mikrobiota

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • A TNBS egerekben vastagbélgyulladást és memóriazavart okozott
  • EC károsodott tanulási és memóriazavarok egereknél
  • LJ gyengítette a TNBS vagy EC által kiváltott vastagbélgyulladást és memóriazavarokat
  • A bél mikrobiota összetétele megzavarta a TNBS-t és az EC-t
  • Az EC-ből izolált LPS felgyorsította az egerek memóriazavarát
  • vita
  • mód
  • növekményekkel
  • Sorozatsor archívum
  • További információ
  • Word dokumentumok
  • További információ

elemeket

  • Immunológiai memória
  • fertőzés
  • Gyulladásos bélbetegség
  • mikroflóra

absztrakt

A bélmikrobiot és a központi idegrendszer (CNS) között intenzív és kiterjedt kétirányú hálózatokat az endokrin, az ideg- és az immunutak tartanak fenn. 1, 2 A stressznek, például a kórokozóknak való kitettség stimulálja az agyat a hormonok - például a kortikotropin-felszabadító faktor - szekretálásával a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyen keresztül, ami megzavarja a bél mikrobiotikumát, a permeabilitást és a gátló funkciót, és növeli az endotoxin termelést. mint pl lipopoliszacharidok (LPS). 3, 4 Ezenkívül ezek az endotoxinok, amelyek a bakteriális kémiai komponensek részét képezik, serkentik a bél immunválaszát, és korlátozzák a szerotonin és a katekolamin neurotranszmitterek szekrécióját. 5, 6, 7 Ezek a neurotranszmitterek, citokinek és hormonok elősegítik a bél immunrendszerének (a bél mikrobiotjához kapcsolódó) és a központi idegrendszer közötti kommunikációt és fenntartják a homeosztázist. 5, 6 Ezeknek a jeleknek a diszregulációja vastagbélgyulladáshoz, autizmushoz és elhízáshoz vezet. 8, 9

Ebben a tanulmányban, mivel a stressz a vastagbélgyulladás révén indukálhatja az LPS-szintet, és mivel az LPS befolyásolhatja a központi idegrendszer működését, teszteltük hipotézisünket, miszerint a vastagbélgyulladás-induktorok a bél mikrobiota összetételének megzavarásával gyomorhurutot és memóriazavarokat okozhatnak, és megvizsgáltuk, hogy a bél mikrobiotikus összetételének ingadozásai a a vastagbélgyulladás induktor fokozhatja a vastagbélgyulladást és a memória romlását egerekben.

az eredmény

A TNBS egerekben vastagbélgyulladást és memóriazavart okozott

Ebben a vizsgálatban a TNBS intrarektális beadása egerekben a vastagbél megrövidülését, a myeloperoxidase (MPO) aktivitás növekedését okozta, gyulladásos markerek expresszióját indukálta, beleértve az indukálható nitrogén-oxid szintázt és a ciklooxigenáz-2-t, valamint fokozta az NF-κB aktivációt a vastagbélben (ábra ). 1a - ca további S1a kép online). A TNBS a vastagbélben szűkül ZO-1, claudin-1 és occlusin csatlakozással elnyomta a fehérjék expresszióját. A TNBS növelte az Enterobacteriaceae, különösen az Escherichia coli (EC,> 75% Enterobacteriaceae) számát, de csökkentette a Bifidobacteriumok és Lactobacillusok számát, beleértve a Lactobacillus johnsonii-t (LJ) is (1d, e ábra). A TNBS-kezelés fokozta a bél mikrobiota LPS termelését (1f. Ábra). A TNBS-kezelés tovább növelte a vér LPS és TNF-α szintjét, valamint a vér TNF-α hip-ampampális szintjét (1g-i ábra). A TNBS-kezelés jelentősen csökkentette a tanulási és memória-viselkedést az Y labirintusban és a passzív elkerülési feladatokban is (1j, k ábra). A TNBS emellett NF-κB aktivációt indukált a hippokampuszban, és elnyomta az agyi neurotróf faktor (BDNF) expresszióját és a cAMP válaszelem-kötő fehérje (CREB) foszforilációját (11. ábra és további S1b ábra).

L. johnsonii (LJ) gyengítette a 2,4,6-trinitrobenzolszulfonsav (TNBS) által kiváltott vastagbélgyulladást és károsította a memóriát. A tanulást és a memória viselkedését az Y labirintus szerepében értékelték ( a ). Az agyi eredetű neurotróf faktor (BDNF) expressziót és a nukleáris faktor (NF) -KB aktivációt mértük a hippokampuszban immunblottolással ( b ). A vér lipopoliszacharid (LPS) szintjét a Limulus teszt ( c ). Vérszint ( d ) és a tumor hippocampalis nekrózis faktor (TNF) -α ( e ) enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) mértük. A colitis markerei, beleértve a vastagbél rövidülését ( f ), vastagbél myeloperoxidáz (MPO) aktivitások ( g ) és az NF-κB aktiválása, valamint a nitrogén-oxid-szintáz (iNOS) és a ciklooxigenáz (COX) -2 ( h ) és az i) szoros junction fehérje expressziót mértük a vastagbélben. Az értékek az átlag ± sd-t jelzik (n = 10). * P

A 2,4,6-trinitrobenzolszulfonsav (TNBS), az E. coli (EC) és az L. johnsonii (LJ) hatása az egerek mikrobiota bélösszetételére. Hatás a törzs szintjére ( a ) és a családok ( b ). A fehérjebaktériumok és a gyomirtók aránya (P/F) ( c ), Bacteroidetes - Firmicutes (B/F) ( d ) és a fehérjebaktériumok Bacteroideteshez (P/B) ( e ) bakteriális 16S rRNS fragmensek piroszekvenálásával elemeztük. ( d ). f ) A fő koordináta-elemzés (PCoA) grafikonja. A grafikonon az egyedüli vivőanyaggal (NOR), egyedül TNBS-sel, egyedül EC-vel, LJ-vel EC (EC + LJ) kezelésével kezelt egerek csoportosulása látható az UniFrac súlyozott, párosított gyors elemzése alapján. Hatás az Enterobacteriaceae ( g ) és Bifidobacteriumok + Lactobacillusok ( h ) szelektív táptalaj tenyészetével mértük. Fekete, szürke és fehér oszlopok ( g ) jelzik az EC, K. pneumoniae és P. mirabilis összetételét. Az értékek az átlag ± sd-t jelzik (n = 5). * P

mód

A bélbaktériumok tenyésztése. Az egér bél mikrobiotájából izolált LJ-t és EC-t tenyésztettük GAM táptalajban (BD, Radnor, PA) és MRS (BD), BL és DHL szelektív táptalajban (Nissui Pharm, Tokió, Japán). Röviden, LJ-t és EC-t 0,5 liter GAM táptalajban tenyésztettünk 37 ° C-on (optikai sűrűség 600 nm-nél 1,0-1,2), centrifugálással (5000 g 20 percig) gyűjtöttük és kétszer sóoldattal mostuk. Az összegyűjtött sejteket (5x109 CFU ml -1) sóoldatban (sejtkísérletekhez, 72 ° C-on 30 percig melegítjük) vagy 1% -os glükózban (orális beadás céljából egereknek) szuszpendáljuk.

A bél mikrobiota szelektív táptalajon történő elemzéséhez a friss vastagbél (

Mindegyik csoportból 0,1 g-ot sterilizált műanyag tartályokba gyűjtöttünk, gondosan szuszpendáltunk 9 térfogatú hígítóban, egymás után 10-szer hígítottuk, és közvetlenül oltottuk a vér máj táptalajára (BL, Bifidobacteria/Lactobacilli-szelektív táptalaj, Nissui Pharm) és hidrogénre. szulfát-laktóz táptalaj (DHL, Enterobacteriaceae-szelektív táptalaj, Eiken Chem, Tokió, Japán). 41 DHL agarlemezt tenyésztettünk aerob módon 1 napig 37 ° C-on, a BL agarlemezeket pedig anaerob módon tenyésztettük 3 napig 37 ° C-on.

Az LJ-t és az EC-t olyan kolóniákból választottuk ki, amelyeket lényegében BL-ben és DHL-ben növesztettünk, és Gram festéssel, cukor felhasználási vizsgálattal (API 50 CHL vagy API 20 E Kit, bioMerieux, Szöul, Korea) és 16S rRNS szekvenálással (ABI) azonosítottuk. DNS-elemzés). Ezeket letétbe helyezték az Országos Biotechnológiai Információs Központ (NCBI) rövidített archívumában KY751910 és KY751911 csatlakozási szám alatt.

LPS szigetelés az EC-től. Az LPS-t a korábban leírt módon extraháltuk néhány módosítással. Röviden, az EC-t triptikus szójalevesben (500 ml) tenyésztettük 24 órán át 37 ° C-on, és 10 000 g-vel 5 percig végzett centrifugálással gyűjtöttük össze. Az üledékeket kétszer 0,15 M foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS, pH 7,2) mossuk, amely 0,15 mM CaCl2-t és 0,5 mM MgCl2-t tartalmaz, 50 ml PBS-ben szuszpendáljuk és jégen 30 percig ultrahanggal kezeljük. A szonikátot proteináz K-val (100 μg ml-1, Sigma, St. Louis, MO) inkubáltuk 65 ° C-on 2 órán át, majd RNase-sel (40 μg ml-1, Sigma) és DNase-vel (20 μg ml-1 1) .1) Sigma) 1 μl/ml 20% MgS04 és 4 μl ml -1 kloroform jelenlétében 37 ° C-on, egy éjszakán át. A reakcióelegyet azonos térfogatú 90% -os fenollal extraháltuk, erőteljes rázással 65-70 ° C-on 15 percig, polipropilén csövekbe helyeztük és 8500 g-vel 15 percig centrifugáltuk. A felülúszókat 10 térfogat 95% -os hideg etanollal kezeltük 0,5 M nátrium-acetát jelenlétében -20 ° C-on egy éjszakán át, és 2000 g-nál 4 ° C-on 10 percig centrifugáltuk. A kapott pelletet desztillált vízben szuszpendáljuk, kétszer 4 ° C-on kétszer desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk és LPS-ként használjuk ebben a kísérletben.

Caco-2 sejttenyészet. A Caco-2 sejteket a Korea Cell Line Bank-től (Szöul, Korea) szereztük be, és 37 ° C-on tenyésztettük 5% CO 2 - 95% levegő atmoszférában DMEM-ben (Sigma), amely 10% marha magzati szérumot és 1% antibiotikum- Annak érdekében, hogy mérjük az LJ hatását a szorosan megkötött fehérjék expressziójára in vitro, a sejteket székletben 100 ng ml-1 LPS-frakcióval kezeltük 24 órán át LJ jelenlétében vagy hiányában, és a fixált fehérjék expressziós szintjét. sejtjeikben. a lizátumot immunblottolással mértük.

Az állatok. Hím ICR egereket (25-27 g, 5 hetesek) a RaonBio-tól szállítottunk. (Gyeonggi-do, Korea). Az összes egeret drótketrecbe helyeztük 20-22 ° C-on és 50 ± 10% páratartalommal, standard laboratóriumi chow-val és vízzel etettük ad libitum. Az egereket 1 hétnél hosszabb ideig tartó akklimatizáció után alkalmaztuk kísérletekben. Minden kísérlet minden csoportja 10 egérből állt.

Valamennyi állatkísérletet a Kyung Hee Egyetem laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó bizottsága hagyta jóvá, és a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó Kyung Hee Egyetemi Irányelveknek (IRB szám KHUASP (SE) -15-092) összhangban hajtották végre.

Kísérleti colitis egerek előállítása. A TNBS által indukált vastagbélgyulladással rendelkező egerek előállításához 2,5% (w/v) TNBS-oldatot (100 μl, 50% -os etanolban oldva) intrarektálisan injektáltunk az egerek vastagbélébe 43 éter alatt, vastagbél érzéstelenítéssel (S6a. További ábra). A TNBS teljes eloszlásához a vastagbélben az egereket függőleges helyzetben tartottuk 30 másodpercig a TNBS-sel végzett kezelés után. A normál kontrollcsoportot sóoldattal kezeltük TNBS helyett. Az egereket 24 órával, a 8. napon és a 15. napon leöltük a TNBS-kezelés után.

Az EC által kiváltott vastagbélgyulladás előállításához az egereknek orálisan EC-szuszpenziót adtunk (1 × 109 CFU, 100 μl 1% -os glükózban szuszpendálva) naponta egyszer, 5 napig (S6b. Kiegészítő ábra). A normál kontrollcsoportot EC helyett 1% -os glükózzal kezeltük. Az egereket 24 órával, a 8. napon és a 15. napon leöltük az EC-kezelés után.

Az LPS által kiváltott memóriazavar előállításához az egereknek intraperitoneálisan adtunk LPS oldatot (8 μg kg -1, sóoldatban oldva) naponta egyszer, 10 napig (S6c kiegészítő ábra). Az LPS-t izoláltuk az EC-től. A normál kontrollcsoportot EC helyett 1% -os glükózzal kezeltük. Az egereket 48 órával leöltük az LPS kezelés utolsó beadása után.

Passzív elkerülő feladat. A passzív elkerülés feladatát egy kétrekeszes akril dobozban hajtották végre, a megvilágított rekeszt (20 × 20 × 20 cm) egy bejárati furattal (5 × 5 cm) egy sötét rekesszel (20 × 20 × 20 cm) összekötve. Jung és mtsai. Röviden, a felvételi kísérletben egy egeret helyeztünk a megvilágított rekeszbe 1., 8. és 15. napon a TNBS-sel, EC-vel vagy annak LPS-jével történő kezelés után, és amikor az egér belépett a sötét kamrába, 0,3 mA-es áramütést 2 másodpercig padlórácsokon keresztül adták. Retenciós próbát végeztünk 24 órával a felvételi próba után, és megmértük a késleltetési időt a sötét kamrába való visszatéréshez.

Y-labirintus feladat. Az Y-labirintust háromkaros vízszintes labirintusban (40 cm hosszú és 3 cm széles, 12 cm magas falakkal) hajtották végre, amelyben a karok szimmetrikusan, 120 ° -os szögben helyezkedtek el egymástól Jung et. al. 44 A labirintus padlója és falai sötét, átlátszatlan polivinil műanyagból készültek. Az egeret eleinte az egyik karon belül helyezték el a TNBS-sel, EC-vel vagy annak LPS-szel végzett kezelést követő 1., 8. és 15. napon, és minden egyes egér esetében automatikusan rögzítettük a kar belépés szekvenciáját (pl. ACABC stb.) min. A tényleges váltakozást az egymást követő választások mindhárom ágába való belépésként definiálták (azaz ABC, CAB vagy BAC, de nem ABA). A labirintus karjait a feladatok között alaposan megtisztították a maradék szagok eltávolítása érdekében. Az alternációt (%) a következőképpen jelöltük: váltakozás (%) = [(váltások száma)/(az összes kar bejegyzés száma - 2)] × 100. A kar bejegyzések száma a mozgásszervi aktivitás indikátoraként szolgált.

Az MPO-aktivitás vizsgálata. Egy egér vastagbélt 10 mM kálium-foszfát pufferben (pH 7,0) homogenizáltunk, amely 0,5% hexadecil-trimetil-ammónium-bromidot tartalmazott, és 10 percig 20 000 g-vel 4 ° C-on centrifugáltuk. 45 A felülúszót (50 μl) hozzáadjuk a reakcióelegyhez (0,1 mMH2O2 és 1,6 mM tetrametil-benzidin), 2 percig 37 ° C-on inkubáljuk, majd 5 percig periodikusan ellenőrizzük az abszorbanciát 650 nm-en. Az MPO-aktivitást az 1 μmol ml -1 peroxidot lebontó enzim mennyiségeként számoltuk, és egység/mg fehérje egységben fejeztük ki.

Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat és immunblotolás. Az egér vastagbélt vagy hippocampust homogenizáltuk RIPA lízispufferben, amely 1% foszfatáz inhibitor koktélt és 1% proteáz inhibitor koktélt tartalmazott jégen, és 15 000 g-vel 4 ° C-on 15 percig centrifugáltuk. A tenyésztett Caco-2 sejteket RIPA lízispufferben homogenizáltuk, amely 1% foszfatáz inhibitor koktélt és 1% proteáz inhibitor koktélt tartalmazott jégen. A felülúszók citokinszintjét enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati készlet segítségével mértük (Ebioscience, Atlanta, GA).

Az immunblottoláshoz a vastagbél felülúszóit és a tenyésztett sejt homogenizátumokat SDS-poliakrilamid gélelektroforézisnek vetettük alá, és a nitrocellulóz membránra vittük. 45 A fehérjéket antitestekkel vizsgáltuk, torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel detektáltuk, és ECL-detektáló készlettel vizualizáltuk.

Limulus amoebocita lizátum vizsgálata. A vér és a széklet endotoxin-tartalmát diazo-kapcsolt limulus amoebocita lizátum vizsgálattal (Cape Cod, E. Falmouth, MA) határoztuk meg Kim és mtsai. Röviden: a vér endotoxin-koncentrációjának meghatározásához a plazmát 10-szeres pirogénmentes vízzel hígítottuk, 70 ° C-on 10 percig inaktiváltuk, majd limulus amoebocita-lizátummal inkubáltuk 30 percig 37 ° C-on. A reagensek hozzáadása bíborszármazék képződéséhez vezetett, amely 545 nm-en elnyeli a fényt.

A széklet endotoxin-koncentrációjának meghatározásához 20 mg vastagbélből származó ürüléket 50 ml PBS-be tettünk egy pirogénmentes csőbe, és 1 órán át szonikáltuk jégen. 15 percig 400 g-nál végzett centrifugálás után a felső 30 ml-t összegyűjtöttük, 0,45 μm-es szűrőn keresztül szűréssel sterilizáltuk, majd 0,22 μm-es szűrőn átszűrtük, és 10 percig 70 ° C-on inaktiváltuk. A szűrt szonikátot használtuk az endotoxin meghatározására.

Statisztikai analízis. Az adatokat átlag ± sd-ként tüntettük fel. Az adatok statisztikai elemzését varianciaanalízissel és Duncan-próbával végeztük. Különbségek egy P-vel