termogén

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • az eredmény
  • A termogén program aktiválása a GSH csökkenésével jár
  • A BSH kezeléssel történő GSH-kimerülés szelektíven befolyásolja a zsírszövetet, és alakjának átalakulását idézi elő
  • A BSO kezelés a zsírsejtek barnulását és mitokondriális leválását indukálja a Fox01 által
  • vita
  • mód
  • Sejtvonalak, kezelések és transzfekciók
  • Egerek és kezelések
  • A mitokondriumok izolálása
  • A fehérje karbonilezésének meghatározása
  • Gélelektroforézis és Western blot
  • RT-qPCR elemzés
  • A GSH szint meghatározása
  • Mitokondriális membránpotenciál és glükózabszorpciós teszt
  • immunhisztokémia
  • Oxigénfogyasztás
  • Statisztikai analízis
  • További részletek
  • A változások története
  • További információ
  • PDF fájlok
  • További információ
  • Hozzászólások

elemeket

Ez a cikk frissült

absztrakt

A zsírszövetnek többféle metabolikus funkciója van, és elsősorban az energia homeosztázis szabályozásában vesz részt. A hagyományos nomenklatúrában a zsírszövet fehér és barna, makroszkopikus megjelenésétől függően. A fehér zsírszövet (WAT) fehér zsírsejtekből áll, és általában semleges lipidek energiatartalmának tekintik. A WAT a felesleges kalóriákat tárolja más szövetekben történő felhasználáshoz tápanyaghiány esetén. A barna zsírszövet (BAT) elsősorban a hőszabályozás helyszíne. A BAT valójában egy oxidatív szövet, amely teljes aktiválásakor a barna adipocitákban tárolt zsírsavakat használja fel az 1-es leválásfehérje (Ucp1 vagy termogenin) aktivitásának elősegítésére, amely a mitokondriális protongradiens szétszóródását termeli.

A WAT nagy plaszticitást képes elérni, és az élet során folyamatosan átalakul számos környezeti ingerre (gyógyszer, tápanyag stb.) És fiziológiai körülményekre (pl. Öregedés, elhízás) reagálva. A jellegzetes barna adipocitákkal rendelkező sejtek váratlan jelenlétét a WAT ​​4, 5 sz. Az adipociták osztályozását ezért nemrégiben frissítették. Különösen a barnás (barnásfehér) vagy a bézs színű adipocitákat nevezik meg a WAT-ban található barna sejtek megkülönböztetésére a fehér és barna adipocitáktól 6, 7. Fontos, hogy olyan fiziológiai ingerekkel, mint a testmozgás és a hidegnek való kitettség, a WAT ​​kialakulhat egy barna, 8., 9., 10., 11. fenotípus felé. E folyamat (barnulás) során a klasszikus BAT gének expressziója elindul a WAT-ban, ami növeli az energiafogyasztást és súlycsökkenéshez vezet. Ennek eredményeként a WAT ​​barnulás pozitív hatással van az elhízás zsírérzékenységére, az inzulinrezisztenciára és a hiperlipidémiára 2, 12. Azonban olyan kóros állapotok, mint a gyulladás és a rák, szintén a WAT ​​barnulását okozzák 13, 14, 15 .

Nagy új konszenzus van abban is, hogy az anyagcserében aktív BAT emberekben, az újszülöttektől a felnőttekig 16, és a BAT alacsonyabb szintje az elhízással és a cukorbetegséggel jár 17, 18. Ez újból felkeltette érdeklődését a BAT funkció iránt, és a toborzás hatása a test energia teljes anyagcseréjére. Az energiafogyasztás növelése WAT pörkölés vagy BAT aktiválás révén tehát vonzó cél az elhízás és a kapcsolódó kórképek kockázatának csökkentésére 17, 18 .

A génexpresszió komplex útja szabályozza az adipocita fenotípus kialakulását és a specifikus inputokra adott metabolikus választ. A közelmúltban kimutatták, hogy a zsírsejtek anyagcseréjét és differenciálódását szervező gének indukcióját az intracelluláris redox állapot 19, 20 változásai indukálják. Ezenkívül úgy tűnik, hogy a redoxpotenciál modulálja a mitokondriális anyagcsere hatékonyságát 21. Ebből a szempontból a barna adipocita mitokondriumokban magasabb a reaktív oxigénfajok (ROS) termelődése és oxidáltabb állapotuk a többi sejttípushoz képest 21. A hidegnek való kitettség tovább áthelyezi a barna adipociták redox mitokondriumait prooxidatív állapotba, és ez az esemény szükséges a BAT mitokondrium 21 megfelelő működéséhez. Ezek a megfigyelések egy nagyon különleges BAT-jellegzetességet sugallnak minden olyan szövet számára, amelyek funkciójukra támaszkodva reduktívabb környezetben vannak 22, 23 .

A glutation (GSH) a tiol-diszulfid fő redoxirendszere minden sejttípusban 24, és koncentrációjának változásai széles körben elismertek a sejtek differenciálódásának elősegítésére25. Az elmúlt években bebizonyosodott, hogy a zsírszövet fiziológiájának számos aspektusa szorosan függ a GSH 26, 27, 28 redox rendszerétől. Az adipocita differenciálódást olyan körülmények segítik elő, amelyek elősegítik az intracelluláris rekeszek oxidációját 29. Különösen a GSH és a GSSG aránya az oxidatív körülmények között változik a 28., 30. adipogenezishez, és a GSH kimerülése a differenciálódás során felgyorsítja a fehér adipociták érését és növeli a trigliceridek 28 felhalmozódását. Érdekes módon minden olyan állapot, amelyről beszámoltak a BAT aktiválásának és/vagy a WAT ​​barnulásának megakadályozásáról (pl. Akut testmozgás, megfázás, gyulladás és rák) önmagában stresszes jelek, amelyek oxidatív stresszel társulnak, és figyelemre méltó elmozdulást okozhatnak a a GSH redox szintje. a prooxidációs körülmények állapota a plazmában és a szövetekben 14, 31, 32. Ezen bizonyítékok ellenére a GSH szerepe a BAT aktivitás és a WAT ​​barnulás modulálásában teljesen ismeretlen.

Ebben a jelentésben megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy a GSH koncentrációjának csökkentése barnulási folyamathoz vezethet. Kimutattuk, hogy a zsírsejtek barnulása során a GSH szintje csökken, és hogy a GSH szintézis nem toxikus gátlójával kezelt butionin-szulfoximin (BSO) a nem szegregált légzőszervi gének (pl. Ucp1 és Ppargcla) up-szabályozását indukálja barna és fehér színben zsírsejtek. Fontos, hogy azt is megállapítottuk, hogy a Fox01 redox-érzékeny transzkripciós faktor indukciója elengedhetetlen a barnulási reakcióhoz.

az eredmény

A termogén program aktiválása a GSH csökkenésével jár

( A ) Az Ucp1 mRNS szintjét RT-qPCR-rel mértük eWAT-ban és BAT-mal egerekben, amelyeket hidegnek tettünk ki (4 ° C 20 órán át). Az adatokat a kontroll egerek (21 ° C) relatív indukciójaként adjuk meg, és átlag ± SD értékként fejezzük ki (n = 3 egér csoportonként;

( A ) A GSH-tartalmat HPLC-vel mértük eWAT-ban és BAT-tal BSO-kezelt egerekből (20 mM ivóvízben) 5 hétig (bal oldali panel). A fehérje oxidációját a karbonil maradékok tesztelésével határoztuk meg Western blot analízissel (jobb oldali panel). Az aktint használták terhelés kontrollként. Az alábbiakban az aktinnal normalizált immunreaktív sávok densitometriai elemzését mutatjuk be. Az eredeti teljes hosszúságú blotokat a 2. sz. ÁBRA. S3. Az adatokat nmol GSH/mg fehérjeként adjuk meg, és átlag ± SD-ként fejezzük ki (n = 4 egér csoportonként, * p

( A ) A Ppargcla, Ppara, Ucp1, Fgf21, Cidea és Dio2 mRNS-szintjeit BSO-val kezelt egerek zsírszövetében mértük 24 órán át (20 mM ivóvízben). Az adatokat a kontrollhoz képest ötszörös indukcióként adjuk meg, és átlag ± SD-ként fejezzük ki (n = 4 egér csoportonként; * p 10-4 sejt), és átlag ± SD értékként fejezzük ki (n = 4; * p 3, 40)., az egerek hidegre szerelt termogén készülékét és a 3T3-L1 sejtekben található izoproterenolt szintén Fox01 indukció jellemezte (4A, B ábra). Korábbi GSH észterrel végzett kezelés, amelyről kimutattuk, hogy jelentősen enyhíti az adipocita barnulást, figyelemre méltó hogy a GSH csökkentése BSO-kezeléssel képes volt hatékonyan szabályozni a Fox01 szintjét mind a WAT, mind a 3T3-L1 adipocitákban, utánozva a kezelés során megfigyelteket.

( A ) A Fox01 szinteket Western blotokkal detektáltuk eWAT-ban és BAT-ban hidegnek kitett egerekben (4 ° C 20 órán át). Az alábbiakban az aktinnal normalizált immunreaktív sávok densitometriai elemzését mutatjuk be. Az eredeti teljes hosszúságú blotokat a 2. sz. ÁBRA. S5. Az adatokat az eWAT 21 ° C-hoz viszonyított változásaiként számolják, és átlag ± SD-ként fejezik ki (n = 3 egér csoportonként, ** p 8, 9, 10, 11). prooxidációs állapotok: 14, 31, 32. A tiol-alapú reakciók nagymértékben részt vesznek számos sejtes folyamat szabályozásában, ideértve a sejtek 33, 34 differenciálódását is. .

A Fox01 egy redox-érzékeny transzkripciós faktor, amely finoman modulálja a zsírsejtek metabolizmusát a zsírsejtekben 1. Az Ucp139 fehérje indukciója szintén szerepet játszik a Fox01 szerepében a zsírszövet metabolizmusában. Ennek megfelelően azt állítottuk, hogy a barna rokon gének, például az Ucp1 expresszióját a BSO modulálja a FoxO1 útvonalon keresztül fehér adipocitákban. Valójában a GSH észter kiegészítés hatékonyan korlátozza a Fox01 aktiválódást és az Ucp1 gén expressziót.

Összességében megállapításaink hangsúlyozzák a GSH redox rendszer döntő szerepét az adipociták metabolikus adaptációjában a fokozott energiaszórás révén. Az I. fázisú klinikai vizsgálatok folyamatos BSO infúzióval kimutatták, hogy a GSH kimerülhet indokolatlan normális szöveti toxicitás nélkül 55, 56. Ezért, mivel a WAT ​​és a BAT mitokondriális leválasztása révén képes a felesleges energiát eloszlatni, a BSO a jövőbeni tanulmányokban olyan anyagnak tekinthető, amely erős terápiás potenciállal rendelkezik az anyagcsere-betegségek kezelésében.

mód

Sejtvonalak, kezelések és transzfekciók

Egerek és kezelések

Minden egérkísérletet az emberi állatok gondozásának elfogadott szabványa szerint, valamint az illetékes nemzeti bizottságok (gondozási minisztérium) és helyi bizottságok (intézményi állatgondozás és felhasználás, Tor Vergata Egyetem) beleegyezésével hajtottak végre. Tizenhat hím C57BL/6 egeret (1 hónapos) (a Harlan Laboratories Srl-től, Urbino, Olaszország) vásároltunk véletlenszerűen 2 csoportra: kezeletlen egerekre (kontrollcsoport, n = 8 egér) vagy BSO-val kezelt egerekre (BSO, n = 8 egér). A BSO-val kezelt egereket véletlenszerűen két alcsoportra osztottuk: 24 órán át kezelt egerekre (n = 4 egér) vagy 5 hétig kezelt egerekre (n = 4 egér). A BSO-t ivóvízzel adagoltuk 20 mM végkoncentrációban. Hat 6 hetes C57BL/6 hím egeret véletlenszerűen két csoportba osztottak: szobahőmérsékletű csoportba (kontrollcsoport, 21 ° C) vagy hideg csoportba (4 ° C). A hideg expozíciót 20 órán át tartottuk. Az összes egeret 12 órás világos/sötét ciklusokban helyezték el, és szabadon hozzáférhettek az élelemhez és a vízhez. A méhnyak elmozdulása után a szöveteket megmagyarázták és azonnal feldolgozták.

A mitokondriumok izolálása

A nyers zsírszövet mitokondriumokat Wieckowski és mtsai. 58. A 3T3-L1 és a T37i tisztított mitokondriumait Kristian és mtsai. 59 némi módosítással. Röviden, a sejteket 4 ° C-on homogenizáló pufferben (210 mM mannit, 70 mM szacharóz, 5 mM HEPES, pH 7,4) lizáltuk EGTA-val (Sigma-Aldrich), 0,5% albuminnal és proteáz és foszfatáz inhibitorokkal kiegészítve (Sigma- Aldrich)) és centrifugáltuk 600 xg-n 3 percig 4 ° C-on a magok és nehéz részecskék granulálására. A felülúszót összegyűjtöttük és 17 000 x g-vel 17 percig 4 ° C-on centrifugáltuk a mitokondrium granulálására, majd ezt követően kétszer mossuk centrifugálással 17 000 x g-vel 15 percig 4 ° C-on.

A fehérje karbonilezésének meghatározása

A karbonilezett fehérjéket az Oxyblot Kit (Merck Millipore, Darmstadt, Németország) alkalmazásával detektáltuk az előzőekben leírtak szerint Röviden: 15 μg fehérjét reagáltattunk 2,4-dinitrofenilhidrazinnal (DNP) 15 percig 25 ° C-on. A mintákat 10% -os SDS-poliakrilamid géleken futtattuk, és a DNP-származékokat fehérjéket azonosítottuk Western-blot alkalmazásával anti-DNP alkalmazásával. antitest és megfelelő torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitest.

Gélelektroforézis és Western blot

A nyers mitokondriumokat, a sejtpelleteket, az eWAT-ot és a BAT-t RIPA pufferben (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 12 mM dezoxikolsav, 0,5% Nonidet P-40, proteáz és foszfatáz inhibitorok) lizáltuk. Proteinmintákat használtunk az SDS-PAGE-hoz, amelyet Western-blotolás követett. A nitrocellulóz membránokat primer anti-β-aktin antitestekkel, Fox01 (Santa Cruz Biotechnologies), vDAC, Ucp1 (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), pHSL, PKA-Ser-szubsztrátokkal (Cell Signaling Technologies, Danver, MA, USA) festettük, GSH. (Enzo Lifescience, Farmingdale, NY, USA) és 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) hisztidin (finoman adományozta Prof. Uchida, Bioagricultural Science School, Nagoya University, Japán), mindegyik hígítva 1: 1000. inkubáltuk a megfelelő torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel, és immunreaktív sávokat detektáltunk Fluorchem Imaging System alkalmazásával, miután ECL-szelektált Western Blotting detektáló reagenssel festettük (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA). Az ábrákon bemutatott immunblotok legalább három, hasonló eredményeket felmutató kísérletet reprezentálnak.

RT-qPCR elemzés

A teljes RNS-t TRI Reagent® (Sigma-Aldrich) alkalmazásával extraháltuk. Három μg RNS-t alkalmaztunk M-MLV-vel végzett retró transzkripcióhoz (Promega, Madison, WI). A qPCR-t három példányban hajtottuk végre validált qPCR primerek (BLAST), Ex TAq qPCR Premix és valós idejű PCR LightCycler II (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) felhasználásával, a korábban leírtak szerint 40. Az MRNS szinteket az aktin mRNS-re normalizáltuk, és a relatív mRNS szinteket 2-AAC módszerrel határoztuk meg .

A GSH szint meghatározása

Az intracelluláris GSH-t és a GSSG-t a szabad tiolok jód-ecetsavval képzett S-karboxi-metil-származékainak jódecetsavval történő képződése után, majd a szabad aminocsoportok átalakításával 2,4-dinitrofenil-származékká alakítottuk át, 1-fluor-2,4-dinitrobenzollal reagáltatva a fentiek szerint. 60 .

Mitokondriális membránpotenciál és glükózabszorpciós teszt

A mitokondriális transzmembrán potenciális sejtek értékeléséhez a sejteket a citofluorimetriás elemzés előtt inkubáltuk Mitotracker Red-rel (Life Technologies Ltd) 200 nM (30 perc, 37 ° C) koncentrációban. A glükózfelvétel mérésére a sejteket a citofluorimetriás elemzés előtt inkubáltuk fluoreszcens glükózanalóg 2-NBDG-vel (Life Technologies Ltd) 100 μM (30 perc, 37 ° C) koncentrációban.

immunhisztokémia

A zsírszöveteket megmagyaráztuk, és egy éjszakán át azonnal rögzítettük formalin oldatban (Sigma-Aldrich), vízzel mostuk, dehidratáltuk és paraffinba ágyazottuk. A parafinba ágyazott szöveteket 7 μm-es metszetekre vágtuk, és hematoxilinnal és eozinnal (H&E) vagy Ucpl antitesttel festettük. A bemutatott képek reprezentatívak egy kísérletből a négyből, amelyek hasonló eredményeket adtak. Az adipocita méretét és a területenkénti számát ImageJ (Adipocytes Tool) segítségével számoltuk ki.

Oxigénfogyasztás

Az oxigénfogyasztást fehér 3T3-L1 és barna T37i adipocitákban határoztuk meg Oxygraph Plus oxigénelektróda rendszerrel (Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, Egyesült Királyság). A differenciálás végén a sejteket 24 órán át BSO-val kezeltük, összegyűjtöttük és komplett táptalajjal oxigrafikus kamrában újraszuszpendáltuk. A valós idejű oxigénfogyasztást 28 ° C-on 5 percig regisztráltuk.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SD-ként mutatjuk be. A statisztikai értékelést az ANOVA végezte, amelyet Student-Newman-Keuls követett. A különbségeket P szempontjából szignifikánsnak tekintették