elemeket

absztrakt

A fő

A kondrogén progenitor sejtek (CPC), például a porc mag sejtjei fontosak a porc homeosztázisának fenntartásában. 1, 2 CPC-t azonosítottak először a borjú porcában, mint olyan felületi zónás sejtek szubpopulációját, amelyekről kiderült, hogy szükségesek az ízületi porcok appozicionális növekedéséhez. 3 Koelling és mtsai. Az 1. ábra a CPC-t is megtalálta az ízületi porcokban az emberi osteoarthritis (OA) későbbi szakaszaiban. Ezek az őssejtek a sérülés helyi helyeire vándorolnak, ahol a sérült szövet pótlásához szükség szerint szaporodnak és differenciálódnak. 2 A mezenchimális ősprogenitor sejtek jelentősen tágulnak, és specifikus in vitro tenyésztési körülmények között több vonallá differenciálódhatnak, beleértve a csont-, porc-, ín-, izom- és idegsejteket. Az idősödő emlősök csontvázizomszövet fenntartásának csökkent képességének lehetséges mögöttes okaként az izom őssejt funkciójának csökkenését javasolták. 4 Ugyanezt a hatást figyelték meg a porcszövetben is. A CPC funkció gátlása tehát kockázati tényező lehet az OA szempontjából.

Megállapítottuk, hogy a szinoviális folyadékban található OA gyulladásos mediátorai a normál ízületi porc degenerációját indukálták, amikor a beagle kutyák ép ízületi üregébe injektálták őket. Ezen gyulladásos citokinek közül a leptin különösen érdekes, mert befolyásolja a testtömeg homeosztázisát, valamint jelentős és pozitív összefüggést mutat a leptin és a porc degeneráció között. A fehér zsírszövet által termelt leptin egy kicsi (16 kDa), nem glikozilezett fehérje, amelyet az Ob gén kódol. A leptint és receptorát izolálták emberi kondrocitákból, oszteofitákból, fiakból és zsírinfúziós párnákból. 9, 10

Stannus OP és mtsai. szolgáltatott bizonyíték arra vonatkozóan, hogy a szérum leptin szintje függetlenül és következetesen összefügg a csökkent porcvastagsággal, mind keresztmetszeti, mind hosszanti irányban, ami arra utal, hogy a leptin fontos szerepet játszik az OA etiológiájában és fejlődésében. 8 Simopoulou és mtsai. A 11 azt is megállapította, hogy a leptin és a leptin receptor (Ob-Rb) expressziója szignifikánsan magasabb volt az előrehaladott OA-s betegek porcában, mint az enyhe OA-s betegek porcában. Ezenkívül az ízületi porc proteoglikánjai kimerültek, amikor patkányok térdízületeibe injektálták a leptint. Korábbi vizsgálatok megvizsgálták a leptin hatását a kondrociták biológiai funkcióira. A leptin által kiváltott porc degenerációt közvetítő mechanizmusok azonban nincsenek pontosan meghatározva. A leptin CPC biológiai funkcióira gyakorolt ​​hatásainak vizsgálata növelné annak megértését, hogy a leptin milyen szerepet játszik a porc lebontásában.

Itt izoláltuk és azonosítottuk a CPC-t a patkány térdének porcából. A leptin megváltoztatta a CPC-differenciálódást a chondrogenesis gátlásával és az osteogenezis fokozásával. A leptin a p53/p21 útvonal aktiválásával és a Sirt1 útvonal gátlásával a CPC-ben is öregedést váltott ki. A leptin út aktiválása (magasabb Ob-Rb szint) szignifikánsan korrelált az OA porc degenerációjával (alacsonyabb Coll-2 szint) és a szövetek öregedésével (magasabb p53/p21 szint és alacsonyabb Sirt1 szint). Eredményeink együttesen új összefüggéseket tárnak fel az elhízás és a porc károsodása között, amelyeket a leptin által közvetített hatások okoznak a sejtek viselkedésére, az öregedésre és az intracelluláris jelátvitelre.

az eredmény

A porcból izolált CPC-k azonosítása

leptin

Teljes méretű kép

Nagy mennyiségű leptin csökkenti a migrációs képességeket, gátolja a kondrogén potenciált és növeli a CPC oszteogén potenciálját.

Teljes méretű kép

A leptin növeli a p53, az acetilezett p53, a p21 és a Sirt1 szintjét a CPC öregedése során

Két fő út vezet a sejtek öregedésének indukciójához: a p38 mitogén-aktivált protein kináz (MAPK)/p16 INK4a útvonalak és a p53/p21 cip útvonalak. A foszforilált p38 MAPK szintje a CPC-ben kissé magasabb volt fiziológiás és nagy dózisú leptin jelenlétében növesztett sejtekben, mint a kontroll sejtekben. A p53, az acetilezett p53 és a p21 szintje azonban szignifikánsan magasabb volt a magas leptin dózisokkal kezelt sejtekben, mint a kontroll csoportban. A Sirt1 pirt-deacetiláz alacsonyabb szintje gyakran társul a p53 által közvetített öregedéssel. A Sirt1 expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt a nagy leptin dózisokkal kezelt sejtekben, mint a kontroll sejtekben, és az acetilezett p53 szintje is magasabb volt ezekben a sejtekben. A leptin a p53/p21 útvonal aktiválásával és a Sirt1 gátlásával indukálja a CPC öregedését.

A leptin a p53/p21 út aktiválásával indukálja az öregedést a CPC-ben

Útgátlási vizsgálatok sorozatát végeztük el, hogy tovább vizsgáljuk a p53/p21 út szerepét a CPC öregedésben. A CPC-ket nagy dózisú leptinnel és vagy a p38 inhibitor SB203580, vagy a p53 inhibitor PFT-a-val kezeltük, és gátlásuk hatásait elemeztük (4a. Ábra). A sejtek öregedését az SA-β-Gal-pozitív sejtek százalékos arányának meghatározásával értékeltük. Az SB203580 p38 inhibitornak nem volt nyilvánvaló hatása az SA-P-Gal-pozitív sejtek százalékos arányára, de a p53-PFT-α inhibitorral kezelt sejteknél szignifikánsan alacsonyabb az SA-P-Gal-festett sejtek százalékos aránya (4b. Ábra) . és c). A p53 és a P-p38 inhibitorok sem tudták növelni az öregedő sejtek százalékos arányát. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a leptin a p53/p21 út aktiválásával indukálja az öregedést a CPC-ben.

A p53/p21 út blokkolása gátolja az öregedést a leptinnel kezelt CPC-kben. ( a ) A p38 inhibitor SB203580 (10 μM) jelentősen csökkentette a P-p38 expresszióját. A p53-PFT-α inhibitor (20 μM) jelentősen csökkentette a p21 expresszióját. ( b a c ) Az SA-β-Gal-pozitív sejtek százalékos aránya jelentősen csökkent, miután a sejteket PFT-α-val és 100 ng/ml leptinnel kezelték, de nem azt követően, hogy a sejteket 48 órán át SB203580-mal és 100 ng/ml leptinnel kezelték. az átlag ± SD skála, 100 μm. * P # P> 0,05 azt jelenti, hogy az eredmények statisztikailag nem voltak szignifikánsak

Teljes méretű kép

A CPC öregedésének indukálása leptinnel a Sirt1 21/p53 útvonal gátlásával

Annak megerősítésére, hogy a Sirt1 útvonal részt vesz a CPC által indukált leptin által kiváltott öregedésben, megvizsgáltuk a Sirt1 aktiváció és blokád hatását. Megállapítottuk, hogy amikor a sejteket nagy dózisú leptinnel (100 ng/ml) és resveratrollal (30 μM) kezelték, a Sirt1 aktivátorát, az acetil p53 expressziója alacsonyabb volt, mint a kontroll sejtekben, és hogy az SA-β-Gal -pozitív sejtek 25% -ra csökkentek (5b. és c. ábra). Ez az eredmény azt jelzi, hogy a Sirt1 aktiválása megakadályozza a leptin által kiváltott öregedést a CPC-ben, és hogy a leptin az öregedést indukálja a Sirt1 útvonal gátlásával. Annak eldöntésére, hogy a leptin által kiváltott Sirt1 gátlás elősegíti-e a porcszövetekben az öregedést, három hónapos Sirt1 KO egerek (Sirt1 -/-) térdéből készítettünk ízületi porcszövetet (egy hónappal a leütés után), hogy megvizsgáljuk a Sirt1 hatását. KO a p53 és p21 expresszióján. A Sirt1 -/- egereknél szignifikánsan magasabb volt a p53/p21 szintje, mint a porcszöveti szakaszokban természetesen előforduló almaikban (5e. És f. Ábra). Ezek az eredmények megerősítik, hogy a leptin a Sirt1 útvonal gátlásával és a p53/p21 út aktiválásával indukálja az öregedést a CPC-ben, ami ronthatja a porcszövet homeosztázisának fenntartását és porc öregedéshez vezethet.

A Sirt1 aktiválása és blokkolása befolyásolta a CPC öregedését a leptin által kiváltott p53/p21 útvonalon keresztül. ( a a b ) A sejteket resveratrollal és leptinnel kezeltük, és elemeztük az SA-β-Gal-pozitív sejtek százalékos arányát. A tenyésztett CPC-ket resveratrollal (30 μM), Sirt1 útvonal-agonistával és 100 ng/ml leptinnel kezeltük. ( c ) 48 órás kezelés után a Western blot elemzés azt mutatta, hogy az acetilezett p53 expressziója gátolt. ( d ) A Sirt1 genomi lokusz PCR-elemzése heterozigóta, floxolt egerekben tamoxifennel és anélkül. ( e a f ) A vad típusú és a KO egerek p53 és p21 pozitív sejtjeinek összehasonlítása. A fluoreszcens mikroszkópos képek azt mutatják, hogy a p53/p21 útvonal jobban aktiválódott a Sirt1 KO egerek ízületi porcszövetében, mint vad típusú egerekben. Méret, 100 μm. A hibasávok az átlag ± SD * P értéket jelzik

Egy specifikus markert (CD146) használtunk a CPC, 14, 21 jelölésére, és megállapítottuk, hogy az őssejtek elsősorban a felszíni rétegben oszlottak el (1c. Ábra). Ez az eredmény összhangban van a korábbi vizsgálatok eredményeivel. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CPC-k jelen lehetnek az ízületi porcmátrixban, hacsak bizonyos állapotok, például trauma és gyulladás nem aktiválják őket, amelyek megkövetelik a sérült porcszövetek helyreállítását. 5.

Ezenkívül vizsgálataink kimutatták, hogy a leptin nagy dózisa gátolja a proliferációt (3a. És b. Ábra), és a CPC-ben sejtciklus leállást indukál. A sejtciklus leállítása általában pihenéshez vagy öregedéshez vezet. 19 A nyugalom egy reverzibilis folyamat, amely a sejt nyugalmi állapotának átmeneti állapotához vezet. Ezzel szemben az öregedés visszafordíthatatlan változáshoz vezet a normális sejttevékenységben. A sejtek öregedését először régi sejtekben figyelték meg, de előfordulhat fiatal sejtekben is. A szenzens sejtek tovább nőnek, és nagyobbnak tűnnek, mint nem öregedő társaik. Az öregedéssel járó hipertrófia a lizoszómák számának és aktivitásának növekedéséhez vezet, ezt a funkciót használják az egyik legszélesebb körben használt módszerrel az öregedés azonosítására, az SA-P-Gal-ot, amely a lizoszomális β-galaktozidáz aktivitáson alapszik. 15, 28

Megfigyeltük az SA-β-Gal-pozitív CPC-k százalékos növekedését, amikor a sejteket in vitro nagy dózisú leptin jelenlétében növesztették (3c. És d. Ábra). Ezek az adatok azt jelzik, hogy a leptin öregedést vált ki a CPC-ben. Két fő út vezet a sejtek öregedésének indukciójához: a p38 mitogén-aktivált protein kináz (MAPK)/p16 INK4a útvonalak és a p53/p21 cip útvonalak. Megmutattuk, hogy a p53, az acetilezett p53 és a p21 szintje szignifikánsan magasabb volt a leptinnel kezelt CPC-kben, mint a kontroll CPC-kben (3e. És f. Ábra). A p53 aktiválása az apoptózis elősegítéséhez vagy az öregedés előidézéséhez vezethet. A Cip p21 egy sejtciklus-vezérlő, amely kritikus jelentőségű a p53-aktiváció kimenetelének meghatározásában, mert sejtciklus-leállást indukál, gátolja a proapoptotikus p53-aktivitást, és a p53-aktivitást csatornázza az öregedés kiváltására. A p53/p21 útvonal blokkolása után az SA-β-Gal-pozitív sejtek százalékos aránya szignifikánsan alacsonyabb volt a leptin + PFT-α-val kezelt CPC-kben. Ezzel szemben nem volt látható változás az SA-P-Gal-pozitív sejtek százalékában a leptin + P-p38 inhibitorral kezelt sejtekben, bár ezekben a sejtekben a P-p38 szint alacsonyabb volt, mint a csak leptinnel kezelt CPC-kben. (4b. És c. Ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a leptin aktiválja a p53/p21 utat a CPC öregedésének kiváltására.

A Sirt1 gyakran társul a p53 által közvetített öregedéssel, mert csökkenti a p53 dezacetiláz szintjét és stabilizálja a p53, 30 értéket, amelynek káros hatásai csökkentik a p53 működését. A Sirt1 aktiválása resveratrol alkalmazásával azt mutatta, hogy a Sirt1 jelátvitel részt vesz a leptin által kiváltott öregedésben a CPC-ben (5b. És c. Ábra). Megállapítottuk azt is, hogy a Sirt1 KO egerekből származtatott ízületi porcszeletek 3 hónapos korig magasabb p53 és p21 szinteket mutattak, mint a WT egerekből kapott összehasonlítható szakaszokban kifejezve (5e. És f. Ábra). Úgy tűnik, hogy a Sirt1 útvonal gátlása és a p53/p21 útvonal aktiválása szinergikusan hat az öregedésre a CPC-ben, amely magában foglalja a porc degenerációját és az OA-t.

Az öregedés kiváltása következtében bekövetkező normális funkcióvesztés az életkorral összefüggő betegségekben és a szövetek degenerációjában játszik szerepet. 31, 32, 33 Ugyanazon OA térdízületből gyűjtött porcszövetek összehasonlításával, amelyek különböző degenerációs szinteket mutattak, azt találtuk, hogy a leptin szint homogén és a leptin hatása változó. Súlyosabb degenerációt figyeltünk meg a porcszövetekben (alacsony Coll-2 expresszió), magasabb Ob-Rb expresszióval (amely aktiválja a leptin útvonalát), magasabb p53/p21 expresszióval (ami szöveti öregedést vált ki) és alacsonyabb Sirt1 expresszióval ugyanabban a térdízületben ( 6a ab) ábra. Adataink alátámasztják az Ob-Rb és a Coll-2, a p53/p21 út és a Sirt1 út közötti kapcsolat fennállását (6d-f. Ábrák), valamint azt az elképzelést, hogy a leptin által kiváltott öregedés a CPC-ben p53 aktivációval indukálódik. a p21 útvonal és a Sirt1 útvonal gátlása. Megmutatjuk azt is, hogy ezek a folyamatok jobban függhetnek az OA-betegek Ob-Rb funkciójától, és fontos hozzájárulhatnak az OA-hoz. Ezek az eredmények azt is megmagyarázzák, hogy miért figyelhető meg nagyobb hígítás a mediális tibialis porcban a porc degenerációja során 8, ami az Ob-Rb expresszió növekedésével jár (6a. Ábra).

A BMI vagy a testzsír százalék relatív növekedést mutat néhány korban növekvő embernél, és úgy tűnik, hogy a leptin szint is növekszik az életkor előrehaladtával. Eredményeink azt mutatják, hogy az emelkedett leptinszint káros hatással lehet a CPC működésére és felgyorsíthatja a porc degenerációját. A súlykontroll fontos eszköz lehet az OA megelőzésében. Ugyanakkor további vizsgálatokra lesz szükség ahhoz, hogy a CPC és a porc degenerációjában a leptin által kiváltott öregedés megszakadhat-e, és hogy a súlyos porc-degeneráció során megfigyelt Ob-Rb expresszió magasabb szintjét indukálták-e biomechanikai erők.

következtetések

Röviden, a leptin megváltoztatja a differenciált CPC-k sorsát azáltal, hogy gátolja a kondrogenesist és fokozza az osteogenezist. A leptin a p53/p21 útvonal aktiválásával és a Sirt1 útvonal gátlásával indukálja az öregedést a CPC-ben. A leptin út aktiválása (magasabb Ob-Rb expresszió) szignifikánsan korrelál a porc degenerációval (alacsonyabb Coll-2 szint) és a szövet öregedésével (magasabb p53/p21 szint és alacsonyabb Sirt1 szint) OA-ban szenvedő betegeknél, ami arra utal, hogy a leptin által kiváltott CPC értékek öregedése hozzájárul az OA kialakulásához. Eredményeink összességében új összefüggéseket javasolnak az elhízás és a porc károsodása között, amelyek magukban foglalják a leptin által közvetített hatásokat a CPC differenciálódására és öregedésére.