elemeket

absztrakt

Trio Rho Guanin-nukleotidcserefaktor (RhoGEF) A trió elősegíti az aktinpolimerizációt azáltal, hogy közvetlenül aktiválja a kis GTPáz Rac1-et. A legújabb tanulmányok azt sugallják, hogy az autizmus spektrum rendellenességeivel (ASD) kapcsolatos viselkedési fenotípusok az ASD állatmodelljeiben az aktin polimerizáció Rac1 szabályozásának diszregulációjával hozhatók létre glutamaterg szinapszisokban. Emberekben a de novo ASD-vel kapcsolatos mutációk nagy csoportját találtuk a Rac1, GEF1 Trio-aktiváló doménjében. Vizsgálatunk azt mutatja, hogy ezek a mutációk in vitro a Trio hipofunkcionális vagy hiperfunkcionális formáit eredményezik rágcsáló idegsejtekben. Az ASD állatmodelljeiben megfigyelt glutamaterg neurotranszmisszió patológiás növekedésével vagy csökkenésével összhangban azt találjuk, hogy ezek a mutációk akár a szinaptikus AMPA receptor expressziójának csökkenéséhez, akár fokozott glutamaterg szinaptogenezishez vezetnek. Megállapításaink együttesen a túlzott és csökkent Trio aktivitásra, valamint az ebből eredő szinaptikus diszfunkcióra utalnak az ASD-vel kapcsolatos patogenezisben, és rámutatnak a Trio-Rac1 útjára a glutamaterg szinapszisokban, mint számos ASD-vel kapcsolatos gén konvergenciájának lehetséges kulcspontjára.

Nemrégiben azt tapasztaltuk, hogy a Rho guanin nukleotidcserélő faktor (RhoGEF) protein Trio és annak paralóg Kalirin együttese szükséges a glutamaterg neurotranszmisszióhoz 9. Az agy trió expressziója a késői prenatális/korai posztnatális fejlődésben a legmagasabb, míg a Kalirin expresszió csak a 10., 11., 12. serdülőkorban ér el csúcspontot. Az egyetlen génből származó többszörös Trio izoformák az agyban expresszálódnak 13. Például a Trio-9 az uralkodó izoform a kéregben és a hippocampusban expresszálva. Mind a trió, mind a Kalirin a glutamaterg szinapszisok posztszinaptikus rekeszében található, amelyet 10, 14 dendrit spinnek neveznek. A pörgetések során ez a két fehérje a glutamaterg szinapszis működését szabályozza a GEF1 doménjeik azon képessége révén, hogy elősegítsék a Rac1-függő aktin polimerizációját 9, 15, 16. Ezenkívül megállapítottuk, hogy a Trio és a Kalirin a CaMKII foszforilezésének célpontjai, amelyek szükségesek a hosszú távú potenciálás (LTP) 9 indukciójához, egy sejtes folyamathoz, amelyről azt gondolják, hogy ez a tanulás és a memória alapja. Így ezek a fehérjék döntő szerepet játszanak a glutamaterg szinapszis szabályozásában.

Itt meghatározzuk a de novo ASD-vel kapcsolatos mutációk nagy csoportját a Trio Rac1-aktiváló doménjében, a GEF1-ben. A Trio GEF1 doménben talált mutációs klaszterezés mértéke és ezen de novo ASD-vel kapcsolatos mutációk számítási szempontból előre jelzett hatása a Trio-Rac1 kölcsönhatásokra utal a Trio-Rac1 útvonal diszregulációjának erős kapcsolatára az ASD-vel kapcsolatos patológiákban. Ezeknek a mutációknak a szisztematikus vizsgálata a Trio-9-ben mind a hipomorf, mind a hipermorf mutációkat feltárja, amelyek drámai módon és kétirányúan befolyásolják a Trio működését és Trio hatását a glutamaterg neurotranszmisszióra a hippocampus CA1 piramis idegsejtjeiben. Az ASD állatmodelljei a glutamaterg neurotranszmisszió patológiás növekedését és csökkenését mutatják 17, 18, 19. Vizsgálatunk az ASD-hez kapcsolódó missense mutációkat tárta fel egyetlen szinaptikus Rac1-aktiváló fehérjében, amely kétirányú változásokat képes előidézni a glutamaterg neurotranszmisszióban, ezáltal mind a csökkent, mind a túlzott Trio aktivitást, és ennek eredményeként az ASD-vel kapcsolatos betegségek szinaptikus diszfunkcióját vonja maga után.

az eredmény

ASD-vel kapcsolatos mutációk a trióban

domén

Az ASD-vel kapcsolatos de novo mutációk a trióban. Missense mutációk, b ostobaság a c példányszám a trióban ASD-vel kapcsolatos rendellenességekben szenvedő egyéneknél. Különböző, az N-termináltól kezdődő fehérje doménekről számolnak be: Sec14 domén, spektrumismétlések, GEF1 domén (Dbl homológiai doménből (DH1) és pleckstrin homológiai doménből (PH1) áll), 3c Src homológia doménből (SH3) és GEF2 doménből ( Dbl homológiai doménből (DH2) és Pleckstrin homológiai doménből (PH2) áll). Minden mutációhoz megadják az egyén diagnózisát, valamint a Trio aminosav-szekvencia változásával kapcsolatos információkat. Az aminosavmutációk helye az NP_009049.2-ből

Teljes méretű kép

Az Exome Aggregation Consortium (ExAC) legutóbbi elemzése szerint 60 706 teljesen szekvenált emberi genom alapján a TRIO a 60 legkorlátozottabb emberi gén közé tartozik, ami magas funkcionális jelentőségre utal. A triónak kivételesen alacsony missense mutációja van (z = 6, 29) és a nonszensz mutációk funkcióvesztése (LoF) (pLi = 1), miközben a szinonim mutációk átlagos aránya (z = 0, 19) 27 . A GEF1/DH1 domén korlátozása még hangsúlyosabb. Figyelemre méltó, hogy 9 937 kontroll genomban 24 (1. táblázat és 2a. Ábra) nem észleltünk missense vagy loss funkcionális mutációkat (LoF) a GEF1/DH1 doménben (1. táblázat és 2a. Ábra), ami az ASD-vel kapcsolatos mutációk erős gazdagodását jelzi ebben a régióban (1. ábra). 1). (2b) Az 1000 Genomes 28 adatbázisban nem találtunk hiányzó mutációkat sem a GEF1/DH1 tartományban (további 1a. Ábra). Fontos, hogy az 1000 genom adatbázisban felsorolt ​​szinonim mutációk jelen voltak ebben a régióban (1b. Ábra). Ezek az adatok együttvéve az ASD-vel kapcsolatos de novo mutációk erős gazdagodását jelzik a GEF1/DH1 Trio régióban.

Asztal teljes méretben

A kontrollban és az ASD-vel kapcsolatos genomokban talált mutációk triója. A kontrollgenomokban talált trio-9 mutációk (De Rubeis és mtsai., 2014 24). b A grafikon mutatja az ASD-vel kapcsolatos mutációk (piros sávok) és a kontrollok (fekete sávok) számát, amelyek az egyes Trio-9 doménekben megtalálhatók ASD-vel kapcsolatos rendellenességekben és ASD-vel kapcsolatos rendellenességek nélküli egyénekben. Az ASD-vel kapcsolatos Trio mutációban való dúsulást minden Trio doménben kiszámítottuk, levonva a kontroll mutációk számát az egyes doménekben megfigyelt de novo ASD-vel kapcsolatos mutációk számából. Az átlátszó háromszögek a mutációval kapcsolatos ASD-dúsulás jelenlétét (piros), hiányát (fekete) és nagyságát jelzik az egyes tartományokban.

Teljes méretű kép

A Trio fehérje és a Trio-GEF1/DH1 domén mutációk jelentőségének értékeléséhez ASD-vel kapcsolatos rendellenességekben összehasonlítottuk a de novo mutációk várható számát a megfigyelt mutációkkal. Samocha és munkatársai által kifejlesztett mutációs modellt használtunk. 29. Samocha és mtsai eredményei. 1078 ASD-es és 151 mentális fogyatékossági eseten alapultak, és ez a tanulmány az SCN2A-t és a SYNGAP-ot azonosítani tudta az ASD-vel kapcsolatos rendellenességekben. Ebben a tanulmányban sokkal nagyobb számú esetet figyeltünk meg (4890 ASD-vel kapcsolatos rendellenesség esetén) és nagyszámú hiányzó mutációt figyeltünk meg a TRIO-ban (11 ASD-eset, szemben az általános populációban ugyanannyi egyedre várt 1,07-es esetekkel) . szignifikánsan javította a statisztikát, ami a TRIO és az egész szindróma ASD-szerû szindrómákkal való együttmûködéséhez vezetett (P-8 érték; 3. kiegészítõ táblázat). Még erősebb összefüggést találtunk az R1-gyel interakcióban lévő RF1/DH1 aldomain ASD-vel kapcsolatos szindrómáival (7 eset a várható 0, 06, P-13 értékhez képest; 3. kiegészítő táblázat).

Úgy gondolják, hogy a Trio ASD-mutációi megváltoztatják a Rac1-aktivációt

Az ASD-vel kapcsolatos DH1 mutációk várható hatásai a Rac1 aktivációra. A GEF1 domént a teljes fehérje összefüggésében fentebb mutatjuk be, a GEF1 domént szaggatott piros négyzettel azonosítjuk. Az alábbiakban áttekintjük a Trio-GEF1 és Rac1 komplex szerkezetét, a két kölcsönhatásban lévő fehérjét kék és narancs karikatúrákként mutatjuk be (2NZ8 fehérjeskód). Az ASD-vel kapcsolatos betegségekben mutálódott aminosavmaradékokat bíbor szénatomot tartalmazó gyöngyökként mutatjuk be. A kevert betétek kölcsönhatást mutatnak a vad típusú és a mutáns fehérje aminosavmaradékai között. A vad típusú maradványokat pálcikával jelölik, és a szénatomok lila színűek. A mutált aminosavakat zöld vagy sárga szénatomok mutatják. A hidrogénkötéseket/sóhidakat szaggatott vonalak mutatják. A GEF1-Rac1 kölcsönhatásokban résztvevő vízmolekulákat átlátszó vörös gyöngyök jelzik

Teljes méretű kép

Asztal teljes méretben

A Trio-9 I1329HLAL * expressziója gátolja a szinaptikus funkciót

Teljes méretű kép

40% -kal csökken az AMPAR-eEPSC amplitúdója (4h, j. Ábra). A Trio-9 I1329HLAL * expresszió nem volt hatással az NMDAR-eEPSC amplitúdójára (4i, k ábra). Ez a fenotípus figyelemre méltóan hasonlított a Trio shRNS-sel megfigyelt fenotípushoz. A párimpulzus (PPF) teljesítményét a Trio-9 I1329HLAL * posztszinaptikus expressziója sem változtatta meg, jelezve, hogy ennek a mutánsnak az expressziója nem befolyásolta a preszinaptikus glutamát felszabadulást (41. ábra).

A Trio-9 K1431M expressziója gátolja a szinaptikus funkciót

Ezután megvizsgáltuk a Trio missense mutációt, a Trio-9 K1431M-et. Egy ilyen mutációval rendelkező egyén súlyos autista tüneteket és mentális retardációt mutatott. Meg kell jegyeznünk, hogy egy korábbi vizsgálat, amely alanin-szkenneléssel végzett mutációkat használt a GEF1 Trio régióban található fontos maradékok azonosítására, azonosította ezt a maradékot az R1428-mal együtt a Rac1-aktiváció szempontjából kritikus tényezőként. A K1431M mutáció modellezésével számos hidrogén és víz által közvetített kölcsönhatás megszakadását jósoltuk, ami csökkent affinitáshoz vezetett a Trio GEF1/DH1 és Rac1 domének között (3. ábra és 2. táblázat). A FLIM-elemzés azt mutatta, hogy a Trio-9 K1431M, hasonlóan a Trio-9 I1329HLAL * -hoz, jelentősen csökkentette a Trio-9 azon képességét, hogy aktiválja a Rac1 bioszenzort HEK293 sejtekben (5b. Ábra). Az előrejelzés szerint ezt a mutációt erősen csökkentette a Rac1-aktiváció. Ezután a Trio-9 K1431M-et expresszáltuk CA1 piramis idegsejtekben, és megállapítottuk, hogy a Trio-9 K1431M fenokópikus Trio-9 I1329HLAL *. Trio-9 K1431M okozta

Az AMPAR-eEPSC amplitúdójának 50% -os csökkenése (5c. Ábra), ami valószínűleg a néma szinapszisok növekedésének is köszönhető, mivel a kvantumtartalom csökkenése következett be az NMDAR-eEPSC amplitúdójának változása vagy a PPF változása nélkül. 5d-f). A vad típusú Trio-9-hez hasonlóan az NMDAR-eEPSC amplitúdóinak változását a Trio-9 K1431M-et expresszáló neuronokban a kvantumtartalom ingadozása okozta (4c. Kiegészítő ábra). Összességében ezek az adatok azt jelzik, hogy a Trio-9 K1431M, hasonlóan a Trio-9 I1329HLAL * -hoz, valószínűleg szinapszisokban versenyez az endogén, vad típusú Trio-val, és az AMPAR szinaptikus funkciójának csökkenéséhez vezet. Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy a Trio GEF1 domén missense mutációja, amelyet ASD (Trio-9 S1575N) 28 nélküli egyénnél azonosítottak, nem befolyásolta a Trio-9 képességét az AMPAR-eEPSC amplitúdójának növelésére a CA1 piramisban. idegsejtek (Kiegészítő 1a. ábra). a 5).

Teljes méretű kép

A Trio-9 P1461T expressziója gátolja a szinaptikus funkciót

Teljes méretű kép

A Trio-9 D1368V Trio hiperfunkciót eredményez

A Trio mutációk és az ASD specifikus társulását annak szoros paralógjának, a Kalirinnek az elemzése támasztja alá, amelynek egyedülálló fejlődési expressziós profilja van. Az ASD-vel összefüggő missense mutációkat nem figyeltek meg Kalirinben, bár hasonló szerepet játszottak a glutamaterg szinapszis szabályozásában 9. A trió nagyon kifejeződik a korai posztnatális fejlődésben, és 10 évesen csökken. Ezzel szemben a Kalirin-expresszió csak a 11., 12. serdülőkorban ér el csúcspontot. Különösen a calirin funkciója kapcsolódik későbbi neuropszichiátriai rendellenességekhez, például skizofrénia és Alzheimer-kór 38, 39, 40, 41. A Kalirin GEF1/DH1 doménjében mutációt találtak, amely gátolta a Rac1 aktiválódását skizofréniában szenvedő egyénnél is. Tehát úgy tűnik, hogy a Trio és a Kalirin expressziós profilja összhangban van azokkal a betegségekkel, amelyekben részt vesznek, ami arra utal, hogy a szinaptikus szabályozás Rac1 által közvetített zavarai az agy fejlődésének különböző időpontjaiban különböző agyi betegségekhez vezetnek .,

A közelmúltban kiderült, hogy a szinaptikus Rac1 által közvetített aktin-szabályozás zavarai alapozzák az ASD-vel kapcsolatos viselkedési fenotípusok kialakulását az ASD-vel kapcsolatos betegségek jól bevált állatmodelljeiben 5, 6, 7. Egy nemrégiben elvégzett tanulmány a Rac1-et számos ASD kockázati gén valószínű konvergenciapontjának is meghatározta 8. Itt azonosítjuk a szinaptikus aktin szabályozó fehérje, a Trio Rac1 aktivációs doménjét, mint az ASD-vel kapcsolatos de novo mutációk hotspotját. Mivel a glutamaterg neurotranszmisszió szabályozatlanságáról feltételezik, hogy az ASD számos állatmodelljében a viselkedési fenotípusok alapulnak, és mivel a Trio-aktivitástól lefelé eső fehérjékről nem találták, hogy jelentős ASD-vel kapcsolatos mutációkat hordoznának, csábító spekulálni, hogy a megváltozott Trio-funkció egy fő pontot jelent az ASD kialakulásához vezető számos tényező konvergenciája. A továbbiakban meg kell határozni a megváltozott Trio funkció prevalenciáját ASD-ben szenvedő egyénekben, és meg kell állapítani, hogy alkalmazható-e Trio-kezelés a ASD-vel kapcsolatos viselkedési fenotípusok visszafordítására a betegségben szenvedő betegek jelentős számban.

mód

Mutációs modellezés

A mutációk stabilitásra és kötődésre gyakorolt ​​hatását a Trio GEF1 Rac1 komplex nagyfelbontású kristályszerkezetével jósoltuk (2NZ8 PDB kód). A számításokat ICM molekuláris modellező szoftver (Molsoft LLC) segítségével hajtottuk végre. A mutáns fehérje konformáció energiaoptimalizálását torzított valószínűségű Monte Carlo algoritmus alkalmazásával hajtottuk végre. A fehérje stabilitásának ∆∆ G stabilitása (1) és a fehérje kötése binding G kötése (2) szabad energiaváltozását ezután a mutáns és a vad típusú fehérje összecsukódó vagy megkötő szabad energiájának különbségeként számoltuk:

Azok a mutációk, amelyek bindG kötődése> 2 vagy ∆∆G stabilitása> 2 volt, a Rac1 Trio-aktivációjának zavaró hatásának számítottak.

Kísérleti konstrukciók

Az emberi Trio-9-et (vagy a 13. hivatkozásban szereplő Trio-9-et) egy Trio-FL cDNS-ből állítottuk elő, amelyet bőkezűen dr. Betty A. Eipper (Connecticuti Egyetem). Az ASD-hez kapcsolódó Trio mutációkat Trio-9 cDNS-ből készítettük átfedés-kiterjesztésű PCR alkalmazásával, majd In-fúziós klónozással (Clontech). Valamennyi plazmidot DNS-szekvenálással igazoltuk. A trio-9 cDNS-eket IRES-mCherry-t tartalmazó pCAGG-vektorba klónoztuk. A csak GFP-t expresszáló pFUGW vektort pCAGG-IRES-mCherry konstrukciókkal együtt expresszáltuk a transzfektált idegsejtek azonosításának fokozása érdekében, és ezt használtuk kontroll vektorként a gerinc képalkotásához. A Rac1 bioszenzor konstrukció a pTriEx-HisMyc gerincen belül volt, korábban a ref. 30 és bőkezűen biztosította dr. Jaap D. van Buul (Sanquin).

HEK293 sejttranszfekció

A HEK293T sejteket (ATCC) DMEM-ben 10% FBS-sel tenyésztettük 5% CO 2 -ot tartalmazó 37 ° C-os inkubátorban. A sejteket Matrigellel bevont, 35 mm-es üvegfenekű lemezekre szélesztjük. A sejteket 50% -os összefolyásig növesztettük, mielőtt a Trio-9 expressziós konstrukcióval transzfektáltuk volna a Rac1 bioszenzorral együtt, FuGENE HD transzfekciós reagens alkalmazásával. 1: 1 Trio-9/Rac1 bioszenzor DNS arányt alkalmaztunk. A lemezes sejteket 16 órán át inkubáltuk a transzfekciós keverékben, majd friss táptalajjal helyettesítettük. HEK293 kísérleteket hajtottunk végre

20 órával a transzfekció után.

Élettartamú fluoreszcencia képalkotás (FLIM)

$$ E = 1 - \ tau DA> \ tau D $$

A FRET bioszenzor fázisát az aktivátor hiányában független készítményből nyertük. A kioltott donornak megfelelő fázist a (3) kioltási egyenlet alapján számítottuk ki. Az összes lehetséges fázis helyzete, amelyet különböző hatékonysággal csillapítanak, egy görbe pályát írnak le a fázis-ábrán. Egy adott pixel fázisának kísérleti helyzete a pálya mentén meghatározta a kioltás mértékét, és ezáltal a FRET hatékonyságát. A háttér és az akceptor nélküli donor hozzájárulását a 49, 52 lineáris kombináció szabályának alkalmazásával értékelik, a háttérfázist és a donort nem csillapítva függetlenül határozzák meg. Az összes fázis transzformációt és a FLIM adatok adatelemzését SimFCS szoftverrel (Kaliforniai Egyetem, Irvine) végeztük.

elektrofiziológia

Gerincsűrűség-elemzés

A gerincsűrűség elemzéséhez P6 patkány kölykökből készült organotipikus hippokampus szelet tenyészetekben kontroll és kísérleti CA1 piramis idegsejteket biolisztikusan transzfektáltunk FUGW-GFP és pCAGGS-IRES-mCherry konstrukciókkal a lemezezés után kb. 18–20 órával. A képeket a DIV 7-nél szuperfelbontású mikroszkóppal (Elyra Microscope System, Zeiss) készítettük. A rendelkezésre álló invertált mikroszkóppal és olajimmerziós objektívlencsével történő alkalmazáshoz a szeleteket 4% PFA/4% szacharóz PBS-ben rögzítettük és háromszor PBS-sel mostuk. A GFP szignál erősítése érdekében a szeleteket blokkoltuk, majd 3% BSA-ban, 0,1% Triton-X-et tartalmazó PBS-ben permeabalizáltuk, és GFP elleni elsődleges antitesttel (2 μg/ml, Life Technologies A-11122) festettük, majd PBSTx-ben mostuk és festettük. Alexa 488-konjugált szekunderrel (4 μg/ml, Life Technologies A-11034). A szeleteket tovább dolgoztuk egy rövidített SeeDB-alapú 55-ös protokollal, hogy megpróbáljuk csökkenteni a gömbös aberrációt. A szeleteket ezután SlowFade Gold-ba (Life Technologies) szerelték fel képalkotás céljából. A Z-kötegeket 30 µm szekunder apikális dendrit szakaszokból készítettük

30 km-re a somától. A képeket 100 × olajobjektívvel (100 ×/1,46) készítettük SIM módban, a mellékelt 42 μm-es SIM-rács segítségével, és a mellékelt szoftver (Zen, Zeiss) segítségével feldolgoztuk és rekonstruáltuk. Egy kísérletező, elvakítva a kép állapotát, képelemzést végzett az egyes szakaszokon az ImageJ alkalmazásával a dendrittől oldalirányban kinyúló tüskék számlálásához.

Statisztikai analízis

A Trio ASD-vel kapcsolatos mutáció statisztikájához egy egyszerű Poisson-tesztet használtunk, hasonlóan a Samocha et al. 29. A trio fehérjében várható de novo mutációk számát 4890 ASD-vel kapcsolatos rendellenességben szenvedő egyénnél a gén-specifikus mutáció valószínűsége alapján számítottuk ki, Samocha és mtsai. A Trio-GEF1/DH1 doménben a de novo mutációk várható számát úgy becsültük meg, hogy a Trio-ban a várható mutációk számát átértékeltük, feltételezve, hogy a gén mentén az mutáció valószínűsége egyenlő. A genom egészére kiterjedő szignifikancia küszöbérték P-értéke −6 volt. Az eEPSC amplitúdó párosított elektrofiziológiai felvételeihez Wilcoxon Signed Rank tesztet alkalmaztunk a párosított adatokhoz. A Wilcoxon Rank Sum teszteket használtuk az elektrofiziológiai adatok összehasonlítására független körülmények között. A párosított pulzus-megkönnyítési méréseket és a gerincsűrűség-adatokat párosított és párosítatlan Student-féle t-teszt alkalmazásával elemeztük. Az összes elvégzett statisztikai teszt kétoldalas volt, és az összes teszt P-értéke