vírusos

  • elemeket
  • mód
  • Mikrobuborék/plazmid oldat és vírus vektorok
  • Az állatok és a nyálmirigyek katéterezése
  • Luc kijelzése in vivo
  • A géntranszfer mennyiségi meghatározása és statisztikai elemzés
  • szövettan
  • Szerzői
  • MJ Passineau keresése itt:
  • L Zourelias keresése itt:
  • L Machen keresése itt:
  • Keresés a PC Edwards webhelyen:
  • RL Benza keresése itt:

elemeket

  • Génszállítás
  • ultrahang
  • Az eredeti cikk 2010. május 27-én jelent meg

Javítás: Génterápia (2010) 17., 1318 - 1324; doi: 10, 1038/gt, 2010, 86

A cikk megjelenése óta a szerzők azt tapasztalták, hogy a módszerek részben több esetben is megjelent mikrogramm milligrammban. A módszer helyes részét az alábbiakban adjuk meg.

mód

Mikrobuborék/plazmid oldat és vírus vektorok

A végleges mikrobuborékokat 2 ml-es injektálható szuszpenzióként vásároltuk, és Vialmix készülékkel aktiváltuk a gyártó utasításai szerint (Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA, USA). A mikrobuborékokat aktiválásuktól számított 30 percen belül alkalmaztuk a kísérletekhez. Összesen 50 μg pCMV-GL3-at (a GL3 Luc-t expresszáló plazmidot, amelyet úgy állítottunk elő, hogy a citomegalovírus (CMV) promótert beépítettük a pGL3-bázisú többszörös klónozóhelybe; Promega, Madison, WI, USA) összekevertük 50 μg-val. mikrobuborékos oldat, akár 100, akár 15 térfogatszázalékos oldat foszfáttal pufferolt sóoldattal.

Az Ad által közvetített génátvitelhez a Stratagene AdEasy rendszeren alapuló, nem replikálódó Ad Serotype 5 vektort hoztak létre a GL3 szekvencia (a Promega pGL3 Basic vektorból) klónozásával a pShuttle-CMV vektor (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA). A transzfervektort rekombináltuk az AdEase gerinccsontjába, és az így kapott Ad-CMVGL3 vektort amplifikáltuk és 3,5-1012 vp ml-1 titerig tisztítottuk. Az ad vektorokat 50 μg foszfáttal pufferolt sóoldatban szállítottuk.

Az állatok és a nyálmirigyek katéterezése

A C57BL/6 egereket a Jackson Labs-tól (Bar Harbor, ME, USA) szereztük be, és kórokozóktól mentes körülmények között tartottuk az Allegheny-Singer Kutatóintézet viváriumában, a szokásos táplálékhoz és vízhez ad libitum hozzáféréssel. Az állatkísérleteket és protokollokat az Allegheny-Singer Kutatóintézet az állatok gondozásával és felhasználásával foglalkozó intézményi bizottság felülvizsgálta és jóváhagyta. A géntranszfer a nyálmirigyekbe úgy történik, ahogy azt Voutetakis és munkatársai már leírták. 4 Röviden: az állatot altattuk és sztereotaktikus keretbe helyeztük, hogy a száj nyitva maradjon. A tollat ​​behúzták, és egy vékony műanyag katétert helyeztek a submandibularis csatorna nyílásába az egyik oldalon,

1 cm, és ragasztóval tartjuk a helyükön. Összesen 50 μg génátviteli vektort hordozó hordozóoldatot (vírus vagy plazmid/mikrobuborékok) egy katéterrel infundálunk a csatornába az egyik oldalon, és a dugattyút 10 percig a helyén hagyjuk, hogy a vektor érintkezésbe kerüljön nyálhámok. sejtek. Ezután a katétert eltávolították, és az állat visszatért a ketrecébe, hogy normálisan felébredjen.

Ultrahang génátviteli kísérletek során a nyálmirigyet közvetlenül borító bőrt szőrtelenítőszerrel kezelték, kereskedelmi ultrahangos gélt használtak, és egy ultrahangos sugárzó (SoniGene, VisualSoincs Inc., Toronto, Ontario, Kanada) közvetlen kapcsolatban állt a az átfedés bőre. A mikrobuborékok plazmidoldatának infúziója után 4x30 s impulzusokat adunk a következő paraméterekkel: 1 MHz, 50% -os munkaciklus és 2 W cm-2, az impulzusok között 10 s. Négy impulzus után a besugárzót kivontuk, és az állatot 10 percig hagytuk pihenni, mielőtt eltávolítottuk a katétert.

Luc képalkotás in vivo

Az egereknek intramuszkulárisan 1 ml testtömeg-tömeg% ketamint (20 g ml-1)/xilazint (100 mg ml-1) adunk 3: 2 arányban elkeverve. Anesztézia után az egeret intraperitoneálisan D-luciferinnel injektáltuk. szubsztrát (XenoLight D-kálium-luciferin, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA) dózisban (100 μl/10 g testtömeg, 15 mg ml-1 törzs). Az egereket ezután fényzáró kamrába helyeztük, és képeket készítettünk 1 percig tartó expozícióhoz kriogénen hűtött IVIS Lumina II kötő töltőkamerával (Caliper Life Sciences), hogy meghatározzuk az állat spontán kibocsátott fotonjait. A képeket a Xenogen szoftver (Caliper Life Sciences) alkalmazásával álszínesen színezték, és átfedték az állat fekete-fehér fényképén, amelyet a kabinet világítása generált. A vizuális kimenet az s/cm 2 -ben kibocsátott fotonok számát ábrázolja álszínes képként, amelyben a maximum piros, a minimum pedig lila.

A géntranszfer mennyiségi meghatározása és statisztikai elemzés

Az in vivo képalkotásból nyert képeket a Living Image szoftver (Caliper Life Sciences) segítségével elemeztük. A nyálmirigyből kibocsátott fotonokat úgy határoztuk meg, hogy meghatároztuk a nyálmirigy anatómiai helyzete fölött lévő NI értékét. A legtöbb esetben ezt a befektetési megtérülést automatikusan az "Automatikus kontúrmegtérülés" szoftverrel hozták létre, és a teljes áramlást (foton/s) a beruházás megtérülési területén mérték. Azokban az esetekben, amikor a szoftver nem tudott automatikusan megtérülni a beruházásból, vagy ha nem volt felismerhető jel, kb. 0,75 cm átmérőjű kört helyeztek a nyálmirigy anatómiai helyzete fölé, és megmérték a teljes áramlást. Folyamatosan tapasztaltuk, hogy a 3 × 104 háttérérték volt a háttérérték ebben a rendszerben. Az értékeket azonban a táblázatokban teljes folyamatként jelentették, háttérkorrekció nélkül.

szövettan

A két akut génbeviteli módszer által okozott szialoadenitisz lehetséges eltéréseinek vizsgálatához egy géntranszfert hajtottunk végre egy második állatcsoporton, a fent leírtakkal megegyező módszerekkel, azzal a különbséggel, hogy ebben a kohorszban az állatok fele nőstény volt, a nemek egyenletesen helyezkedtek el . felosztás hirdetéscsoportok és UAGT csoportok között. Az állatokat 7 nap múlva leöltük és a nyálmirigyeket eltávolítottuk, rögzítettük, paraffinba ágyazottuk, mikrotómákra vágtuk és hematoxilinnal és eozinnal festettük. Egy elvakult orális patológus (PCE) Isacsson és mtsai módosítása alapján megvizsgálta a tárgylemezeket, és 1 (normál) és 4 (súlyos, az acináris sejtek teljes elpusztításával) skálán osztályozta a szialoadenitis mértékét. 24.

A plazmid/mikrobuborék vektorok térbeli eloszlásának és az ebből eredő transzgén expresszió vizsgálatához pCMV-GFP-t, egy GFP-t expresszáló plazmidot kaptunk a fent leírtakkal azonos módon, 15% mikrobuborék hordozó oldat felhasználásával. Közvetlenül a plazmid/mikrobuborék keverék infúziója előtt, majd a nyálmirigyek ultrahangképét készítettük egy VisualSonics Vevo 770-en (VisualSonics Inc., Toronto, Ontario, Kanada), B módban 40 ° C-on futó RMV-704 szkenner fejjel. MHz. 7 nap múlva az állatokat feláldoztuk, a nyálmirigyeket eltávolítottuk, rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. A metszeteket fluoreszcein izotiocianáttal konjugált anti-GFP poliklonális antitesttel teszteltük (Abcam, Cambridge, MA, USA).

A szerzők elnézést kérnek ezért a hibáért.