elemeket

absztrakt

A bőr egy kivételesen lipidekkel dúsított szövet. A bőr lipidjeinek szerepe a bőr fenntartásában és az egész test homeosztázisában jól dokumentált 1, 2. Ezenkívül a bőr lipid diszfunkciója számos bőrbetegséghez kapcsolódik, például pattanásokhoz, atópiás dermatitishez és pikkelysömörhöz, mint például a főbb 3, 4, 5, 6. A bőrfelszíni lipidek (SSL) a bőr lipidjeinek két fő forrásából származó lipidek keverékéből származnak. A faggyú, a faggyúmirigy (SG) által kiválasztott amorf lipidmátrix és a stratum corneumban található epidermális lipidek képviselik a fő lipidtartályokat a bőrfelületen 7 .

Anyagok és metódusok

Vegyszerek, reagensek és referencia vegyületek

Az emberi stratum corneum mintavétele

A stratum corneumot (SC) 10 kaukázusi önkéntes (8 nő és 2 férfi, átlagéletkor 37,5 ± 7,6 év) három különböző testhelyéről vettük, a D-SquameTM tapasz többszöri lehúzásával (CuDerm Corp., Dallas, TX), USA). Az önkéntesek a mintában szereplő területek egyikén sem mutatták a bőrbetegség jeleit. SC mintákat vettünk az alkar (ARM) és a középső homlokterület (HEAD) volar felületéről mind a női, mind a férfi panelekben, míg az SC-t csak a nőknél vettük a mellkas központi területéről (CHEST), mivel a férfiaknál jelenlévő testszőrre. A vizsgálatot a helsinki nyilatkozatnak megfelelően hajtották végre, miután a Fondazione GB Bietti Központi Etikai Bizottság jóváhagyta, minden önkéntes írásbeli beleegyezésével.

minta előkészítése

hangszerelés

A kromatográfiai berendezés 1200 sorozatú nagysebességű HPLC felbontásból állt (Agilent Technologies, Németország), amely gáztalanítóval, automatikus mintavevővel és termosztáttal volt felszerelve ugyanazon gyártó oszlopterébe. Gyors fordított fázisú HPLC (RP) elválasztáshoz Kinetex C8, 50 x 2, 1 mm, 1,7 μm, részecske szakasz, 100 biztonsági oszlop pórusszakasszal, oszlop előtti SecurityGuard ULTRA patron (Phenomenex, Castel Maggiore, BO, Olaszország), a maximális üzemi ellennyomást 600 bar nyomáson alkalmazták. Az SC mintákat és a hiteles standardokat bináris gradienssel eluáltuk (A): 5 mM ammónium-formiát 20% metanol/izopropanol 95: 5 arányú és (B): metanol/izopropanol 95/5 arányú vízben. A mozgó fázisokat 0,45 μm-es üvegszűrőn átszűrjük, és vákuumban folyamatosan gázmentesítjük. Az eluálási program a következő volt: 0 - 6 perc 60% B, 20 perc 99% B, 20 - 30 perc 99% B, 36 perc 60% B, 36 - 38 perc 60% B. 2 perc múlva. Az áramlási sebességet 0,4 ml/perc sebességgel tartottuk a HPLC eljárás során és idővel (2 perc alatt). Az oszlopot 60 ° C-on termosztáltuk. Az injektálási térfogat 4 μl volt. Az injekciós tűt a mobil fázissal a HPLC terminál mosónyílásában mossuk. Az eluens szennyvizet két különböző MS analizátorhoz kapcsoltuk a kimutatás és jellemzés céljából.

Elektrospray ionok forrása és repülési idő MS

A pontos tömeg- és izotópmintaméréseket egy G6220A sorozatú TOF-MS-szel (Agilent Technologies, Németország) végeztük, amely negatív ion üzemmódban működő ESI interfésszel volt felszerelve. Az LC-rendszerből eluált vizsgálatokat TOF-MS készülékre töltöttük felfelé-kromatográfiával (lásd a kromatográfiás körülményeket). Nitrogént alkalmazták porlasztó és oldószeres gázként. A szárító gáz hőmérséklete és áramlási sebessége 350 ° C és 10 l/perc volt. A kapilláris és a kúp feszültsége 4000 és 60 V. A letapogatási módú TOF tömegspektrumokat negatív ion üzemmódban kaptuk TOF alkalmazásával, 10 000 tömegfelbontás mellett, 100 és 1200 közötti szkenneléshez. ). Az ionos fajok tömegének pontos mérésének javítása érdekében az összehasonlító oldatot folyamatos adagban, porlasztókamrában bepároltuk. A kapott adatokat tömeg tömegközépponttá alakítottuk át, amelyből mértük az m/z pontos értékét. Az FFA és a CHS kvantitatív elemzését ugyanazon LC-MS módszerrel végeztük.

ESI-MS hármas kvadrupollal

Tandem tömeg (MS/MS) ESI spektrumokat a G6410A sorozat (QqQ) hármas kvadrupollal (Agilent Technologies, Németország) kaptunk. Az adatokat pozitív ion módban, egységnyi tömegfelbontás mellett kaptuk, m/z 100 és 1200 közötti ionok beolvasásával. Az MS spektrumokat átlagoltuk és feldolgoztuk Mass Hunter szoftverrel. Az LC rendszerből eluált vizsgálatokat egy QqQ készülékbe vezettük be működési áramlási sebesség mellett (lásd a kromatográfiás körülményeket). Nitrogént alkalmaztunk porlasztó és szárító gázként, és a forrás beállításai megegyeztek a TOF-MS-éval. A vegyület azonosításához precionion-kísérleteket hajtottunk végre a harmadik kvadrupol, míg termék-ion-kísérleteket (prodION) az első kvadrupol letapogatásával. A második kvadrupolt ütközési cellaként alkalmaztuk mindkét kísérletben. Az alkalmazott ütközési energia 34 V volt, míg a fragmentor feszültséget (F) 140 V-ra állították.

Adatfeldolgozás

HPLC-MS adatok kivonása

Adatok elemzése és többváltozós statisztikák

Összetett azonosítás

Az LC-MS analízissel kimutatott elválasztási osztályban szignifikánsnak talált vegyületek azonosságát QqQ tömeganalizátorral végzett LC-MS/MS megerősítette a fent leírt eszközök alkalmazásával. A kísérleteket megismételtük az elsődleges analízishez leírtakkal azonos kromatográfiás körülmények között. Az ionokat a QqQ-ban való ütközés által kiváltott fragmentáció (CID) fragmentációra irányítottuk egy előre meghatározott pontos tömeg és az LC-MS által meghatározott RT alapján. A javasolt vegyület szerkezetének összehasonlítása a kapott fragmensekkel megerősítette az azonosságot. A prekurzor- és termékionok pontos tömegadatait és izotóp-eloszlásait tanulmányoztuk, és összehasonlítottuk a referenciavegyületek spektrális adataival, ha rendelkezésre állnak, ugyanazon feltételek mellett, a végső megerősítéshez (HMDB, METLIN).

A szabad zsírsavak és a koleszterin-szulfát mennyiségi elemzése LC-MS segítségével

A fő FFA és CHS kvantitatív értékeléséhez pmmol/L hiteles FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 és FA C24: 0 és 10 μmol/L CHS tartalmú törzsoldat 1: 1 sorozatos hígításai. A standard oldatokat a fent leírt LC-MS-sel elemeztük. A kimutatási határt (LOD) és a mennyiségi meghatározás határát (LOQ) az IUPAC irányelvek 43 alapján számoltuk ki. Különösen a LOD-t határoztuk meg a legalacsonyabb koncentrációként, amelynek a jel-zaj aránya (S/N) háromszor nagyobb volt, mint a vak. A LOQ-t úgy definiáltuk, mint a legalacsonyabb koncentrációt, amelynél a linearitás megkezdődött. A linearitást a korrelációs együttható (R) alapján határoztuk meg. Ezenkívül a pontosságot, a napon belüli és a napközi reprodukálhatóságot és a hozamot meghatároztuk 50 és 5 μmol/l standard FFA és CHS oldat injektálásával.

Az adatok elérhetősége

A jelenlegi vizsgálat során létrehozott és/vagy elemzett adatfájlok a megfelelő szerzőtől ésszerű kérésre rendelkezésre állnak.

az eredmény

A főbb elemek fontosságának vizsgálata és elemzése

Az összehangolás és a normalizálás után a tulajdonságokat kiszűrtük olyan alanyok kiválasztásával, amelyek a minták 100% -ában voltak jelen bármely kísérleti csoportból, például ARM, CHEST és HEAD. Több mint ezer (1098) alanyra bukkantak az SC minták összes számában (100%). Az SCS közötti különbségeket mindhárom csoportban az egyes metabolitok esetében az ANOVA értékelte (p

stratum

(A) - a fő komponens elemzése (PCA), és (B) Az egyedek CC-diagramjai legalább egy állapot 100% -os mintáiban találtak az ARM, a MELL, és a HEAD stratum corneum (SC) lipidkivonatai között. Az első két fő komponensen (PC) belül a teljes variancia 50,77% -át magyarázták, az első dimenzióban 38,93%, a második dimenzióban pedig további 11,84%. A CC-ábrák a keramidok (rózsaszín pöttyök), szabad zsírsavak (zöld pöttyök) és a koleszterin-szulfáttal rokon vegyületek (piros pöttyök) elnevezésű entitások P-Cor és P-Cov értékeit mutatják be a 100% -os mintákban kimutatott entitások között. legalább egy feltétel (fekete pontok).

Teljes méretű kép

Fold változások és klaszterezés

Teljes méretű kép

52 alany hierarchikus csoportosítása, amelyet rutinszerűen módosítottak, amikor összehasonlítottuk az ARM-ot a MELL, a MELL-et a HEAD-hoz, és az ARM-et a HEAD-hez, amint az a 2. ábrán látható. 2. Az annotált FFA és koleszterin-szulfát azonosságát a megfelelő hiteles vegyület RT és MS/MS spektrumaival való összehasonlítással igazoltuk. A ceramid annotációkat az MS/MS spektrumok létrehozása után igazoltuk.

Teljes méretű kép

A szabad zsírsavak eloszlási profiljai az alkar, a mellkas és a homlok SC-ben

Az SC-ben és a koleszterin-szulfátban található fő szabad zsírsavak mennyiségi elemzése LC-MS-sel

A faggyú és az epidermális lipid gátló lipidek CHS-szintjeinek és számos fő FFA-jellemzőjének - például FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 és FA C24: 0 - meghatározása az RP-HPLC elválasztáson alapuló kvantitatív módszer és az MS detektálása negatív ion módban be van állítva. Kiértékeltük a mátrix linearitását, LOD-ját, LOQ-ját és a regeneratív formáját a hiteles célanalízis-standardok szempontjából. A módszert optimalizáltuk az FA C16: 1, az FA C18: 1, az FA C18: 2 és az FA C24: 0 és a CHS mennyiségének számszerűsítésére az ARM, a CHEST és a HEAD esetében. Az FFA-t és a CHS-t a deuterált d14-PoA és a d7-CHS belső standardokkal szemben számszerűsítettük. A meghatározott körülmények kielégítő linearitást, reprodukálhatóságot, hozamot, érzékenységet és LOQ-t mutattak, amint azt az S4 táblázat mutatja. Az eredmények a mintába felvett SC tömegének normalizálása érdekében a mennyiségi mennyiségeket elosztottuk az mg mintával. Az SC-ben számszerűsített FFA-koncentrációk összhangban voltak az ARM, a CHEST és a HEAD esetében a nem célzott megközelítésben megfigyelt relatív százalékos arányokkal. Ábrán bemutatott kvantitatív eredmények 4 nmol/mg SC-ben a faggyúspecifikus FFA, például az FA C16: 1 ARM sorrendben növekedett

A faggyúszekréció biomarkerek és az epidermális permeabilitás gátló lipidek mennyiségi értékelésének eredményei ARM, CHEST és HEAD SC lipid kivonatokban. Az FFA-t és a CHS-t LC-MS-sel számszerűsítettük, míg a koleszterin- és szkvalén-szinteket GC-MS-mel értékeltük. A dobozdiagramok nmol/mg SC koncentrációt fejeznek ki ARM-ban (zöld doboz), CHEST-ben (narancssárga doboz) és HEAD-ben (szürke doboz). Az ábra táblázatának összefoglalása mutatja az átlagos koncentrációt, amelyet piros kereszttel jelölünk a vonatkozó meződiagramon, és az ANOVA által értékelt szignifikanciát.

Teljes méretű kép

A koleszterin és a szkvalén mennyiségi elemzése SC-ben GC-MS alkalmazásával

Az epidermális lipidek és faggyúlipidek SG-eloszlás szerinti relatív mennyiségében észlelt különbségek megerősítéséhez a megfelelő biomarkereket, nevezetesen a koleszterint és a szkvalént, GC-MS-rel számítottuk ugyanazon SC-kivonatok alikvotáin, amelyeket korábban LC-MS-vel elemeztünk. A kvantitatív eredményeket nmol-koleszterin és szkvalén formájában adjuk meg a 3. ábra mg SC-jéhez. 4 az FFA és a CHS LC-MS kvantitatív elemzéseivel együtt. Az ANOVA kimutatta, hogy a koleszterinszint szignifikánsan csökkent az SG-szegényektől az SG-dús területekig. Ezzel szemben a szkvalén koncentráció szignifikáns növekedését figyelték meg, amikor a HEAD-t összehasonlították az ARM és a CHEST helyekkel.

vita

A nagyméretű bőr lipidomika az SSL-en belül az egyénen belül széles körű variációt mutatott az emberek regionális testterülete szerint36. A frontális, frontális, emlő és vállrész kifejezett lipidprofilt mutatott a test bármely más helyéhez képest a faggyú ujjlenyomat miatt, amely többnyire a trigliceridek és digliceridek magasabb szintjéhez kapcsolódott 36. Analitikai körülményeinket úgy választottuk meg, hogy optimálisan kimutassuk az epidermális gátló lipideket, például a ceramidokat és a CHS-t, valamint az FFA-t. Az FFA család specifikus tagjainak bősége jellemzi az SPB mátrixot és a faggyút. Környezetünkben az FFA volt a faggyúzsírok legjelesebb aláírása. Eredményeink összhangban voltak a láb és a homlok corneocytáiból származó lipid lamellák drámai módon eltérő szerkezeti szervezeteinek megfigyelésével, ahol a faggyútartalmat alacsony (1 µg/cm 2) és magas (200 µg/cm 2) szinteken, 60 . A Raman-spektroszkópia kimutatta, hogy a lipidtartalom megemelkedett az SG-ben gazdag bőr dermiszében az SG-szegény bőrhöz képest, bizonyítva, hogy a faggyúkomponensek felszívódnak az epidermiszben és az alsó szövetben. .

köszönöm

A tanulmány az olasz egészségügyi minisztérium által finanszírozott alapkutatási program részeként készült.