- elemeket
- absztrakt
- bevezetés
- Anyagok és metódusok
- elemeket
- Műtéti beavatkozások
- Kábítószerek és mikroinfúziók
- Viselkedésvizsgálati eljárások
- Kísérleti terv
- Helyellenőrzés
- Statisztikai elemzések
- az eredmény
- Az elemzésekből kihagyott alanyok szövettani ellenőrzése és elszámolása
- Étel- és vízbevitel
- Táplálkozási mikroanalízis
- Muscimol hatások AIC-ben
- Muscimol hatások a vmPFC-ben
- A CNQX és az AP-5 hatása a vmPFC-ben
- Az ivóvíz mikroanalízise
- Mentő és tenyésztés
- vita
- Finanszírozás és nyilvánosságra hozatal
- További információ
- Word dokumentumok
- További információ
- Kiegészítő S1 táblázat
- Kiegészítő táblázat S2
- Kiegészítő táblázat S3
- Kiegészítő táblázat S4
elemeket
- Sejtjelzés
- Etetési magatartás
- sziget
- Prefrontális kéreg
absztrakt
Ebben a vizsgálatban a GABA-A receptor agonisták infúzióit, a helyszínen található muscimolt alkalmazták "ideiglenes elváltozások" létrehozására vmPFC és AIC patkányokban. A lenyelést és a kapcsolódó motoros tevékenységeket ezután két motivációs helyzetben figyelték meg: táplálékhiányos patkányok standard chow-val és ad libitum táplált patkányok ízletes, magas cukortartalmú/magas cukortartalmú, ízletes koktéllal. A fő cél az volt, hogy összehasonlítsuk a muszimol inaktiválásának a táplálkozási viszonyokra és a különböző helyszínekre gyakorolt hatásait annak megállapítására, hogy ezeknek a helyeknek bármelyikének van-e szelektív szerepe az alulbecsült, ízkontrollált étrend expressziójának modulálásában.
Anyagok és metódusok
Valamennyi eljárást a Wisconsin-Madison Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága értékelte és hagyta jóvá, és összhangban vannak a laboratóriumi állatok gondozásáról és felhasználásáról szóló NIH kézikönyv irányelveivel. Az eszközöket az Amerikai Laboratóriumi Állattenyésztési Akkreditáció Egyesülete hagyta jóvá.
elemeket
A Harlan-tól (Indianapolis, IN) nyert hím Sprague-Dawley patkányokat, amelyek a laboratóriumba érkezve 275-290 g tömegűek voltak, minden kísérletben felhasználtunk. A patkányokat párban, átlátszó polikarbonát ketrecekben (9,5 hüvelyk x 17 hüvelyk, 8 hüvelyk hosszúságban), fülpárnákkal helyezték el a fény és a hőmérséklet által szabályozott viváriumban. Az állatokat 12:12 órás világos/sötét ciklusban helyeztük el (a fények 0700 órakor világítottak). Élelmiszer (Agway patkány-chow pellet) és víz ad libitum volt elérhető, kivéve a kísérletek élelmiszer-korlátozó szakaszait, amint azt a kísérleti tervezés szakasz leírja. Az állatokat naponta gondosan kezeltük a stressz csökkentése érdekében.
Műtéti beavatkozások
Kábítószerek és mikroinfúziók
A muszkimolt, a CNQX dinátriumot és az AP-5-et mind a Sigma-Aldrich-től kaptuk. A gyógyszereket 0,9% -os steril sóoldatban oldottuk. A CNQX esetében a sóoldatot a gyógyszerkészítés során kissé melegítették az oldékonyság elősegítése érdekében. Az intracerebrális mikroinfúziókhoz a patkányokat óvatosan tartottuk, az injektorokat vezető kanülökkel engedtük le és 0,32 ml/perc sebességgel infundáltuk. További részletek a kiegészítő anyagokban találhatók.
Viselkedésvizsgálati eljárások
Viselkedési teszteket végeztek átlátszó polikarbonát viselkedési ketrecekben (szélesség 9,5 hüvelyk x hosszúság 17 hüvelyk x magasság 8 hüvelyk) dróthálós padlóval. A kísérleteket két körülmény között hajtották végre: (1) táplálékhiányos állapot, amelyben előre lemért mennyiségű állkapocs pelletet kínáltak egy tesztketrecben 20 órás ételfogyasztás után, vagy (2) ízletes takarmány, amelyben folyékony csokoládét kínáltak tejcsokoládé aroma (a továbbiakban: csokoládé koktél). Ez a koktél maltodextrinből, szacharózból, tej- és szójafehérjékből, kukorica- és repceolajokból, vitaminokból és természetes plusz mesterséges csokoládé ízekből állt (% kcal/adag: zsír, 29; szénhidrátok, 57; fehérjék, 14). A csokoládé koktél a tesztketrec felső mérőbürétéjéből volt kapható. A víz minden vizsgálati körülmény között rendelkezésre állt a felső térfogatú bürettából. A patkányokat kísérleti vak kezeléssel értékeltük PC-hez csatlakoztatott eseményrögzítővel. A következő viselkedéseket figyelték meg:
Ketrec átmenetek: mozgás a ketrec hosszú tengelyének középtengelyén,
Nevelés: a hátsó lábakon tenyészik,
Etetés: folyamatos étkezési pellet vagy csokoládé koktél
Ivás: folyamatos vízellátási támadások.
Az összes ilyen viselkedés kiváltásának gyakoriságát, időtartamát és késési idejét rögzítettük, kivéve a ketrecbe való átmeneteket, amelyeknél csak a gyakoriságot rögzítették. Egy adott viselkedési esemény időtartamának rögzítéséhez egy kapcsolót lenyomtak, amely a viselkedés kezdetén elindított egy automatikus időzítőt (erre a viselkedésre jellemző). Az időzítőt kikapcsolták, amikor a viselkedést más viselkedés megszakította (például egy ivási szünetet folytató patkány abbahagyta a hátrafelé történő ivást, vagy járóbeteg alapon sétált a ketrecben). A gyakoriságra és időtartamra vonatkozó adatok alapján kiszámították az egyes nevelések, etetések vagy ivások teljes átlagos időtartamát.
Kísérleti terv
Két különálló patkánycsoportot alkalmaztunk infúziós kanülökkel, amelyek vagy vmPFC-t (n = 8 patkány), vagy AIC-t (n = 8 patkány) irányítottak. A műtétből való felépülés után minden patkánynak "álinjekciókat" kaptak, amelyekben az injekciós csöveket az infúziós kanülökbe engedték le, de az agyba nem, hogy a patkányokat akklimatizálják a kezeléshez és az infúzióhoz.
A szimulált injekció beadásának napján a patkányokat élelmiszermentes kohorszba vagy csokoládé- és kokszcsapba helyezik. Pontosabban, minden agyi hellyel rendelkező csoport patkányainak felét korlátozott étrendre helyezték, amelyben az ételt egy éjszakán át vették igénybe, 20 órával a következő napi viselkedési munkamenet előtt. Ezeket a patkányokat ad libitum nélkül hagyták enni minden egyes viselkedésmegfigyelési munkamenet után, és az átmeneti nap vagy napok alatt, amelyek elválasztották a munkameneteket, majd az ételt egy éjszakán át ismét eltávolították a következő tesztszakasz előtt. Ezt az etetési ütemtervet a kísérlet során megtartották. Mindegyik agyi csoport másik fele éjszakánként csak egy üveg csokoládé koktélt kapott (a szokásos étel kivételével) otthoni ketrecében. Ezt használták a patkányok új eledelbe helyezéséhez. Mostantól a patkányok csak 30 perces megfigyelés során kaptak csokoládé koktélt (soha nem voltak házi ketrecekben). A kakas patkányait csokoládéval és kokszal nem fosztották meg élelemtől.
A patkányok mikroinfúziós és vizsgálati eljárásokhoz történő további hozzáigazítása érdekében az élelmiszerhiány vagy csokoládé koktél első expozícióját követő napon minden patkánynak sóoldatot injektáltak az agy megfelelő célhelyein, és viselkedésketrecekbe helyezték bármelyik chow pelletet használva. plusz vizes palackok (élelmezéskorlátozott patkányok számára) vagy csokoládé koktélpalackok plusz vizes palackok (ad libitum patkányok számára) 30 percig. Két nappal később megkezdődött a kábítószer-tesztelés.
A kábítószer-tesztelés napjain a patkányoknak muszimolt (0, 30 vagy 75 ng) injektáltak, és azonnal viselkedési ketrecekbe helyezték. A feltétlen motoros és lenyelt viselkedést 30 percig figyeltük és rögzítettük, a Viselkedésvizsgálati eljárásokban leírtak szerint. Ezeken a találkozókon a patkányoknak ételt és vizet, vagy csokoládé koktélt és vizet kínáltak, csoportosulásuktól függően. Minden patkány minden egyes adagot latin négyzetmintáknak megfelelően kapott az egyénen belül. A tesztnapokat legalább egy ideiglenes nap választotta el egymástól.
Az összes kezelés befejezése után a korlátozott élelem- és csokoládécsoportokat fejjel lefelé rázták, a patkányoknak 2 napot adtak, hogy alkalmazkodjanak új táplálkozási rendjükhöz, és a gyógyszer minden adagját másodszor tesztelték az alanyokban. Ezért az összes dózist minden patkányon teszteltük táplálékhiány + chow és ad libitum + csokoládé körülmények között.
Hasonló kísérleti tervet alkalmaztunk az AMPA glutamát receptor antagonista, a CNQX (0,1,5 μg/oldal) és az NMDA glutamát receptor antagonista, az AP-5 (0, 1, 1,0 μg) hatásainak tesztelésére./oldal). Az intra-vmPFC CNQX és AP-5 hatásait különálló patkánycsoportokban (n = 8 csoportonként) teszteltük, a chow és a csokoládé shaker sorrendben a patkányokban a fentiek szerint kiegyensúlyozva. Mindkét gyógyszer dózisa az irodalomban közölt, viselkedésében aktív intracerebrális dózistartományon belül volt (Baldwin és mtsai., 2000; Bishop és mtsai., 2011; Mena és mtsai., 2013; Tan és mtsai, 2014).
Helyellenőrzés
Minden kísérlet végén a patkányokat mélyen altattuk nátrium-pentobarbitállal, és transzkardiálisan perfundáltuk 0,9% sóoldattal, majd 10% formalinnal foszfátpufferben. Az agyakat eltávolítottuk és 10% -os formalinban tároltuk. A koronális metszeteket (60 μm) egy kriosztát mikrotómán átvágtuk az infúzió helyén, tárgylemezeken összegyűjtöttük, krezil-ibolyával festettük, majd ellenőriztük, hogy ellenőrizzük az intrakortikális injekciók helyes helyét. Az egyes kísérletek reprezentatív szakaszainak képeit Scion Image szoftver segítségével készítettük Hitachi HV-C20 CCD mikroszkóphoz csatlakoztatott számítógépen.
Statisztikai elemzések
Az intra-vmPFC és az intra-AIG muszimol vizsgálatokhoz az adatokat háromfaktoros ANOVA-val elemeztük, egy faktort az alanyok között (agyterület) és két faktort az alanyon belül (dózis, ételtípus). Jelentős (P
Az injektor csúcsa helyének ábrázolása a vmPFC (a) és az AIC (b) pontokban, valamint az egyes helyeken belüli elhelyezés fénymikrográfja (c, d). a) A fekete körök a muscimol kísérletből, a szürke körök a CNQX kísérletből, a fehér körök pedig az AP-5 kísérletből származnak. b) A fekete körök a muscimol kísérlet helyeit jelentik. c) vmPFC hely; fmi = corups callosum, elülső csipesz. d) az AIC helye; pir = piriform kéreg, ac = anterior commissure, LV = laterális kamra. A c) és d) paneleken a nyilak mutatják az injektor csúcsait.
Teljes méretű kép
- Töltse le a PowerPoint diát
A muscimol/AIG vizsgálat nyolc alanyának egyikében és az AP5/vmPFC vizsgálatban szereplő nyolc patkány közül kettőben a célzónákon kívüli kétoldalú helyek csökkentek; a CNQX vizsgálatban a nyolc patkány közül kettő megbetegedett és feláldozták. Ezeket a patkányokat kizártuk az elemzésekből.
Étel- és vízbevitel
Amint a 2. ábra mutatja, a muscimol AIC-be történő infúziói különböző hatásokat váltottak ki a bevitelben az intra-vmPFC infúziókhoz képest (agyterület x dózis interakció: F (2, 26) = 3,9, P = 0,022). Az egyes agyrégiók további elemzései azt mutatták, hogy a muscimol AIC-be (de nem a vmPFC-be) történő infúziója jelentősen csökkentette a csokoládé koktélbevitelt (F (2, 12) = 18, 5, P = 0,022, 2d. Ábra), de nem ételt (2b. Ábra) ). ), amelyet post-hoc elemzések megerősítettek, amelyek szignifikáns különbségeket jeleznek a sóoldattal kapcsolatos készítmények között a muszimol két dózisának mindegyikéhez képest, csak a csokoládé koktél esetében. Ezzel szemben a nélkülözés okozta csecsemőbevitelt nem befolyásolta a muscimol infúziója az agy bármely területére (2a. És b. Ábra).
A kokszból és a csokoládéból ("Choc. Shake") származó táplálékbevitel a muscimol infúziója után a hasi középső prefrontális kéregbe ("vmPFC"; az a és c panelek vagy az agranuláris sziget kérge ("AIC"; b és d panelek)). A kétoldali injekciókhoz adott muszimol dózisa ng/oldal. A hibasávok egy SEM-et képviselnek. *** P
A bélbevitel mikroanalízise nem élelmiszer patkányokban és csokoládé koktélbevitel patkányokban, amelyeket szükség szerint tartottak a muscimol infúziója után a ventrális mediális prefrontális kéregbe (vmPFC) vagy az agranuláris szigetek kéregébe (AIC). Itt adjuk meg a 30 perces munkamenetenként kezdeményezett rohamok számát (#) (a és b panelek), a munkamenetenkénti teljes táplálkozási időtartamot (c és d panelek) és a rohamok átlagos időtartamát munkamenetenként (e és f panelek). A kétoldali injekciókhoz adott muszimol dózisa ng/oldal. b) * P + P + P
Az AMPA/kainát-glutamát receptor antagonisták, a CNQX (a, c, e és g panelek) vagy az NMDA-AP-5 glutamát receptor antagonista (b, d, f és panelek) infúziója után szilánkfelvétel, csokoládéfogyasztás, valamint az étel- és csokoládefogyasztás mikroanalízise. h). A mikrostruktúra-mérések tengelyjelei megegyeznek a 3. ábra jelmagyarázatában leírtakkal. A kétoldalú gyógyszerinjekciók adagja μg/oldal. c) * P
Viselkedés a gyaloglás és a tenyésztés során a muszimolnak a ventrális központi prefrontális kéregbe ("vmPFC"; a és c panelek) vagy agranuláris szigeti kéregbe ("AIC"; b és d panelek) történő infúziója után. A kétoldali injekciókhoz adott muszimol dózisa ng/oldal. Az a) és c) paneleken * P