elemeket
absztrakt
A cink-α2-glikoprotein (ZAG) által történő lipidhiány mechanizmusának vizsgálata.
tervezés:
A vizsgálatokat ob/ob egereken vagy ezen állatok vagy szegény társaik izolált adipocitáin hajtották végre.
az eredmények:
következtetés:
Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a ZAG nemcsak közvetlen lipolízist indukál, hanem érzékenyíti a zsírszövetet más lipolitikus ingerekre is.
Az elhízás és annak egészségügyi következményei komoly problémát jelentenek a nyugati világ számára, és úgy gondolják, hogy mind genetikai, mind környezeti hatások okozzák. Az elhízás az inzulinrezisztenciával és a 2-es típusú cukorbetegséggel társul az észteresítetlen zsírsavak és a gyulladáscsökkentő citokinek felszabadulásával az adipocitákból. A menedzsment jelenlegi megközelítése magában foglalja az életmódváltást és a farmakológiai beavatkozást, bár a kezelési lehetőségek korlátozottak.
Kimutatták, hogy a ZAG zsírszövetvesztést indukál a WAT-ra kifejtett lipolitikus hatás révén, kombinálva a BAT-ban leválasztott protein-1 fokozott expressziójával, ami megnövekedett energiafelhasználást eredményezne. A lipolitikus hatás abból adódik, hogy az adenilil-ciklázt ciklikus AMP-ként aktiválják a guanozin-trifoszfát 4-től függő folyamatban, amelyet a specifikus p3-AR SR59230A, 16 antagonista gyengít, ami arra utal, hogy azt a p3-AR közvetíti. Az ob/ob egereket kísérleti modellként használva ez a tanulmány értékeli a ZAG hatását a lipolitikus enzimekre és az adipociták lipolitikus ingerekre való érzékenységét.
Anyagok és metódusok
anyagok
Az elhízott hiperglikémiás (ob/ob) egereket (73-77 g; 1. táblázat) saját telepükön helyezték el. Ezen állatok eredetét és jellemzőit korábban részletesen leírtuk. Az ob gén ezen háttérrel történő expressziója a cukorbetegség súlyosabb formáját eredményezi, mint a C/BL/6J ob/ob egerek. Az egereket légkondicionált helyiségben helyeztük el 22 ± 2 ° C-on, ad libitum, patkány patkányok és egerek (Special Diet Services, Witham, Egyesült Királyság) és csapvízzel tápláltuk őket. A hím egereket (20 és 21 hetes kor között) háromra osztottuk ketrecenként, és ZAG-t (napi 35, 50 vagy 100 μg) adtunk intravénás beadással (n = 6) vagy foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) (n = 6). A testtömeget, valamint az étel- és vízbevitelt, valamint a testhőmérsékletet naponta ellenőriztük rektális hőmérővel (RS Components, Northants, Egyesült Királyság), és a vizelet glükóztermelését is mértük.
Asztal teljes méretben
A testösszetétel meghatározása
A testösszetételt gravimetriásan határoztuk meg a fent leírtak szerint. 3 Röviden, a befejezés után az állatokat 80-90 ° C-ra melegítettük, amíg az állandó tömeg elérte, és a nedvesség és a száraz tömeg különbségéből meghatároztuk a víztartalmat. A szárított tetemből lipideket extrahálunk kloroform/metanol (1: 1), etanol/aceton (1: 1) és dietil-éter elegyével; az oldószereket egyesítjük és bepároljuk. A maradék súlya megadta a hasított test összes zsírját, és a hasított test nem zsíros tömegének tömegét a hasított test kezdeti súlya, valamint a víz és a zsír súlya közötti különbségként számolták ki.
Rekombináns humán ZAG előállítása és tisztítása
A humán HEK 293F sejteket transzfektáltuk humán ZAG-t tartalmazó pcDNS 3.1 emlős sejt expressziós vektorral, és neomicinben (50 ug ml-1) Freestyle táptalajban 5% CO 2 atmoszférában, 37 ° C-on történő növekedéshez szelektáltuk. a táptalaj az oltás után kb. 2 héten belül fokozatosan növekedett az idő alatt a fennsík szintjéig. A sejteket 700 g-vel 15 percig végzett centrifugálással eltávolítottuk, és a tápközeget (200 ml) 1 ml térfogatra steril PBS-be betöményítettük 10 kDa-os Amicon Ultra-15 centrifugális szűrővel (Millipore, Watford, Middlesex, Egyesült Királyság). A körülbelül 2 mg fehérjét tartalmazó koncentrátumot ezután hozzáadtuk 2 g dietil-amino-etil-cellulózhoz, amelyet 20 ml 10 mM Tris-ben (pH = 8,8) szuszpendáltunk, és 4 ° C-on 2 órán át kevertük. A ZAG dietil-amino-etil-cellulóz-cellulózhoz kötődik, amelyet centrifugálással ülepítenek (1500 g 15 percig), és 30 percig 4 ° C-on 20 ml 10 mM Tris (pH = 8,8) keverés mellett eluálunk 0,3 M NaCl-ot tartalmazó 20 ml 10 mM Tris-szel. Ülepítés után a ZAG-t tartalmazó felülúszót 1 ml térfogatra steril PBS-ben betöményítettük Amicon centrifugális szűrővel. A ZAG endotoxintól mentes volt, amint azt a LAL Pyrogent single test kit (Lonza) meghatározta. A rekombináns ZAG tisztasága a fentiek szerint> 95% volt. 15
Humán és egér adipociták előállítása
A zsírszövetet apró darabokra aprítottuk, és 1 g 1-1 kollagenázt és 4% szarvasmarha-szérum albumint tartalmazó Krebs-Ringer-hidrogén-karbonátban emésztettük 95% oxigén/5% CO 2 alatt, 37 ° C-on, a leírtak szerint. 30 perc elteltével az adipocitákat nejlon hálón (pórusméret 250 μm) átszűrjük, 500 g-vel 2 percig centrifugáljuk, majd háromszor PBS-sel mossuk, mielőtt 10% magzati borjúszérumot tartalmazó RMPI 1640 táptalajban szuszpendálnánk és atmoszférában tartanánk. . 5% CO 2 levegőben, 37 ° C-on. A táptalajt naponta cseréltük. Az adipociták számát hemocitométerrel határoztuk meg.
Lipolitikus teszt
A lipolitikus vizsgálatokhoz 105–2x105 adipocitát inkubáltunk lipolitikus ágenssel 2 órán át 1 ml Krebs-Ringer-hidrogén-karbonát-pufferben, pH 7, 2, és a lipolízis mértékét a glicerin felszabadulásának mérésével határoztuk meg, μmol glicerin/liter. 105 adipocita 2 óra alatt. 19 csak adipocitákat tartalmazó kontroll mintát elemeztünk a spontán glicerin felszabadulás meghatározása céljából.
In vivo lipolízis a mutató közvetlen zsírpárnákba történő befecskendezésével
Western blot elemzés
A frissen kivágott WAT-ot PBS-ben mostuk, és foszfoszafe-extrakciós reagensben lizáltuk 5 percig szobahőmérsékleten, majd ultrahanggal kezeltük 4 ° C-on. Poliakrilamid-gélelektroforézis 180 V-on körülbelül 1 órán át, majd 0,45 μm-es nitrocellulóz-membránokra helyeztük, amelyeket blokkoltunk 5% -kal. Tris-pufferolt sóoldatban (pH = 7,5) 4 ° C-on egy éjszakán át éljük. Mind az elsődleges, mind a szekunder antitesteket 1: 1000 hígításban alkalmaztuk. Az inkubációt 1 órán át szobahőmérsékleten folytattuk, és a fejlődést kemilumineszcencia fokozta. A blotokat denzitométerrel pásztáztuk a különbségek számszerűsítésére.
Statisztikai analízis
Az eredményeket átlag ± sem értékként adják meg legalább három ismételt kísérletnél. A csoportok közötti összetételbeli különbségeket egyirányú varianciaanalízissel határoztuk meg, amelyet több Tukey-Kramer összehasonlító teszt követett. A P 23 értékei, amelyek jelzik az ERK útvonal szerepét az indukcióban. Hasonló eredményeket kaptunk az ATGL fehérje expresszióval kapcsolatban, amelyet mind a ZAG, mind az izoproterenol megduplázott, és ezt a PD98059 teljesen lecsökkentette (1e. Ábra), ismét jelezve az ERK szerepét. Az izolált ZAG adipocitákban és kisebb mértékben az izoproterenol által kiváltott lipolízist a PD98059 gyengítette, bár ez nem tért vissza az alapértékekre (1f. Ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ERK útvonal részt vesz a HSL és ATGL fehérjék WAT-ban történő fokozott expressziójában. 24, 25 
A ZAG lipolitikus aktivitása sovány és ob/ob egerekből izolált adipocitákban, humán adipocitákban és a ZAG hatása a HSL expressziójára. a ) Lipolízis indukálása egér epididymális adipocytákban sovány (▪) és ob/ob ( □ ) egerek izoproterenollal vagy ZAG-val 2 órán keresztül megadott koncentrációban. A sovány állatokkal szembeni különbségeket * P ** P *** P) jelentik az alapszintekhez képest (▪). Különbségek az epididymális adipocytáktól a ( a ) ** P ** P *** P *** P † P †† P 15 súlygyarapodást a gastrocnemius izomtömeg növekedésének tekintették, bár a soleus izomtömegére nem volt hatás. A BAT majdnem megduplázódott (PBS 0,42 ± 0,12 g, ZAG 0,79 ± 0,66 g; a P15 plazma glükóz- és inzulinszintje csökkent, valamint az észterezetlen zsírsav- és trigliceridszint, míg a glicerinszint csökkent). E változások nagysága hasonlóan a ZAG beadását követő 5 naphoz, és a vizelettel történő glükóz kiválasztás is csökkent (2c. ábra), de a fő csökkenés a ZAG beadását követő első 5 napban következett be, ezután a szintek állandóak maradtak.
A ZAG hatása a testtömegre, a hőmérsékletre és a vizelet glükóz kiválasztására ob/ob egerekben. a ) A ZAG (100 μg; intravénásan, ▪) vagy a PBS (♦) hatása az ob/ob egerek testtömegére 15 nap alatt. Azokat a napokat, amikor a ZAG-t nem adták be, ↑ jelöli. ( b ) PBS-sel (♦) vagy ZAG-val (▪) kezelt ob/ob egerek rektális hőmérséklete a ( a ). ( c ) PBS-sel (♦) vagy ZAG-val (▪) beadott ob/ob egerek vizelettel történő kiválasztása 15 napig. A PBS kontrollaktól való eltéréseket * P-ként jelentjük
Az ob/ob egerek ZAG-val kezelt adipocitáinak HSL expressziója és lipolitikus válasza. ( a ) A Western blot ob/ob egerek epididymális (ep), szubkután (sc) és zsigeri (vis) zsírszövetében mutatja a ZAG expresszióját 5 napos folyamatos ZAG beadás után (35 μg; napi intravénásan). Az aktin terhelésszabályozóként szolgált. ( b Az adipocitákat (ep) eltávolítottuk az egerekből a kezelés 5 napja (0. nap) végén, és további 4 napig 10% magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban tartottuk ZAG hiányában. A ZAG expresszióját Western-blot segítségével határoztuk meg. ( c ) A Western blot foszfo HSL expressziót mutat ep adipocitákban közvetlenül az egerekből való eltávolítás után (0. nap), és további 4 nap után szövetkultúrában ZAG hiányában. ( d ) Az ep adipociták lipolitikus válasza in vitro PBS-sel (▪) vagy ZAG-val (in vitro) kezelt ob/ob egerekben.
HSL, ATGL és foszfo ERK fehérjék expressziója ZAG-val kezelt WAT ob/ob egerekben. HSL expressziót mutató Western blotok ( a ), ATGL ( b ) és a foszfo ERK ( c ) PBS-sel vagy ZAG-mal kezelt ob/ob egerekből eltávolított epididymális (ep), szubkután (sc) és zsigeri (vis) adipocitákban (35). intravénásan) 5 napig. A denzitometrikus elemzés három különálló blot átlagát mutatja. A PBS-sel kezelt állatoktól való különbségeket * P-ként jelentik
Az epididymalis radioaktivitás csökkenésének mértéke ( a ) [U-14C] palmitáttal jelölt epididymal, ( b ) szubkután, c ) ob/ob egerek mesenterialis (zsigeri) zsírpárnái a ZAG-val történő kezelés után (50 μg; intravénásan); iv) napi) (▪) vagy PBS (♦) 5 napig. ( d ) az [U-14C] palmitát felhalmozódása a különféle szervekben 1 órával az ob/ob egerek epididymális zsírpárnáiba történő közvetlen injekció után, bármelyik ZAG beadása után (50 μg; iv. naponta) ( □ ) vagy PBS (▪). A PBS kontrolloktól való különbségeket úgy számoltuk be, hogy * P ** P 14 C] palmitic az epididymális zsírlerakódásoktól szintén korrelál a ZAG-ra adott megnövekedett lipolitikus válasszal (1a. Ábra) a szubkután és visceralis adipocytákhoz képest (1b. Ábra). Ezt a hatást a β3-AR agonista, a BRL 37344 (6a. Ábra) esetében is megfigyelték, amely fokozott lipolízis stimulációt okozott a ZAG-val kezelt állatok epididimális adipocytáiban, míg a szubkután és visceralis adipocytákban a ZAG-val végzett előkezelés nem volt hatással a lipolitikus válasz. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a ZAG szinergikusan hat a β3-AR agonistákkal a lipidek mozgósítása érdekében. A BRL 37344 iránti zsírsejtek szenzibilizációját rövid távú tenyészetekben is megfigyelték 2 órás inkubálás után ZAG-val, de nem izoproterenollal (6b. Ábra).
Eredetileg úgy gondolták, hogy a HSL sebességkorlátozó enzim, de a legfrissebb adatok 35 szerint az ATGL korlátozó tényező lehet. A HSL-hez hasonlóan az elhízott egyének szubkután zsírszövetében az ATGL 13 szintje csökkent, a megnövekedett mRNS-expresszió ellenére, 36 bár más vizsgálatok 37, 38 mind a HSL, mind az ATGL mRNS és a fehérje csökkenéséről számoltak be. Jelentős összefüggés van az ATGL és a HSL mRNS expressziója között mind a zsigeri, mind a szubkután zsírszövetekben, ami az expressziójuk közös szabályozási mechanizmusára utal. 37, 38 Ez összefüggésben lehet az ERK útvonal aktiválódásával, amint arról az in vitro vizsgálatok beszámoltak, mivel az ERK minden zsírszövetraktárban aktiválódott, miután a ZAG-t ob/ob egereknek beadták. Mind az inzulinrezisztencia, mind a hiperinsulinémia elhízott egyénekben összefüggést mutat az ATGL és a HSL fehérje expressziójával, függetlenül a zsírtömegtől. Így a ZAG azon képessége, hogy mind a HSL, mind az ATGL expressziót fokozza, korrelálna az inzulinrezisztencia enyhítésének képességével15, bár valószínűleg más mechanizmusok, például a glükóz és a zsírsavak fokozott felvétele és oxidációja is fontosabbak.
Az ob/ob ZAG egerek kezelése szintén fokozta a ZAG fehérje expresszióját az epididymális, a szubkután és a zsigeri zsírszövetben. Bár a ZAG expressziója alacsony az elhízásban, 7, 8, 9, kimutatták, hogy a WAT-ban való expressziója tízszeresére nőtt a cachexia egerekben. Kimutatták, hogy ez a szérum kortizol 39 növekedésének köszönhető, bár a tumor nekrózis-a-nekrotizáló faktor a Simpson-Golabi-Behmel-szindróma 40 humán adipocytájában a ZAG expressziójának négyszeres csökkenéséhez vezet, ami az alacsony szintek magyarázatának lehetséges mechanizmusa, elhízott alanyok zsírszövetében található ZAG. Kimutatták, hogy a szelektív SR59230A β3-AR antagonista a ZAG indukcióját a 3T3-L1 adipocitákban exogén ZAG beadásával gyengíti, ami arra utal, hogy a β3-AR közvetíti. 39
A ZAG-ra azért lehet szükség az optimális p3-AR hatás érdekében, mert a ZAG knockout egerek alacsonyabb választ mutattak a specifikus β3-AR agonistára, a CL316243-ra. Mivel a ZAG szintje alacsony az elhízásban, ezért a 7, 8, 9 p3-AR expressziója sem optimális lehet. Tehát a p3-AR agonisták optimális ZAG aktivitást igényelhetnek, amit az izoprenalin és a BRL 37344 fokozott lipolitikus hatása bizonyít a ZAG-val kezelt ob/ob egerek adipocitáiban. Ezen túlmenően a ZAG cukorbetegségre gyakorolt sok hatása ebben a modellben 15 valószínűleg annak 3-AR agonista aktivitásával függ össze. A 16p3-AR agonisták lipolízist indukálnak WAT-ban, a klasszikus ciklikus AMP és protein-kináz A útvonalon keresztül, valamint az ERK útvonalon keresztül, amely a teljes lipolízis 15-25% -át teszi ki. 32
Az elhízott egerek adipocitái kétszer alacsonyabb szintű Gamma-t is expresszálnak, a guanozintrifoszfát-kötő fehérje stimuláló alegységét, amely stimulálja az adenilil-ciklázt. Kimutatták, hogy a ZAG növeli a Gαs expresszióját és csökkenti a gátló G-fehérje, a Gαi expresszióját a 3T3 adipocitákban, 43 olyan mechanizmusra utal, amely révén a ZAG fokozhatja a lipolitikus választ a HSL és ATGL indukálása mellett.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a ZAG az ob/ob egerekben jelentősen csökkentette a zsírtömeget. A hatás lipolitikus aktivitáson keresztül mutatkozott meg, a HSL és az ATGL fehérje expressziójának indukciójával együtt adipocitákban, ami szenzibilizációt okozna más lipolitikus ingerekre. Ezenkívül a felszabadult lipidek hővé alakulnak a megnövekedett BAT-súly révén. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a ZAG legyőzheti az elhízott állapothoz kapcsolódó metabolikus változásokat. További tanulmányok vizsgálják a β-adrenerg receptorok szerepét a ZAG működésében.