Genetikailag jelentős aberrációk myelodysplasztikus szindrómában szenvedő betegeknél és azok kimutatásának módszerei

Absztrakt:

A mielodiszplasztikus szindróma (MDS) a klonális hematopoietikus csontvelő betegségek heterogén csoportja. A betegséget hatástalan vérképzés, a vérsejtek diszpláziás változásai és a citopénia jelenléte határozza meg a perifériás vérben. A betegek általában idősebbek, és a betegek kb. 30% -a később akut mieloid leukémiává (AML) alakul át. A klónikus kromoszóma rendellenességeket az elsődleges MDS-ben szenvedő betegek körülbelül 50% -ában és a másodlagos MDS-ben szenvedő betegek több mint 80% -ában észlelik. A specifikus kromoszóma-rendellenességek alapján megjósolható a beteg prognózisa, a teljes túlélés és a megfelelő kezelés. A betegek vizsgálatához és ezen rendellenességek igazolásához citogenetikus kariotípusanalízist, fluoreszcencia in situ hibridizációt (FISH) és multiplex ligációtól függő szonda amplifikációt (MLPA) használtunk.

genetikailag

Kulcsszavak: myelodysplasticus szindróma, kromoszóma-rendellenességek, diagnosztika

* A cikk részét képező összes táblázat, grafikon és ábra a tanulmány végén található csatolt PDF fájlban található.

Az MDS okai

Az MDS kifejlesztése egy többlépcsős folyamat, amelynek során változások következnek be a pluripotens hematopoietikus őssejt genetikai anyagában. Morfológiailag és funkcionálisan különbözik, és növekedési előnyt szerez. Az MDS patogenezisének mechanizmusa jelenleg nincs teljesen tisztázva, feltételezhetően a növekedést, a differenciálódást és a sejthalált szabályozó gének érintettségét vonja maga után. A megváltozott sejt szaporodik, és a klónok fokozatosan pótolják az egészséges őssejteket, ezáltal csillapítva vagy leállítva a normális vérképzést (4). Kétféle MDS-t különböztetünk meg - elsődleges és másodlagos. Az elsődlegesről akkor beszélünk, amikor a betegség oka ismeretlen. Ez az összes MDS 85% -át képviseli, és főleg az idős népességet érinti, átlagosan 60-70 éves korban. A primer MDS előfordulása az utóbbi években növekszik, a jobb diagnosztikai módszerek, a népesség öregedése és a környezeti tényezők miatt (5). Másodlagos MDS esetén (

15%) tisztázhatjuk a betegség okait. Többféle lehet, például kemoterápia, sugárkezelés vagy a környezeti toxinok hatása (6).

A betegség előrejelzése

A betegség lefolyása nagyon változó, a legkönnyebb formáktól, amelyek átlagos túlélése több év, és a legsúlyosabb formáktól, amelyek túlélése kevesebb, mint 5 hónap (7). A prognózis szempontjából számos prognosztikai rendszer létezik, amelyek a betegeket a kapcsolódó jellemzők alapján kockázati kategóriákba sorolják (8). Jelenleg használatban van Felülvizsgált Nemzetközi prognosztikai pontozási rendszer - IPSS-R, amely a betegeket 5 kockázati kategóriába sorolja a prognosztikai jelentőséget jelző specifikus paramétereknek megfelelően, és amely szerint a kezelést elvégzik. Az IPSS-R magában foglalja az i MDS Cytogenetikus pontozási rendszer (1. táblázat), amely meghatározza a beteg prognosztikai csoportját a kariotípus citogenetikai eredményei alapján (9).

Kromoszóma-rendellenességek

A kromoszóma-rendellenességek fontos szerepet játszanak a betegség patogenezisében, prognózisában és diagnózisában. Az elsődleges MDS-ben a betegek 40-60% -ában számoltak be róluk. A másodlagos MDS-ben szenvedő betegeknél általában több a genotípus változása, a kromoszóma-átrendeződések akár 80-90% -ban is megfigyelhetők (6). Egyszerre több mint három aberrációval járó komplex kariotípus a de novo MDS körülbelül 15% -ában figyelhető meg, szemben a másodlagos MDS 50% -ával (10).

A leggyakoribb változások közé tartozik del (5q)/- 5, 01507/del (7q), +8, del (20q) a –Y. Nem gyakori, –17/del (17p)/i (17q), –18/del (18q), +21, +19, inv/t/del (3q), –13/del (13q), –21, t (5q), +11, + 1/+ 1q, del (12p), del (11q), t (7q), + mar és mások (7.11).

A sejtek jelenlegi változásai alapján feltételezhetjük a betegség prognózisát. Jó prognózisú betegeknél normális kariotípust találunk, vagy csak egyszerű változásokat. A betegség lefolyása enyhe, hosszan tartó, több éves túléléssel és a kezelés többnyire tüneti. Minél rosszabb a prognózis, annál rövidebb a beteg túlélési ideje, a különböző genetikai változások jelen vannak, és annál nagyobb a leukémiás transzformáció valószínűsége (12).

Módszerek a genetikai változások kimutatására

1. Citogenetikai elemzés

A kromoszómák citogenetikai elemzése az egyik alapvető módszer az aberrációk kimutatására. Ez lehetővé teszi a kariotípus numerikus és strukturált rekonstrukcióinak nyomon követését. A módszer nagy előnye, hogy minden kromoszómát egy nézetben vizsgálhat. Hátránya, hogy a módszer kimutatási határa alatt nem lehet azonosítani a szubmikroszkópos változásokat, és ugyanakkor szükség van metafázisokra.

2. FISH módszer

A fluoreszcencia in situ hibridizáció (FISH) elterjedt módszer a citogenetikai laboratóriumokban, és előnyei közé tartozik a sejtek elemzésének lehetősége nemcsak metafázisban, hanem interfázisban is, amikor sejttenyésztés nem szükséges. További előny a nagyszámú sejt gyors elemzése. Ugyanakkor lehetővé teszi az aberrációk kimutatását a citogenetikailag negatív esetek mintegy 15% -ában, és segít tisztázni a komplex rekonstrukciókat. A módszer korlátozó tényezője, hogy csak azokat a DNS-szakaszokat lehet azonosítani, amelyekben próbákat alkalmaznak. A releváns kimutatáshoz a mintában az aberrált interfázisos magok legalább 1-5% -ának kell lennie.

Asztal 1. MDS citogenetikai pontozási rendszer (9, módosítva)

3. MLPA elemzés

A FISH-hez hasonlóan a Multiplex ligáció-függő próba-amplifikációs (MLPA) módszer az oligonukleotid-próbák megkötését egy cél DNS-szekvenciához használja komplementaritásuk alapján. A FISH-szal ellentétben ez a módszer több mint 40 különböző DNS-szekvencia azonosítására képes egyetlen reakcióban (13). Az MLPA módszerben használt szondák rövidebb hosszúságúak (50 - 70 bp), és lehetővé teszik más klinikailag releváns MDS rendellenességek érzékeny detektálását alacsonyabb gyakorisággal. Az MLPA előnye azoknak a szekvenciáknak a differenciálása, amelyek egyetlen nukleotid-különbséggel különböznek egymástól. A technika hátránya, hogy a rendellenességek megbízható kimutatásához a mintában legalább 30% mutált sejtnek kell lennie (14).

Munkánk célja a következő volt:

  1. Hozzon létre és elemezzen egy genetikai osztályunkon megvizsgált MDS-diagnosztizált betegcsoportot a 2016. februártól áprilisig tartó időszakban
  2. Határozza meg a kromoszóma-rendellenességek jelenlétét, jellemezze azokat, határozza meg előfordulási gyakoriságukat a csoportban, és ossza meg a betegeket a jelenlegi rendellenességek szerint.
  3. Értékelje a teszt eredményei és a prognózis közötti kapcsolatot.
  4. Meghatározni az egyes módszerek hozzájárulását a kromoszóma-rendellenességek értékeléséhez és összehasonlítani az alkalmazott módszerek sikerét - klasszikus citogenetika, FISH-módszer és módszer

Betegpopuláció és módszerek

Olyan betegeket vontunk be MDS diagnózissal, akiket genetikai laboratóriumunkban 2016. február és 2018. április között vizsgáltunk. A beteg felvételének kritériuma az orvos kérésére elvégzett diagnózis volt. Összesen 620 betegmintát elemeztünk, amelyek közül 383 csontvelő (KD) és 237 perifériás vér (PK) minta volt. Ebben a munkában a következő módszereket használtuk: citogenetika, FISH és MLPA.

A kariotípus vizsgálati készítményeket úgy állítottuk elő, hogy a KD sejteket 24 órán át teljes tápközegben tenyésztettük, és standard eljárások szerint dolgoztuk fel. 360 betegnél lehetőség szerint 20 metafázist elemeztek, és meghatározták a citogenetikai rögzítést az ISCN (International System of Chromosoma Nomenclature) szerint. A FISH módszerben kiindulási anyagként a beteg tenyésztett KD-jét és/vagy PK-ját alkalmaztuk. Ezt követően a megfelelő próbával végzett hibridizáció és a készítmények értékelése fluoreszcens mikroszkóppal történt. Összesen 521 mintát, 380 KD és 141 PK értékeltünk. Az MLPA elemzéséhez használt alapanyagként az EDTA-ban szállított KD és/vagy PK mintából izolált DNS-t izoláltunk. A SALSA MLPA P414-B1 MDS probemix kitet (MRC - Hollandia) 46 specifikus kromoszóma régió kimutatására használtuk 122–469 nukleotid amplifikációs termékekkel. A szondákat az MDS-ben az IPSS-R szerinti leggyakoribb és prognosztikailag releváns aberrációkra tervezték. Ez a módszer 398 beteget (214 KD és 184 PK) vizsgált.

Az eredmények

1. Betegcsoport jellemzése és elemzése

A készlet 620 beteg csontvelő- vagy perifériás vérmintáit tartalmazza, és 289 (46,6%) férfi és 331 (53,4%) nőből áll. A betegek medián életkora a diagnózis felállításakor 69 év volt, 13 és 93 éves kor között. A csontvelőmintából vizsgált betegeknél az esetek 36% -ában voltak patológiák, a perifériás vérmintából csak az esetek 14% -ában.

1. Kromoszóma-rendellenességek előfordulása

383 beteg csontvelőmintájának eredményei alapján, amelyeket citogenetikailag, FISH és/vagy MLPA-val vizsgáltak, jellemeztük, majd meghatároztuk a leggyakoribb rendellenességek előfordulását. Összesen 287 kromoszóma-rendellenességet észleltünk, a betegek 99% -ában legalább két vizsgálati módszert alkalmaztunk. A grafikon az aberrációk egyedi ábrázolását mutatja a genom izolált rendellenességeként és más rendellenességekkel kombinálva bekövetkező rendellenességekként.

2. A betegek prognózisának meghatározása

383 beteg prognózisát és medián túlélését citogenetikával, FISH-val és/vagy MLPA-val nyert csontvelői minták elemzésének vizsgálati eredményei alapján határoztuk meg. Értékelték az egyes betegek reprezentációját a prognosztikai csoportokban és azok teljes túlélését.

A statisztikus Kaplan-Meier módszerrel kiszámítottuk a medián túlélést 351 beteg esetében, akiktől rendelkezésre álltak információk a túlélésről, ill. halál. Sikeresen meghatároztuk a mediánt a csoportokban: közepes, rossz és nagyon rossz. A nagyon jó és jó csoportokban a betegek túlélése magasabb volt, prognózisuk szerint a túlélés valószínűsége nem esett 0,5 (50%) alá. Ezért nem szereztünk releváns adatokat, mivel a betegek nagy része még mindig életben van. A grafika azt mutatja, hogy rosszabb prognózis esetén a betegek túlélése is csökken. BAN BEN a 3. táblázatban az egyes kockázati csoportok adatainak összefoglalása. Megjelenik a csoportokban a betegek száma, a halálozások és a csoportban élők száma, valamint a csoport túlélési százaléka.

3. Az alkalmazott módszerek sikerének meghatározása

80 beteget vizsgáltak egyszerre mindhárom módszerrel. Ezt a fájlt használták az alkalmazott módszerek sikerének összehasonlítására. Összehasonlítottuk az egyes módszerek sikeres elemzéseinek számát, amelyek legalább egy chroanalysis-t megerősítettek. Bebizonyosodott, hogy ez a legérzékenyebb módszer az aberrációk jelenlétének kimutatására. A kariotípuselemzés 60 esetben (75%) volt pozitív. Az MLPA szűrési módszer összehasonlítható sikert mutatott a citogenetikai analízissel. Pozitív eredményt rögzített 59 betegnél (74%).

Vita

Az MDS túlnyomórészt idős emberek betegsége, amelynek diagnózisa pillanatában átlagosan 70 év volt, az 50 év alatti csoport

A betegek 10% -a (2). Vizsgálatunkban a medián életkor 69 év volt, az 50 év alatti betegek száma pedig 15% volt. Az MDS előfordulása a 60 év feletti kor előrehaladtával gyorsan növekszik. Greenberg és munkatársai (9) szerint a betegek legfeljebb 77% -a 60 évnél idősebb a diagnózis idején. Munkánk során a 60 év feletti betegek 74% -át tették ki.

A szokásos elemzésekhez 383 csontvelő mintát és 237 perifériás vérmintát használtak. A csontvelőmintából vizsgált betegeknél 138 (36%) esetben voltak patológiák, a perifériás vérmintából csak 34 (14%) esetben. Az irodalomban a betegek csontvelőjében a patológiák kimutatásáról 37-55% tartományban számoltak be (9,11,12). A többi beteg negatív eredményt kapott. A teljes perifériás vér rendellenességeinek kimutatására vonatkozó vizsgálatok nem állnak rendelkezésre. Eredményeink alapján kijelenthetjük, hogy a csontvelő alkalmasabb biológiai anyag elemzésre, mint a perifériás vér. Itt jelentkezik maga a betegség, nagyobb a kóros sejtek előfordulása, és ezáltal az aberrációk nagyobb mértékű kimutatása.

Az oka annak, hogy alacsonyabb medián túlélési értékeket kaptunk, és nem értünk el eredményeket a nagyon jó és jó prognózisú csoportok esetében, rövid követési periódus lehet. Eredményeink megerősítették, hogy a prognózis romlásával a betegek teljes túlélése lerövidül.

Összehasonlítottuk az alkalmazott diagnosztikai módszerek sikerét is. Értékeltünk egy olyan betegcsoportot, akiket mindhárom módszerrel egyszerre vizsgáltak. A betegek nem tudtak negatív eredményt találni, és a módszereknek legalább egy rendellenességet kellett kimutatniuk. Kimutatták, hogy a FISH módszer a legérzékenyebb a patológiák jelenlétének kimutatására. Az esetek 85% -ában sikeresen kimutatta a patológiát. A FISH nagy érzékenységgel és specifitással rendelkezik a DNS célterületére nézve. 100 kB-tól 1 Mb-ig terjedő felbontással észleli a rendellenességeket, de csak a kromoszóma azon részét rögzíti, amelyben a szondát használják. A kariotípus-analízis (75%) és az MLPA-módszer (74%) hasonló sikert mutatott. A kariotípusanalízis numerikus és strukturális aberrációkat rögzít egyszerre az összes kromoszómán körülbelül 5 Mb kimutatási határig, és korlátozza a sejtek sikertelen tenyésztése a táptalajban (20).

Ugyanakkor az MLPA módszer 46 specifikus terület átvilágítását teszi lehetővé, amelyek kevésbé frekvenciás MDS-rendellenességeket is tartalmaznak. Korlátja azonban, hogy nem képes kiegyensúlyozott genetikai átrendeződéseket megragadni, és a mintában érintett sejtek legalább 25-30% -ára van szüksége (21).

Következtetés

Az MDS előfordulása jelenleg növekszik Európában, és várhatóan évente 25 000 új esettel növekszik. Ennek oka nemcsak a népesség elöregedése, hanem a környezeti szennyezés növekedése is. Ezért nagyon fontos a betegek pontos diagnózisa, a prognózis helyes meghatározása és a megfelelő terápia későbbi beállítása. Ma az aberrációk diagnosztizálásában szokásos genetikai módszereket alkalmaznak, mint például a kariotípus citogenetikai vizsgálata, FISH módszer és MLPA elemzés, amelyek mindegyikének megvan a maga egyedi helye, és kölcsönös kombinációjuk garantálja a lehető legtöbb aberráció megragadását a MDS betegek.