti beállítások szorosan összefüggtek a flop izoformával GRIA4-ben (valószínűségi arány (OR) = 101,9 (95% CI 87, 8–118, 2)), GRIA3 ( OR = 30, 6 (26, 8–34, 8) és kisebb mértékben GRIA2 (OR = 2, 6 (2, 4–2, 8); az összes P érték

Kapcsolatok a szerkesztések és a kivágások, valamint az oldalak között. ( a ) Az exon 3'-végén közvetlenül a flip/flop modul előtti módosítások szorosan összefüggenek a flia izoformával GRIA4-ben (OR = 101, 9 (95% CI 87, 8–118, 2)), GRIA3 (OR = 30, 6 (26, 8–) 34.8)) és kisebb mértékben GRIA2 (OR = 2, 6 (2, 4–2, 8); a P 0, 97 összes értéke, Fisher pontos tesztje), míg A GRIA2 Q/R −4 teljesen kiigazítatlan, a GRIA2 Q/R teljesen módosult és a GRIA2 Q/R +4 az egyének között változóan módosult, 4 és 17% között.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

A kódolás és a splicelés egy másik összefüggését az FLNA-ban vizsgálták, ahol kiderült, hogy a 43. exon 3'-végén lévő módosítások szignifikánsan korrelálnak a 43-as intron retenciójával (Pearson P 0, 7 a fürt összes helypárja között, A legerősebb korrelációt mutató klaszter négy gént (GRIA2R/G, CYFIP2 K/E, GRIA3R/G-1 és GRIK2 I/V, Q/R és Y/C) hat gént tartalmazott ( Pearson r = 0,8, P 0, 97, 5c. Ábra és az 5. kiegészítő táblázat), amely azt jelzi, hogy elrendezésük térben térben eltér és/vagy különböző komplexek közvetítik.

vita

Ez a tanulmány az A-I RNS ASD-módosításának, a gén-környezet interakció egyik formájának kezdeti vizsgálatát jelenti, amely finomhangolja a szinaptikus funkciót a környezeti ingerekre adott válaszként. A szerkesztésen átesett emberi gének gyakrabban vesznek részt a neurodevelopmentális rendellenességek által érintett folyamatokban, a 17, 18 és az A-I-I összességében nő az emberi vonalon. 26, 27, 28 Bár kevéssé ismert az RNS-módosítás emberre gyakorolt ​​hatása, vannak meggyőző bizonyítékok arra, hogy az A-I-módosítás kulcsszerepét támasztják alá az állatok komplex viselkedésének modulálásában. 1, 2, 3, 41, 44, 70 A megváltozott kondicionáló egerek és legyek több viselkedési homológot összegeznek az emberi ASD-vel szemben. 1, 41, 44 A génspecifikus állatkísérletek ok-okozati összefüggést mutatnak be a módosulási szintek és a specifikus maladaptív viselkedés között, 1, 10, valamint a specifikus környezeti expozíció és a módosulás szintje között. 71 Az itt bemutatott eredmények tehát tisztázzák egy olyan epigenetikai mechanizmus szerepét, amely egyesíti a környezeti jeleket és a későbbi viselkedési eredményeket, valamint integrálja a genetikai és környezeti információkat.

Az adatok elérhetősége

A kezdeti szekvenciaolvasásokhoz való hozzáférés megtalálható a Nemzeti Autizmus Kutatási Adatbázisban NDARCOL0001951 csatlakozási szám alatt.