elemeket
absztrakt
Az elhízott alanyok az emelkedett keringő 1-es inzulin koncentrációkon túl magas, éhomi glükagonszinttel rendelkeznek, 1, 2. Bár nagy figyelmet fordítottak az emelkedett inzulinszintre, amely felgyorsítja a 2-es típusú diabetes mellitus (T2DM) 3 kialakulását, a magas éhomi glükagonszint egyre növekvő figyelmet kapott, amely ugyanolyan fontos a betegség T2DM 4-ig történő előrehaladásában. Normális körülmények között a glükózszint növekedése ellentétes hatással van az inzulin és a glükagon béta- és alfa-sejtekből történő kiválasztására, ami paradoxon a T2DM-ben szenvedő betegeknél, amikor a glükózszint növekedése mindkét hormont stimulálja 5. A megemelkedett glukagonszint kiváltja a máj glükóztermelését, ami nagyobb inzulinigényhez vezet, ami felgyorsíthatja a béta-sejt stresszt és hozzájárulhat a betegség kialakulásához.
Az éhomi glükagon és az inzulin szekrécióját tovább szabályozhatnánk parakrin hatásokkal, pl. Az inzulin gátló hatása a 20, 21, 22 alfa-sejtekre és a szomatosztatin mind az alfa-, mind a béta-sejtekre 23, 24. Ezen megfigyelések alapján a szomatosztatin-szekréció csökkenése hozzájárulhat a glükagon és az inzulin szekréciójának növekedéséhez. Az, hogy a szomatosztatin felszabadulásának ilyen mértékű csökkenése mennyiben figyelhető meg éhomi körülmények között, amikor a glükagon és az inzulin szekréciójának növekedése nem ismert.
Tekintettel az elhízott gyermekek helyzetére, akiknél az inzulin és a glükagon 1 növekedése egyidejűleg megemelkedik az FFA-szint normál éhomi glükózszint mellett 25, célunk az volt, hogy megvizsgáljuk, hogy a krónikusan megemelkedett FFA-szintek milyen hatással voltak az éheztetett izolált emberi szigetek glükagon-, inzulin- és szomatosztatin-szekréciójára állapot. glükózkoncentráció, különös tekintettel az FFAR1 szerepére.
az eredmény
A palmitát fokozza a bazális szigeti glükagon és az inzulin szekrécióját az FFAR1 révén
A palmitát hatása a felhalmozódott glükagonra (A panel) és az inzulin szekréciójára (B panel) 0,25-7 napig 5,6 mM glükóz mellett tenyésztett izolált humán szigeteken, palmitát hiányában (fehér szimbólumok) vagy jelenlétében (fekete szimbólumok) FFAR1-del és anélkül. egy ANT203 antagonista. A glükagon (C panel) és az inzulin (D panel) sejttartalmát a tenyésztés végén az ANT203 és ANT825 FFAR1 antagonistákkal és anélkül is palmitáttal kezelt szigeteken a hormon tartalom% -ában adtuk meg a kontroll kezelésben részesülő szigeteken. FFAR1 mRNS (E panel) és fehérje (F panel) szintek palmitáttal kezelt szigeteken és FFAR1 antagonista ANT203 nélkül. A transzkriptum és a fehérje szintjét a kontroll% -ot kapott szigetek szintjeinek% -ában fejezzük ki. Az eredmények a donor kísérletekből származó n = 3-5 kísérlet átlag ± SEM értékét mutatják. * P # p
Az FFAR1 expresszió csökkentésének hatása az 5,6 mM glükóz mellett tenyésztett humán szigetekről felhalmozódott hormonszekrécióra 1 napig (fehér sávok) vagy 0,5 mM palmitát (fekete sávok) hiányában. Az FFAR1 mRNS (A panel) és az összes FFAR1 fehérje (B panel) relatív szintjei a tenyésztés végén a nem emlős cél shRNS-hez (neg) vagy shfar-célzott shRNS-kezeléshez (Ffar1) képest. A glükagon (C panel), az inzulin (D panel) és a szomatosztatin (E panel) felhalmozódott váladékát mutatjuk be. Az eredmények átlag ± SEM-t mutatnak, és n = 3-5 donor kísérletből származnak. * P # p
Az FFAR1 és a zsírsavak béta-oxidációjának hatása a bazális glükagonra (A, G panelek), az inzulinra (B, H panelek) és a szomatosztatin szekréciójára (C, I panelek) és tartalmára (DF, F panelek). Az emberi szigeteket 1 napig tenyésztettük FFAR1 agonistákkal vagy anélkül; TAK-875, GW9508, TUG-499 összehasonlítva a palmitáttal (fekete sávok) (A - C panel) és a palmitáttal ANT825-tel és/vagy anélkül és/vagy etomoxirral (G-I panel). Az eredmények azt mutatják, hogy az átlag ± SEM, és n = 5 donor kísérletből származnak. # P 16, 26. Amikor e tanulmány eredményeink azt mutatták, hogy a palmitát által az FFAR1-en keresztül befolyásolt szigeti hormon szekréció az alap glükózkoncentrációnál, feltételeztük, hogy a zsírsav éhomi glükózkoncentráció esetén is befolyásolhatja a légzést. Valójában a mitokondriális légzést csökkentette vagy az ANT203 akut hozzáadása az 5,6 mM glükóznak és palmitátnak kitett szigetekhez (4A, B ábra), vagy egy szigeti struktúrájú ANT825 antagonista felvétele a szigetek tenyésztése során 5,6 mM glükóz jelenlétében. palmitát (4C. ábra, D). Az ANT825 mitokondriális légzés csökkenése palmitát jelenlétében nagyrészt az ATP-vel összefüggő légzés csökkenésének tudható be (4E. Ábra).
Az FFAR1 és a zsírsavak béta-oxidációjának szerepe a palmitát hatásában az EndoC-pH1 inzulin szekréciójára és légzésére. A sejteket 5,6 mM glükóznak tettük ki palmitát hiányában (fehér szimbólumok) vagy jelenlétében (fekete szimbólumok) ANT825-tel és/vagy etomoxirral, trimetazidinnel és anélkül. Inzulin szekréció (A panel). Reprezentatív kinetikus OCR rekordok azokból a sejtekből, amelyek akutan vannak kitéve palmitátnak ANT825-tel és/vagy etomoxirral (B panel). Mitokondriális OCR (C panel), ATP-hez kötött OCR (D panel) és protonszivárgás OCR (E panel). Az eredmények átlag ± SEM (A, CE panelek) (n = 5) és átlag ± SD (B panel) (N = 6) eredményeket mutatnak. * P # P & P 1, 2. Ebben a tanulmányban bizonyítékokat szolgáltatunk arra vonatkozóan, hogy az ilyen kettős szigetecske hormonális fokozódása a keringő FFA-koncentrációk emelkedésének eredménye lehet, ami jellemző erre a betegcsoportra 25. Az éhomi glükagon- és inzulinszint tehát az FFAR1 aktiváció és a szigetecske-anyagcsere kombinációjának köszönhető, és nem csak az inzulinrezisztencia kompenzálására. Ennek az ördögi körnek a megállításához kulcsfontosságú megérteni azokat a mechanizmusokat, amelyek révén az FFA-k a szigeti hormonok fokozott bazális szekrécióját okozzák.
Ennek a vizsgálatnak az eredményei in vitro kísérletekből származnak, és nem vihetők át közvetlenül in vivo környezetbe olyan bonyolultsággal, mint például az inkretinek, az idegsejtek aktivitása és az inzulin és a glükagon szekrécióját moduláló különféle FFA-k. Az eredmények azonban azt a mechanizmust mutatják be, amely révén a megnövekedett keringő FFA és trigliceridek a bazális glükagon szekréció tónusának és az éhomi inzulin szekréciójának egyidejű növekedéséhez vezethetnek, ami krónikus helyzetben ronthatja a glükóz szabályozását.
Összefoglalva, arra a következtetésre jutunk, hogy az FFA-k nemcsak az inzulin, hanem a glükagon és a szomatosztatin szekréciójának szabályozói az éhomi glükózkoncentrációknál az emberi szigetekről, és hogy az FFAR1 kulcsfontosságú ebben a tekintetben. Vagyis az FFAR1 hatása a hormon szekréciójára nem korlátozódik az amplifikációra magas glükózkoncentrációnál, amint azt korábban tárgyaltuk, sokkal inkább az üzemanyag szubsztrátjától függ. Ezért azt javasoljuk, hogy az endogén FFAR1 ligandumok fokozhatják az inzulin és a glükagon felszabadulását éhgyomri glükózkoncentrációkon keresztül a receptorok és az üzemanyag-metabolitok aktivátoraként való kettős szerepük révén.
Anyagok és metódusok
Emberi hasnyálmirigy-szigetek
Az emberi szigeteket agyholt, egyébként egészséges, metabolikus betegségekkel nem rendelkező egyénekből nyerték az Uppsala University Islet Transplantation Unit és a Prodo Lab Inc. (Irvine, Kalifornia, USA). Az etikailag jóváhagyott felhasználást, valamint az egyénekből izolált szigetek kezelésére vonatkozó eljárásokat és protokollokat a svédországi Uppsalában működő Regionális Etikai Felülvizsgálati Testület (EPN 2010/006; 2010-02-10) szerezte meg. A szigetekkel kapcsolatos összes eljárást a fenti jóváhagyással, valamint a vonatkozó helyi irányelvekkel és rendeletekkel összhangban hajtották végre. Valamennyi adományozó írásos beleegyezését az egyes adományozók vagy családtagjaik adták és dokumentálták. A szigetek adományozásához szükséges írásbeli hozzájárulás megszerzése és dokumentálása a svédországi Uppsalában működő Regionális Etikai Felülvizsgálati Testület fent említett jóváhagyásával, valamint a vonatkozó helyi előírásokkal és irányelvekkel összhangban történt. Összesen 19 nem diabéteszes donor szigeteit használták fel. A szigeteket CMRL 1066 táptalajban tenyésztettük, amely 5,6 mM glükózt tartalmazott, és kiegészítettük 10% FBS-szel (Invitrogen, Paisley, Egyesült Királyság), a továbbiakban kontroll körülmények között. A kísérleteket az izolálás után 3-7 nappal kezdtük meg.
EndoC-pH1 sejtek
EndoC-pH1 27 sejtet 1% extracelluláris mátrix gélen és 2 μg/ml fibronektinnel bevont tenyésztőedényeken növesztettünk 5,6 mM glükózt, 2% zsírsavmentes szarvasmarha szérumalbumin (BSA) frakciót tartalmazó DMEM-ben (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország).). ), 10 mM nikotinamid, 50 μM 2-merkaptoetanol, 5,5 μg/ml transzferrin, 6,7 ng/ml nátrium-szelenit, 100 E/ml penicillin és 100 μg/ml sztreptomicin. Eltérő rendelkezés hiányában az összes vegyszert Sigma Aldrich-től szerezték be.
Szigetek és EndoC-pH1 sejtek kezelése hosszú láncú zsírsav-palmitáttal
A hormonális szekréció és tartalom mérése
A glükagon, az inzulin (Mercodia AB, Uppsala Sweden) és a szomatosztatin (Peninsula Laboratories, San Carlos, Kalifornia, USA) koncentrációját a táptalajban és a sejtlizátum mintákban ELISA-val mértük. A hormon tartalmat normalizáltuk a teljes fehérjetartalomra, a DC fehérje esszével mérve (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), majd a kontroll kezelés többszöröseként mutattuk be.
Az FFAR1 shRNS lefelé történő szabályozása
Az FFAR1 rövid hajtű RNS-ét (összefoglalva) az FFAR1 expresszió gátlására használták, és SHCLNV VSV-G Lentivirális részecske transzferrel (Particle Transduction Mission, Sigma Aldrich) adták, amely az Ffar1/Gpr40 összefoglaló célzását tartalmazza a CCGGCGCCTCGGGGGGTGTGTT szekvenciával. Körülbelül 50 szigetet transzdukáltunk minden üregbe (96 üreges lemez szövetkultúra nélkül) 2-5x106 TU transzdukciós részecskékkel 50 μl 1: 1 arányú DMEM-elegyben, CMRL tenyészközeggel keverve (FBS nélkül BSA nélkül). 2 órán át a fent leírtak szerint. Ezután további 150 μl táptalajt adunk hozzá, és az elegyet 22 órán át inkubáljuk. Ezt követően a táptalajt 200 μl CMRL tápközeggel helyettesítettük. A becsült receptorforgalmi kezelés alapján 3 nappal a transzfekció megkezdése után, és a palmitátkezelés megkezdése után 2 nappal vett mintákról.
Az FFAR1 mRNS szintjének mérése valós idejű PCR-rel
A teljes mRNS-t izolációs sejtekből izoláltuk NucleoSpin® RNS (Macherey-Nagel, Duren, Németország) felhasználásával, és reverz transzkripcióval cDNS-be írtuk le az RT-qPCR SuperScript-III First Strand szintézis rendszerével (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A valós idejű PCR-t 10 μl térfogatban hajtottuk végre a Dynamo Capillary SYBR Green qPCR kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) felhasználásával. Az amplifikációhoz a következő primereket használtuk: FFAR1 (előreindító, 5'-ATCACAGCCTTCTGCTAC és fordított primer, 5'-CCTAGATTGGGGTACAGG), β-aktin (előreindító, 5'-ACGTGGACATCCGCAAAGC) és (fordított primer, 5T-CCTTGT Az FFAR1 mRNS szintjét a β-aktin referencia génre normalizáltuk a következő képlet alkalmazásával: célmennyiség = 2-AACt, ahol AACt = [Ct (GPR40 KO) - Ct (β-aktin KO)] - [Ct (GPR40 kontroll) - Ct (β-aktin kontroll)] 55 .
Az FFAR1 fehérjeszint mérése ELISA módszerrel
Körülbelül 100-500 izolált humán szigetet gyűjtöttünk be tenyésztés után, és háromszor mostuk jéghideg PBS-sel. A sejteket 100 μl 1% TritonX-100 (Sigma-Aldrich) PBS-ben lizáltuk. A lizátumok öt gyors fagyasztási és olvadási cikluson mentek keresztül, hogy növeljék a membránhoz kötött fehérjék mennyiségét. A lizátummintákban az összes FFAR1-et kereskedelmi forgalomban lévő emberi FFAR1/GPR40 Sandwich ELISA-val (LS-F8454, LifeSpan BioSciences, WA, USA) mértük a gyártó utasításainak megfelelően. A HEK293 sejteket használtuk negatív kontrollként, és alacsony reakcióképességet mutattak válaszként az EndoC-pH1 sejtekhez képest (lásd a SI kiegészítő ábrát).
Sejtlégzés
Az izolált humán szigetek és az EndoC-pH1 sejtek mitokondriális légzését OCR mérésekkel határoztuk meg XF96e extracelluláris fluxus analizátorral (Agilent Technologies). A vizsgálatokat minimális XF vizsgálati közegben (Agilent Technologies) hajtottuk végre, amelynek pH-ját 7,4-re állítottuk be és 5,6 mM glükózzal egészítettük ki. Mindkét szigetet (lyukanként 10-30, és minden egyes állapotban 10 üreg (N = 10)), valamint az EndoC-pH1 sejteket egy 96 lyukú lyukba helyeztük (lyukanként 60 000 sejt és minden feltételhez legalább 6 üreg (N = 6). ).)) előre bevont (lásd fent) tenyészlemezeket. A mitokondriális funkciót a bazális légzés, az ATP-hez kapcsolódó légzés, a protonszivárgás, a maximális légzési kapacitás mérésével határoztuk meg elektrontranszportlánc oligomicin inhibitorok (2 μM), rotenon (5 μM) és antimycin (5 μM) hozzáadásával. ionofor. FCCP (2 μM) a fent leírtak szerint 16. A bazális OCR-t 2 óra tenyésztés után mértük. Minden OCR-mérést korrigáltunk a nem mitokondriális OCR-re. Eltérő rendelkezés hiányában az összes vegyszert Sigma Aldrich-től szerezték be.
Statisztikai analízis
Az elemzést a Graph Pad Prism szoftver, 6. verzió (San Diego, CA, USA) segítségével végeztük. Statisztikai elemzéshez párosított t-teszteket és ismételt méréseket egyirányú ANOVA-t (Fishers LSD post-hoc teszttel) használtunk. P