elemeket

absztrakt

A fő

A kihasználtság gyors növekedésével és a keresztmetszeti hasi képalkotás folyamatos fejlődésével a hasnyálmirigy-ciszták kimutatása egyre gyakoribb. A hasnyálmirigy-cisztákról a beszámolók szerint a hasi számítógépes tomográfia 1,2% -2,6% -át azonosítják. A prevalencia az életkor előrehaladtával növekszik, és a boncoláskor a betegek 24% -ának hasnyálmirigy-cisztája van. 3 A pszeudocisztákról történelmileg úgy gondolják, hogy ezek a hasnyálmirigy-ciszták többségét teszik ki, de ezen elváltozások többsége cisztás neoplazma. Ezen daganatok közül sok, köztük a szeros cystadenoma, jóindulatú és klinikailag ellenőrizhető. Ezzel szemben az intraduktális papilláris mucinos neoplazmák (IPMN) és a mucinos cisztás neoplazmák (MCN) potenciálisan invazív hasnyálmirigy-adenokarcinómává válhatnak. 4, 5, 6, 7 Ezt követően nemzetközi konszenzus iránymutatásokat dolgoztak ki és frissítettek az IPMN és az MCN kezelésére. 8., 9. Ezért a pontos diagnózis elengedhetetlen a megfelelő betegellátáshoz.

A PANDA tanulmányt követően integráltuk a KRAS mutációs elemzést a hasnyálmirigy cisztás neoplazmák rutinszerű értékelésének részeként. Ebben a cikkben beszámolunk a KRAS teszteléssel kapcsolatos klinikai és kóros tapasztalatainkról, hogy: (1) azonosítsuk a cisztamutációk prevalenciáját nagy mennyiségű hasnyálmirigy-ciszta szolgáltatásban; (2) értékeli a KRAS tesztelés szerepét a mucin és a nem mucin ciszták megkülönböztetésében; és (3) korrelálja a KRAS-elemzést más elfogadott diagnosztikai módszerekkel a cisztás hasnyálmirigy-daganatok diagnosztizálásában.

Anyagok és metódusok

esetek

A tanulmány jóváhagyását a Pittsburghi Egyetem Intézményi Felülvizsgálati Testülete kapta meg. Adatokat gyűjtöttünk minden olyan esetben, amikor hasnyálmirigy-ciszta folyadékot juttattak a Pittsburghi Egyetem Orvosi Központjába, amely a molekuláris anatómiai patológia részlege a KRAS-elemzéshez. Finom tűből nyert endoszkópos ultrahang-aspirációt olyan betegektől nyertek, akiket a pittsburghi orvosi központban figyeltek meg 2006 novemberétől 2012 októberéig. A mintákat minden esetben endoszkóppal mutattuk be, annak bizonytalansága miatt, hogy a hasnyálmirigy-ciszta cisztás neoplazma volt-e. Például azokat az álcisztás betegeket, akiknek dokumentáltan hasi traumája volt, gyakran kizárták a folyadék beadásából. Azok a betegek, akiknek endoszkópiával és képalkotással nagy a klinikai gyanúja a fő csatorna IPMN-re, szintén tartózkodtak az elemzéstől, mert a további vizsgálatok nem befolyásolják a beteg kezelését. Az orvosi dokumentációkat a betegek demográfiai adatainak, az endoszkópos ultrahang megállapításainak, a folyadék viszkozitásának (az endoszkóp által rögzítettnek), a CEA elemzés és a citopatológiai diagnózisok dokumentálása céljából áttekintették.

Az endoszkópos ultrahang finom tűszívásakor, ha a hasnyálmirigy-ciszta folyadék körülbelül 750 μl vagy annál nagyobb volt, akkor legalább 500 μl-t először lebontottak a CEA-elemzéshez, 200 μl-t a molekuláris elemzéshez, a fennmaradó részt pedig a citológiahoz, amely magában foglalja a tű öblítését. . Egyes esetekben az amilázt is értékelték. Azokban az esetekben, amikor 200–750 μl cisztafolyadék volt, elsőbbséget biztosított a citológia, amely magában foglalja a tűöblítést és 200 μl a molekuláris elemzéshez; a CEA esetében nem adtak be folyadékot az elemzéshez szükséges folyadék hiánya miatt. 9 Tekintettel a tanulmány időkeretére, a 2012-es Nemzetközi Konszenzus nemrégiben közzétett iránymutatásait nem alkalmazták szigorúan a művelet kritériumainak értékelésekor. A reszekciót követően a hematoxylinnel és az eozinnal festett tárgylemezeket megvizsgáltuk a szövettani diagnózis megerősítésére, vagy a dysplasia mértékének felmérésére és a reszektált IPMN-ek szövettani altípusának osztályozására. 13.

CEA elemzés

A hasnyálmirigy-ciszta CEA-szintjét kéthelyes immunenzimatikus "szendvics" -vizsgálattal értékeltük, két monoklonális anti-CEA antitest alkalmazásával, amelyek különböző CEA epitópokkal reagálnak. Ezt a vizsgálatot egy Beckman Coulter Unicel DXI 800 készüléken hajtották végre. Az elemzés előtt a mintákat 2 órán át centrifugáltuk, és legalább 500 μl (optimális esetben 1 ml) sejttelen mintát adtunk a reakcióedénybe. A vizsgálatot minden esetben a hasnyálmirigy-ciszta finom tűszívásától számított 24 órán belül végeztük. A mintában jelenlévő CEA mennyiségét egy tárolt, többpontos kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg.

KRAS mutáció elemzés

A teljes genom DNS-t 200 μl cisztafolyadékból oszlopelválasztással izoláltuk a gyártó utasításai szerint (Qiagen, Valencia, Kalifornia, USA). Az izolált DNS mennyiségét NanoDrop 1000 spektrofotométerrel (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) határoztuk meg. A mutációk kimutatásához 10-50 ng DNS-t amplifikáltunk a KRAS gén 2 exonját szegélyező primerekkel (közvetlen 5'-GGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 'és reverz 5'-TCCTGCACCAGTAATATGCA-3' primer és a KRAS gén 3 'exonjával. TGAAGTAAAAGGTGCACTG-3 'és a reverz primer 5'-GCATGGCATTAGCAAAGACTC-3'). Ezután a PCR termékeket szekvenáltuk értelmes és antiszensz irányban is a BigDye Terminator v3.1 ciklikus szekvencia készlet segítségével egy ABI 3730-on (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a gyártó utasításainak megfelelően. A szekvenciaelektroferogramokat Mutation Surveyor szoftverrel (SoftGenetics, LLC, State College, PA, USA) elemeztük. Mindegyik esetet pozitívnak vagy negatívnak minősítették a KRAS mutációban a szekvenálási eredmények alapján.

Statisztikai analízis

A KRAS-mutáns ciszták és a CRAS-típusú patkányok közötti különbségek kiértékelésére szolgáló statisztikai elemzést Fisher dichotóm változók pontos tesztjével hasonlítottuk össze. Valamennyi teszt kétfarkú volt, és statisztikai szignifikanciát definiáltunk P értékként

karsztvizsgálat

KRAS- mutáns ág, intraduktális papilláris mucinous neoplazma (IPMN). a ) A hasnyálmirigy-testben endoszkópos ultrahanggal azonosítottak anechoikus és szeptikus cisztákat. A ciszta maximális keresztirányú átmérője 1,8 cm volt, és nem kommunikált a főcsatornával. Finom tűvel történő aspiráció után a folyadék kissé viszkózusnak bizonyult. b ) A citológiai kenet kevesebb volt, mint az optimális, és túlnyomórészt mucin volt kimutatható ritka histiocytákkal és limfocitákkal. A páciens distalis pancreatectomián esett át véletlenszerű hasnyálmirigy-neuroendokrin daganat miatt, de a ciszta ( c, d ) összhangban volt az elágazó csatornával, az alacsony fokú dysplasiaval és a gyomor nyálkahártyájával járó IPMN-vel.

Teljes méretű kép

A KRAS típusú 89 ciszták közül összesen 25 89 (28%) volt IPMN vagy IPMN asszociált adenokarcinóma. Ez magában foglalta az elágazó csatornák 10 (40%), a fő csatornák 7 (28%), a vegyes fő és elágazó IPMN csatornák 3 (12%) és az IPMN kapcsán felmerülő adenokarcinómák 5 (20%) IPMN-jét. A szövettani altípus alapján 12 (48%) gyomor, 9 (36%) bél és 4 (16%) hasnyálmirigy-epevezeték volt. A KRAS mutáns IPMN-ekhez hasonlóan az alacsony fokú dysplasia (25-ből 11, 44%) volt gyakoribb, ezt követte a mérsékelt (n = 8, 32%) és a magas (n = 6, 24%). Ismételten, a minta megfelelőségét tekintve, mint a KRAS mutációs státusz értékelésének tényezője, a 25 CRAS-típusú IPMN közül 25 (48%) 12, szemben az 50 (42%) mutáns KRAS IPMN-kel, a citopatológiai állapot szempontjából kevésbé volt optimális, vagy nem volt kielégítő. diagnózis.

A reszektált IPMN-ek között nem volt összefüggés a KRAS státus és a beteg neme (P = 0,22), az átlagos életkor (P = 0,60), az átlagos ciszta méret (P = 0,52), a ciszta elhelyezkedése (P = 0,46) között, cisztás góc (P = 0,63), a folyadék viszkozitását (P = 1,00), a CEA szinteket (P = 0,36) vagy az átlagos DNS-koncentrációt (P = 0,96) figyeltük meg. A KRAS mutációk prevalenciája azonban magasabb volt az IPMN-ben, amely magában foglalta az elágazó ágat (P = 0,03), a gyomor szövettani altípusát (P = 0,01) és az alacsony fokozatú kis dysplasia-t (P = 0,01). Ezenkívül a KRAS mutációk hiánya korrelált a bél típusú IPMN-rel (P = 0,04).

Nyálkahártya cisztás daganatok

Mind a 22 MCN-t 20 és 75 év közötti (átlagosan 46, 9 éves) nőknél azonosították. A ciszták 2,0 - 9,9 cm (átmérő, 4,5 cm) méretűek voltak, és a disztális hasnyálmirigybe helyezték őket. Tizenöt (67%) a hasnyálmirigy farkában, míg 7 (33%) a testben volt. Finom tűvel végzett endoszkópos ultrahangos aspiráció azt mutatta, hogy a cisztafolyadék 10 (45%) esetben vékony és vizes, 12-ben (55%) viszkózus. A CEA elemzést 22 (95%) MCN közül 21-nél végeztük, és 12-ben (55%) növekedett. A reszekció során a legtöbb MCN-nek alacsony fokú diszpláziája volt (16 22,73% -ból), míg a többi közepes fokú dysplasia volt (n = 6,29%). Összesen 22 22 (14%) MCN tartalmazta a KRAS mutációt (2. ábra). A KRAS típusú MCN-hez képest azonban nem figyeltek meg szignifikáns különbségeket a betegek demográfiai adataiban, az endoszkópos ultrahang eredményekben, a minta megfelelőségében, a cisztafolyadék elemzésében, az átlagos DNS-koncentrációban vagy a szövettani jellemzőkben. .

KRAS- mutáns mucinous cisztás neoplazma (MCN). ( a A hasnyálmirigy testében/farában endoszkópos ultrahanggal azonosították a visszhangot és a disztális erősítést. A ciszta maximális keresztirányú átmérője 6,5 cm volt. Több vékony rekeszt azonosítottak. A finom tűvel történő aspirációval nyert folyadék tiszta és vékony volt. ( b ) A citológiai kenet alacsonyabb volt, mint az optimális, de a citospin minta a mucin hátterében a ciszta tartalmának megfelelő szerény hisztocitaszámot mutatott. ( c, d ) A disztális pancreatectomia-minta sokrétű cisztát mutatott ki muccinás hámbéléssel. A magok egyenletesek és alapvetően orientáltak voltak. A ciszta bélése alatt a sűrű petefészek-típusú stromar összhangban volt az MCN-rel.

Teljes méretű kép

A KRAS státusz és egyéb endoszkópos ultrahang finom aspirációs eredmények összefüggése a műtéttel reszekált IPMN és MCN

Általánosságban elmondható, hogy a KRAS mutációk 100% -ban specifikusak voltak a mucinos differenciálódásra a műtétileg reszekált hasnyálmirigy-cisztákban, de csak 54% -os érzékenységgel. Összehasonlításképpen, a megnövekedett folyadékviszkozitás és a megnövekedett CEA alacsonyabb specificitással (69% és 85%), de nagyobb érzékenységgel (68% és 62%) rendelkezett. A neoplasztikus mucinos ciszta legalább gyanúsítottjainak citopatológiai diagnózisa hasonló specifitással, 73% -kal, de szignifikánsan alacsonyabb, 39% -os érzékenységgel rendelkezett. Az IPMN esetében a többszörös ciszták jelenléte 59% -os specificitással és 80% -os érzékenységgel rendelkezett. A KRAS pontmutációk és a megnövekedett CEA kombinációja mindkét vizsgálat érzékenységét 83% -ra javította, és a mucinos differenciálódás magas 85% -os specificitását fenntartotta. A folyadék viszkozitásának hozzáadása a KRAS-hoz és a CEA-hoz növelte az érzékenységet (90%), de a specificitás elvesztésével (64%). A multimodális megközelítés KRAS, CEA, folyadék viszkozitás és citológia alkalmazásával tovább növelte az érzékenységet 91% -ra, de csökkentette a specificitást 56% -ra.

Cisztatípus szerint rétegezve a KRAS specifitása és érzékenysége 95% és 67% volt az IPMN-eknél, szemben az 58% -kal és 14% -kal az MCN esetében. Bár az IPMN-ek gyakran multifokálisak, általában megnövekedett CEA-értéket mutatnak, és gyakran megnövekedett folyadék viszkozitást mutatnak, az egyes paraméterek specifitása alacsonyabb volt (86%, 69% és 66%) a KRAS-hoz képest. Ezenkívül az érzékenység vagy hasonló volt, vagy valamivel alacsonyabb volt (48%, 68% és 63%). Az MCN esetében az emelkedett CEA magasabb specifitással (71% vs. 58%) és érzékenységgel (55% vs. 14%) rendelkezett, mint a KRAS. Ezzel szemben a megnövekedett folyadékviszkozitás alacsonyabb, 48% -os, de magasabb érzékenységű, 55% -os volt. A vizsgálat összes MCN-je magányos volt.

vita

A PANDA tanulmány az eddigi legnagyobb multicentrikus teszt volt a hasnyálmirigy-ciszta folyadék molekuláris elemzésének értékelésére a mucinos ciszták diagnosztizálásában. 113 hasnyálmirigy-cisztában szenvedő beteget foglalt magában, akik műtéti reszekción estek át, vagy diagnosztikus citológiai aspirációjuk volt. A cisztás folyadék DNS-t endoszkópos ultrahang finom tűszívással nyertük és egy kereskedelmi laboratóriumban elemeztük, a Redpath Integrated Pathology (Pittsburgh, PA, USA). A molekuláris elemzés magában foglalta a DNS mennyiségi meghatározását, a KRAS 12 kodon tesztelését és a mikroszatellit markerek széles paneljének allélveszteség elemzését, beleértve a szekvenálást is. A KRAS 12 kodon mutációi mutatták a legmagasabb esélyarányt (20, 9) és specificitást (96%), de alacsony érzékenységet (45%) a mucinos differenciálódás iránt. Összehasonlításképpen, a megnövekedett CEA specifitása és érzékenysége 83, illetve 64% volt. A KRAS mutációs elemzés 64% -ról 82% -ra növelte a CEA assay érzékenységét, miközben a specificitást 83% -ra tartotta.

A PANDA-tanulmányból fakadó problémák megoldása érdekében integráltuk a KRAS-tesztet a hasnyálmirigy-cisztás neoplazmák rutinszerű értékelésének részeként, a nagy mennyiségű hasnyálmirigy-ciszta szolgáltatás részeként. A KRAS ciszta mutációk prevalenciája 38% volt 6 év alatt. A 12. kodonban elhelyezkedő KRAS mutációk mellett mutattunk ki mutációkat a 13. és a 61. kodonban is. Bár a korrelációs szövettani monitorozás csak a betegek 25% -ában volt jelen, összesen 73 IPMN-t és 21 MCN-t reszektáltunk. Ezenkívül ezeknek a mucinos cisztáknak a legtöbbje (67%) alacsony fokú diszpláziát mutatott. A PANDA vizsgálat eredményeihez hasonlóan a KRAS mutációk is magas specificitással (100%), de alacsony érzékenységgel (54%) mutagén ciszták iránt mutattak ki. A CEA analízis specificitása 85%, érzékenysége 62% volt. Kombinációban mindkét teszt 83% -ra növelte az érzékenységet, miközben a magas, 85% -os specifitást megtartotta. A PANDA vizsgálat eredményeinek reprodukálhatósága a KRAS vonatkozásában megerősíti annak hasznosságát a mucinous ciszták azonosításában. A CEA-analízissel együtt a KRAS-teszt javíthatja a hasnyálmirigy-ciszta finom tűszivattyúinak diagnosztikai hozamát.

Érdemes megjegyezni, hogy tanulmányunkban továbbra is elfogultság figyelhető meg a kiválasztásban. Pontosabban, a KRAS-tesztet az endoszkóp belátása szerint végezték el. Ezért a KRAS-elemzésből kihagytuk a pseudocysták ciszta folyadékát azoknál a betegeknél, akiknek kórtörténetében hasi trauma vagy közvetlen IPMN-csatornák vannak képalkotással. Vitatható azonban, hogy ezekben a beállításokban nincs szükség molekuláris segítő tesztelésre. Figyelemre méltó, hogy a korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a cisztafolyadék KRAS mutációk alapján történő osztályozása hamis pozitív eredményekhez vezethet. Panarelli és mtsai. 15 azonosított két KRAS mutációval rendelkező pszeudocisztát ugyanazon kereskedelmi biomarker panel (PathfinderTG) alkalmazásával, mint a PANDA tanulmány. Ezért a KRAS eredményeit multidiszciplináris megközelítés részeként kell értelmezni.

A KRAS szomatikus mutációi mind az IPMN-ben, mind az MCN-ben gyakoriak, a jelentett gyakoriság 30% -tól alacsony fokú elváltozásoknál 80% -ig terjed. 18, 19, 20, 21, 22 A korábbi vizsgálatokkal összhangban a KRAS mutációk prevalenciája az IPMN-ben 67% volt. Ezzel szemben az MCN csak 14% -a tartalmazta a KRAS mutációt. Ezek a megállapítások oka lehet a DNS-kimutatási technikánk érzékenységének hiánya. Az IPMN-n belüli KRAS-mutációkat azonban folyamatosan összehasonlítható sebességgel azonosították, mint sebészeti reszekciós anyagot vagy posztoperatív cisztafolyadékot használó vizsgálatokat. Alternatív megoldásként a finom tűszívással nyert lizált és felszabadult epitheliumból származó DNS mennyisége kisebb lehet, mint a műtéti manipuláció miatt a műtét utáni aspirációban. Vagy a vizsgálati csoportunkban az MCN-eknek csak 14% -a rendelkezik KRAS mutációval. Bármi legyen is az oka, további markerekre van szükség a cisztafolyadék DNS-elemzésének érzékenységének javításához.

Fontos szempont, amelyet ebben a tanulmányban nem foglalkoztak, az a DNS-elemzés képessége, hogy megkülönböztesse a mucin-termelő elváltozásokat alacsony fokú dysplasia (jóindulatú) és a magas fokú dysplasia vagy a kapcsolódó invazív rák (malignitás) esetén. A KRAS mutációk önmagukban nem korrelálnak a mucin termelő neoplazmák magasabb fokával. A PANDA tanulmány arról számolt be, hogy a többszörös allélveszteség-elemzés> 82% vagy a KRAS mutáció és a magas allélveszteség-elemzés kombinációja nagymértékben megjósolta a rosszindulatú daganatot. Ezeket a megállapításokat Shen és munkatársai, 14 megerősítették, és 35 hasnyálmirigy-ciszta folyadékmintát elemeztek a Redpath's PathfinderTG segítségével. A szerzők 89% -os egyetértést találtak a molekuláris és klinikai konszenzusos diagnózisok között, ebből 83% a rosszindulatú, 87% a jóindulatú mucinos és 93% a jóindulatú nem cukor ciszták esetében. Ezzel szemben Panarelli et al. 15 és Toll és mtsai. 16-os 39% -os és 56% -os megfelelési arányt jelentett. A molekuláris és klinikai diagnózisok közötti egyetértés nagy eltérése azzal magyarázható, hogy az utóbbi két tanulmányban nem áll rendelkezésre adat a műtéti nyomon követésről. Ugyanakkor, hasonlóan a KRAS elemzéshez, a hosszabb megfigyelési periódust és a korrelált műtéti követést is magában foglaló jövőbeni vizsgálatokra van szükség.

Összefoglalva, bemutatjuk a KRAS-elemzés legnagyobb sorozatát hasnyálmirigy-ciszta folyadék által nyert finom tűvel végzett endoszkópos ultrahang-aspirációról. Klinikai és radiográfiai eredményekkel kombinálva a KRAS nagyon specifikus volt, de gyenge érzékenységgel rendelkezett a mucinous differenciálódás iránt. A CEA-elemzés hozzáadása javította a KRAS-elemzés érzékenységét, miközben a magas specificitás megmaradt. Mucinos ciszta típus szerint rétegezve a KRAS teszt enyhe érzékenységet mutatott az IPMN iránt, de nem volt elegendő az MCN azonosításához. A hasnyálmirigy-nyálkahártya detektálásának és osztályozásának javításához endoszkópos ultrahang finom tű segítségével a jövőbeli molekuláris vizsgálatok további gének és egyéb folyadékmarkerek bevonására van szükség.