szolgáltatások

  • absztrakt
  • A fő
  • Sertések mint kísérleti modell
  • Cisztás fibrózis
  • Pigment retinitis
  • rák
  • Sertések létrehozása géntechnológiával
  • NSRRC
  • import
  • Az egészségi állapot levezetése és ellenőrzése
  • A minták és az élő állatok megoszlása
  • A PI által generált, genetikailag módosított egyedi modellek
  • krioprezerválás
  • Kutatás és kutatás térítés ellenében
  • következtetések

absztrakt

A disznók biomedicinális modellként egyre fontosabbak. A sertések és az emberek közötti hasonlóságok miatt az emberi egészség és betegség alapvető biológiájának jobb megértése a sertésekből származhat, nem pedig a klasszikus rágcsálók modelljeiből. A sertésmodellek iránti növekvő igény miatt elengedhetetlen, hogy a tudományos közösség elérhetővé tegye genomikai eszközöket, modelleket és szolgáltatásokat. Közülük sok elérhető a Nemzeti Sertésforrások és Kutatás Központján (NSRRC) keresztül, amely a Missouri Egyetem amerikai egészségügyi intézete által finanszírozott létesítmény. Az NSRRC célja, hogy magas színvonalú modelleket nyújtson az orvosbiológiai sertések számára a tudományos közösség számára.

A fő

A géntechnológiával módosított állatmodellek példátlan előrelépést tettek lehetővé az orvosbiológiai kutatások terén. Számos organizmust használnak genetikailag módosított modellek előállítására, mint például egerek, patkányok, juhok, szarvasmarhák 1 és sertések 2. Mindezek a fajok olyan információkat szolgáltattak, amelyek értékesek az alapvető biológia, valamint számos emberi betegség patogenezisének megértéséhez. Egyes modellek azonban korlátozzák az emberi betegség vagy szindróma összegzésének képességét. Például az egerek és a patkányok nem az optimális állatmodell az emberi szem tanulmányozásához vagy ortopédiai műtét elvégzéséhez, a szem vagy a csont és az ízületek méretének korlátai miatt. Ezenkívül a klasszikus rágcsáló modellek nem mindig összegzik teljesen az emberi betegségeket, mint például a cisztás fibrózis (CF) 3. .

A sertések biomedicinális modellként számos előnnyel rendelkeznek más fajokkal szemben, és optimális modellnek tekintik őket a xenotranszplantáció, a környezeti szennyező anyagok kockázatának felmérése és a gyógyszer felfedezése szempontjából. Sok szempontból a sertés anatómiai, fiziológiai és patofiziológiai szempontból jobban hasonlít más modellekhez; filogenetikailag a sertések nukleotid szinten háromszor közelebb vannak, mint az egerek 4. Jelenleg hatalmas mennyiségű információ áll rendelkezésünkre a sertésekről a mezőgazdaságban történő felhasználásuk után, amelyek az anatómiájának és fiziológiájának minden aspektusát lefedik, az alapvető genetikai válaszoktól kezdve a környezeten át az alkalmazott szempontokig, például a tartásig 5. Ezen túlmenően számos olyan fejlődést tudunk alkalmazni az orvostechnikában, amelyet emberek számára fejlesztettek ki a sertésmodellben, például a mágneses rezonancia képalkotást és a pozitronemissziós tomográfiai letapogatást, és a sertéseken rendszeresen végeztek sebészeti képzést. Ebben az áttekintésben megvitatjuk a sertések, mint biomedicinális modell értékét, valamint olyan genomiális eszközöket és szolgáltatásokat, mint az NSRRC, amelyek rendelkezésre állnak annak megkönnyítésére az emberi egészség és a betegség kutatásában.

Sertések mint kísérleti modell

Noha természetes állapotában kiváló modell, a sertések legnagyobb hatása az orvosbiológiai közösségben valószínűleg abból adódik, hogy egy adott emberi betegség géntechnológiai modelljeként játszik szerepet. Itt három esetet tárgyalunk, amelyekben a géntechnológiával módosított sertések előnyös modellnek bizonyultak.

Cisztás fibrózis

A CF autoszomális recesszív rendellenesség, amelyet a CFTR gén olyan mutációja okoz, amely szabályozza az anion transzportját. A CF-ben szenvedő emberek körülbelül 70% -ában a CFTR mutáció a CFTR 3 fehérje 508 aminosavat (fenilalanint) kódoló három bázispárjának deléciója. A CF tünetei közé tartozik a nyálkaelzáródás (meconium ileus), a blokkolt hasnyálmirigy-csatornák, a merevített epehólyag és a tüdőbetegség 3. Amikor a CFTR gént egérmodellben mutálják, az anioncsatorna nem működik, de klasszikus CF tüneteket nem észlelnek. Ha azonban a mintaállat emberi s mutációjú disznó (azaz az 508-as fenilalanin deléciója), akkor a malacok 100% -ánál klasszikus CF-tünetek jelentkeznek, beleértve a meconium ileust, a májelváltozásokat és a tüdőbetegségeket3. A jelenlegi sertésmodellt a tüdőbetegségek invazív vizsgálatára használják új terápiák kifejlesztése érdekében.

Pigment retinitis

A sertésmodellek domináns szerepet játszanak a retinitis pigmentosa (RP) 11 vizsgálatában. Az RP egy emberi autoszomális domináns rendellenesség, amelyben a betegség általános formája abból adódik, hogy a hisztidin a RHO gén 23. pozíciójában lévő (233) aminosavval helyettesíti a prolint. Az RP-t az éjszakai vakság kezdete, a perifériás látás elvesztése, majd a központi látás elvesztése jellemzi 12. 2012-ben Ross és mtsai. 13 kifejlesztett egy beltenyésztett miniatűr sertésmodellt az RP számára, amely megismételte az emberi fenotípust. A humán RHO gén P23H mutációjával rendelkező humán transzgént véletlenszerűen beillesztettük a sertés genomjába, és számos fenotípust kaptunk13. Bár több más RP modell is összefoglalja a betegséget, a sertés modell előnye a sertés és az emberi szem közötti biológiai hasonlóság. Ennek a sertésmodellnek további előnye, hogy a sertések beltenyésztett miniatűr genetikai háttere megkönnyíti a sejtterápiák fejlesztését. A kutatók nagy mennyiségű oltást injektálhatnak a sertések szemébe, lehetővé téve számukra a sejterápiák hatásainak tanulmányozását az elutasítás zavaros hatásai nélkül 14. Ezt a modellt számos kísérletben alkalmazták, például annak meghatározásában, hogy a kurkumin-kiegészítő képes-e megállítani vagy késleltetni a rúd fotoreceptorok degenerációját. .

rák

A rák olyan betegségek nagy gyűjteménye, amelyekre jellemzően a kóros sejtnövekedés jellemző. A KRAS-ban levő mutációk az emberi rákok mintegy negyedét, a p53-as mutációk pedig további harmadát teszik ki. Kidolgoztuk a sertésrák indukálható modelljét, egy floxifikált stop kodonnal a csirke béta-aktin promoter és a KRAS G1D2 és p53 R172H mutáns formái között. Ez a sertésrák-modell lehetővé teszi tumorok indukálását bármely szövetben vagy szervben azáltal, hogy CRE rekombinázt adunk be a kívánt szövetbe. A CRE elősegíti a rekombinációt két loxP hely között, és eltávolítja a stop kodont. A stop kodon eltávolítása a két rákot kiváltó gén transzkripciójához és ezt követő transzlációjához vezet. Az alapító állatokból izolált sejtekkel végzett első in vitro munka során kiderült, hogy a transzgén működőképes volt, amikor az adenovírust használták Cre eljuttatására a sejtekhez in vitro. A sejtmorfológia, az osztódási idő és a sejtmigrációs idő a rákmodell sejtvonalában különbözött a 16. kontrollvonalaktól. Ezenkívül az adeno-Cre-indukált sertésrák-modell sejtjeivel injektált 14 egérből 12-ben mérhető daganatok alakultak ki. Végül a daganatokat adeno-Cre indukálta a sertés KRAS G1D2 és p53 R172H 16 három különböző helyén .

Sertések létrehozása géntechnológiával

A sertésgenom genetikai módosításainak előállítására szolgáló technológiák jelentősen fejlődtek az elmúlt három évtizedben. Történelmileg a sertések génmódosítását úgy hajtották végre, hogy transzgéneket adtak a genom véletlenszerű helyeihez. Mikroinjekciós technikával genomi konstrukciókat illesztettünk be a 17 pronukle zigótákba, ami véletlenszerű inszerciós eseményekhez vezetett, amelyek 18 inszerciós mutációkat okozhattak. Az inszerciók előfordulhatnak a transzgén egy vagy több másolataként, amelyek a genom egy vagy több helyén integrálódnak. Az inszerció véletlenszerűségén túl néhány injektált transzgén csak a zigóta hasítása után, azaz a kétsejtű szakaszban integrálódhat. A kétsejtes szakaszban az integráció a genom különböző helyein (vagy egyáltalán nem) a két blasztomerben előfordulhat, mozaik embrióhoz és állathoz vezetve 19. Ha a két blasztomer utódai másképp járultak hozzá a csíravonalhoz, akkor a transzgén átkerülhet az utódokba vagy sem. De még ezeknek a figyelmeztetéseknek a ellenére is, a prukleáris injekcióval történő transzgenezis még mindig hatékony eszköz új fehérjék termeléséhez a sertésekben.

A sertés géntechnológiájának legújabb és legfontosabb eredményei a géntechnológiai technológiák, például a cink és az ujj 29, 30 nukleázok, a transzkripciós aktivátorszerű effektor nukleázok 31, 32, 33 alkalmazása, valamint a rendszeresen elosztott, rövid palindrom ismétlődések csoportosulása. Cas9 rendszer (CRISPR/Cas9) 34. Ezek az eszközök rendkívül hatékonyak, és úgy tervezhetők, hogy ne hagyjanak genetikai nyomokat, például egy szelektálható markert. Valójában a CRISPR/Cas9 rendszer annyira hatékony, hogy a zigótákba történő befecskendezés (ha az egyes CRISPR-ek előre be vannak állítva) azt eredményezheti, hogy az összes utód módosítja az allélokat 34. A CRISPR/Cas9 rendszer lehetővé tette számunkra a sertés genomjának szerkesztését a gének törlésével és a donor DNS-inszerciók célzásával; sőt lehetősége van a genom egyik bázisának módosítására. Az új génmódosítási technikáknak köszönhetően elképzelhető, hogy a sertésekben gyakorlatilag bármilyen módosítást vagy módosítások kombinációját létrehozzák, eltávolítva ezzel a fennmaradó genetikai akadályokat, amelyek a múltban korlátozták felhasználásukat.

NSRRC

Asztal teljes méretben

import

Sok kutató már kidolgozott modelleket speciális alkalmazásokhoz. A vonal fenntartása és a más nyomozók kéréseinek megválaszolása azonban nehéz lehet a független létesítmények számára. Az NSRF tehermentesítheti a vizsgálati donor terhet az elosztási terhetől. A meglévő modellek adományozhatók az NSRRC-nek, ahol fenntartják és elérhetővé teszik más kutatók számára. A nyomozók adományozhatják az NSRRC modellt, feltéve, hogy a modell szabadon terjeszthető nonprofit intézmények más nyomozóinak. A vizsgáló donor megadta az NSRRC-nek a modellhez szükséges információkat, például a genetikai módosítást (ha van ilyen), a fenotípust, az egy évre várható kérelmeket vonalanként, egészségi állapotot és a törzs hátterét. Az NSRRC Tanácsadó Bizottsága majd meghatározza, hogy az adományozott modellt elfogadják-e a központban. A felvételkor a nyomozó és az NSRRC meghatározzák az adományozási mintát. A tipikus adományok vagy fagyasztott minták, például spermiumok, specifikus sejttípusok gyűjtése klónozás vagy krioprezerválás céljából, vagy élő állatok formájában, ha az egészségi állapot lehetővé teszi.

Az egészségi állapot levezetése és ellenőrzése

Az összes NSRRC modell egy szabványos házban vagy speciális kórokozóktól mentes létesítményünkben található. Az NSRRC által adományozott modelleket ezeknek a kórokozók eltávolító létesítményeinek egyikéhez visszavezetik a donor intézménytől. Az újraszármaztatás számos módszerrel végezhető, amelyek magukban foglalhatják a tiszta császármetszést, az embriótranszfert, az inszeminációt vagy a szomatikus sejtek nukleáris transzferjéhez használt sejteket. Az állatok rutinfigyelése a létesítményeinkben az újraszármazás előtt, alatt és után biztosítja, hogy az NSRRC modelljei a legmagasabb egészségügyi előírásokkal rendelkeznek. Az egészséget olyan betegségek figyelemmel kísérik, mint a sertés reproduktív és légzőszervi betegség vírusa, a Leptospira, a Mycoplasma hyopneumoniae, a sertés cirkovírus II, valamint újabban a sertés vírus és a delta-coronavirus. Az egyéb betegségek vizsgálata a fő kutató (PI) kutatási programjainak megfelelően fejlődik és fejlődik. Példa erre egy citomegalovírus teszt kifejlesztése és validálása, mivel a másodlagos citomegalovírus fertőzés a páviánnak átterjedő sertésszervek meghibásodásához vezethet 35. Számos kórokozó monitorozását az NSRRC által kifejlesztett vizsgálatok segítségével végzik a széklet-, orális vagy vérminták belső vizsgálatára.

A minták és az élő állatok megoszlása

A sertések sok helyen rendelkezésre álló korlátozott felszereltsége és szakértelme miatt az NSRRC konkrét mintákat tud nyújtani anélkül, hogy a vizsgálónak meg kellene újítania a meglévő infrastruktúrát és szakértelmet. A nyomozó kérheti az NSRRC-n keresztül elérhető összes sertésmodellt. A modellek eloszthatók sejtekként, szövetekként, szervekként vagy élő állatokként. Az NSRRC-n keresztül elosztott mintákra a 2. táblázat ad példát. Amikor a kutató mintákat kér, az NSRRC felkészíti az állatokat a mintavételre. Az NSRRC munkatársai által vett minták esetében a megkereső nyomozót felkérik, hogy nyújtson be részletes mintavételi jegyzőkönyvet, valamint a szállítás körülményeinek részleteit. A megkereső nyomozó az NSRRC létesítményében felkeresve személyesen is mintákat vehet.

Asztal teljes méretben

A minták mellett élő állatok is kioszthatók a megkereső kutatóknak. Az állatokat speciális vizsgálatok, új terápia vagy mintavétel céljából intézményekbe lehet küldeni. Az intézmények állatokat is elfogadhatnak saját tenyésztelepük létrehozására. Az élő állatok általában legkorábban 4-5 hetes korban hagyják el az NSRRC-t, ezért az állatokat elválasztják és szilárd táplálékon történő szállítás előtt megkezdik; bizonyos helyzetekben azonban újszülötteket szállíthatnak. Az NSRRC a megkereső nyomozóval és a fogadó intézménnyel együttműködve meghatározza az állatok szétosztásának legjobb módját, és biztosítja, hogy a befogadó intézmény egészségi állapota ne sérüljön.

A PI által generált, genetikailag módosított egyedi modellek

Bármely vezető kutató felkérheti az NSRRC-t egyedi sertésmodell kidolgozására. Ha a nyomozót az NIH finanszírozza, az NSRRC jelenleg ingyenesen elkészítheti ezt a modellt a megkereső nyomozó számára; a modell jellemzése után azonban szabadon terjed. A modellek szétosztása miatt az NIH PI-támogatásra vonatkozó NIH megosztási politika kötelessége teljesül. Azok a PI-k, akik nem rendelkeznek NIH-finanszírozással, saját modelleket is igényelhetnek, de ezekben az esetekben modellünket a tanácsadó bizottságunk értékeli. A szükséges modellnek meg kell felelnie a következő kritériumoknak: több tudományterületen is használható, és valószínűleg nagy a kereslet. Ha a tanácsadó bizottság elutasítja a modell iránti kérelmet, vagy ha a kutató korlátozni kívánja a modell terjesztését, szolgáltatási díjak alapján kérhető gyártás. Az NSRRC munkatársai a modellezés minden területén segíthetnek a tervezéstől és a fejlesztéstől az alapító állatok gondozásáig. Jelenleg génmódosító eszközöket (CRISPR/Cas9) használunk a szükséges modellek közül sok előállítására 34. Az NSRRC általában három-öt modellt gyárt évente.

krioprezerválás

Az összes géntechnológiával módosított és vad típusú állat plazmáját sokféle formában tartják fenn, beleértve az embriókat, a szomatikus sejteket és a spermiumokat. A krioprezerválás biztosítja az NSRRC számára a vonalak folyamatos termelés nélküli fenntartását, valamint a betegség kitörése miatti katasztrofális veszteségek megelőzését. A vonal karbantartásának biztosítása érdekében a másodlagos mintákat a helyszínen kívül tárolják a másodlagos tárolóban. A mélytartósított mintákat el lehet küldeni a megkereső kutatónak, hogy állatokat hozzon létre a létesítményükben. Ezenkívül az NSRF a vizsgálatot végzőnek géntechnológiával módosított sertésmodelljéhez krioprezervációs és tárolási szolgáltatásokat nyújthat; azok, akik nem akarják adományozni modelljeiket, továbbra is igénybe vehetik a szolgáltatásokat, de a szolgáltatási díjak alapján.

Kutatás és kutatás térítés ellenében

Az NSRRC olyan kutatásokat végez, amelyek a termelékenység javát szolgálják funkcióinak ellátása szempontjából. Az NSRRC kutatást végez a géntechnológia, a szomatikus sejtek magtranszferje, a krioprezerválás és az egészségügyi monitoring teszt fejlesztése területén. Ezenkívül az NSRF segítséget nyújt a nyomozóknak orvosbiológiai kutatási projektjeikben. Az NSRRC munkatársai és a megkereső nyomozók megvitatják a projektet annak megállapítása érdekében, hogy az NSRRC végezhet-e kutatást a létesítményében. A nagyon igényes projektek és a nagyon speciális felszerelést igénylő projektek végrehajtása nagyobb igényeket támaszthat az NSRRC számára, és előfordulhat, hogy a megkereső IM létesítményében kell végrehajtani. A nyomozó és az NSRRC megvitatják a projekt befejezéséhez szükséges költségvetést és időkeretet is.

következtetések

Az elmúlt évtizedben jelentősen megnőtt a sertések használata az emberi egészség és betegségek modelljeként. Akár természetes állapotban, akár géntechnológiával módosítva alkalmazzák, a sertésmodellek válnak a választott biomedicinális modellekké, nagyrészt annak köszönhetően, hogy növekvő képességük van összefoglalni a különböző emberi betegségeket. Az egész országban korlátozott szakértelemmel és felszereléssel a központi erőforrásközpont iránti igény elsődleges fontosságúvá vált. Az NSRRC-t azért hozták létre, hogy az értékes sertésmodellek adattáraként szolgáljon az orvosbiológiai kutatások számára, és a sertésmodellek fenntartásának és terjesztésének terheit a kutatóról nemzeti erőforrásra helyezte át. Ezenkívül az NSRRC létrehozza és terjeszti saját PI-modellek által létrehozott sertéseit. Azért vagyunk itt, hogy segítsünk a sertéskutató közösségnek megalapozni az orvosbiológiai kutatásokat.