elemeket

absztrakt

A nőknél a csírasejtek az őshagymáknak nevezett petefészek-struktúrákban maradnak fenn. A petefészek-tartalékban lévő őshagymák száma a termékenység kritikus meghatározója. E fontosság ellenére hiányzik a pontos fiziológiai mechanizmusok ismerete, amelyek szabályozzák az őskori tüszők számát. Ebben a tanulmányban megmutatjuk, hogy az elsődleges tüszők kimerülési hulláma az egerekben a felnőttkorra való átmenet során következik be. Megmutattuk, hogy az őshagymák hirtelen és drámai elvesztése hormonálisan váltja ki, és azonosítja a pro-apoptotikus fehérjét, csak a BH3-at, egy BCL-2 módosító faktort (BMF), amely elengedhetetlen ehhez a folyamathoz, és egy belső apoptotikus utat jelent kulcsfontosságú mechanizmusnak . Az őshagymák serdülőkorban történő megszüntetése nemcsak figyelemre méltó fejlődési esemény, hanem fiziológiailag is fontos, mert végső soron csökkenti az őshagymák elérhetőségét és meghatározza a termékenység időtartamát. Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a pubertás kritikus fejlődési ablak a petefészek-tartalék méretének szabályozásához, ami befolyásolja a női termékenységet és a reproduktív élettartamot.

A fő

A nem növekvő őshagymák petefészketartalma képviseli a petesejtek teljes készletét, amelyek a nők rendelkezésére állnak a termékenység támogatására a reproduktív élet során. A legtöbb őshagymás tétlen állapotban létezik, de számos aktiválódik a follikulogenezis folyamatának megkezdéséhez. A folliculogenezis végül follikuláris atresiával végződik, vagy ritkábban érett petesejt ovulációjába torkollik. Az őshagymák folyamatos bejutása a növekvő tüszőállományba a petefészek tartalékának fokozatos kimerüléséhez vezet a nők életkorában, meddőség akkor következik be, amikor a tüszők száma kritikus küszöb alá esik. Az őshagymák utánpótlását idő előtt kimeríthetik a genotoxikus stresszt kiváltó szerek (pl. Sok rákellenes gyógyszer és sugárzás), ami oocita apoptózishoz és follikuláris atresiához vezet. 3, 4 Azonban az, hogy a fejlődés által szabályozott apoptózis mennyiben járul hozzá a specifikus exogén ingereknek való kitettség következtében kiváltott apoptózishoz, közvetlenül hozzájárul az őshagymák normális posztnatális csökkenéséhez, kevésbé egyértelmű, és az anyai szüléssel kapcsolatos meddőség időzítését befolyásoló tényezők az öregedés továbbra is rosszul jellemzett.

Számos tanulmány dokumentálta az őstüszők számszerű csökkenését a születés után. 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Egy ilyen vizsgálat egereken azt mutatta, hogy az őshagymák kezdeti petefészek-tartaléka több mint kétharmadával kimerült a posztnatális nap (PN) 6 és 45 között. 8 PN45 után, amikor az egereket ivarérettnek tekintik, az őshagymák fokozatosan tűntek el a petefészek tartalékából. Ezen adatok alapján és állandó veszteségi arányt feltételezve a matematikai modellezéssel végzett vizsgálatok becslése szerint naponta körülbelül 80 primordiális tüsző aktiválódik, hogy elsődleges tüszőkké váljanak, és

A fiatalkori petefészekben naponta 150 őshagymán átesés történik. Így bizonyítékok utalnak arra, hogy a follikuláris atrófiához vezető apoptózis jelentősen hozzájárulhat a petefészek-tartalék méretének csökkenéséhez a születés után, legalábbis nagyon fiatal egereknél. Még nem vizsgálták azt a koncepciót, miszerint nagyszámú tüsző veszhet el a szülés utáni fontos fejlődési események során. Különösen az egerekben nem vizsgálták az őshagymák számát és a pubertás alatti dinamikát, és a posztnatális őshagymák elvesztésének hátterében álló molekuláris mechanizmusok változékonyak maradtak.

az eredmény

Az őstüszők petefészek-tartaléka kimerült egy BMF-függő folyamatban egerekben PN40 és PN50 között.

A tüszőket a WT és a Bmf -/- egerek petefészkeiben számláltuk a PN20, 30, 40 és 50 értékeknél, ami meghaladja azt az időtartamot, amely alatt a nőstény egerek fiatalkorúból ivarérett felnőttekbe kerülnek (1a. És f. Ábra). Ezt az átmeneti időszakot pubertásnak nevezzük. Az őshagymák száma hasonló volt a WT és Bmf -/- egerek petefészkeiben a PN20, 30 és 40 esetében, és viszonylag állandó maradt ez idő alatt (1a. És e. Ábra, 1. és 2. kiegészítő táblázat). Figyelemre méltó, hogy a primer follikulusok száma szignifikánsan csökkent PNT és PN50 között a WT-ben szenvedő nők petefészkeiben (1a. Ábra), de a Bmf -/- nőstények petefészkeiben továbbra is növekedett, jelezve a BMF döntő szerepét ebben a kimerülésben (1a. Ábra), Függelék 1. és 2. táblázat). A primer follikulusok számának csökkenése a WT petefészkekben a PN40 és a PN50 között nem társult a primer, szekunder vagy anális tüszők, azaz a növekvő tüszők számának egyidejű növekedésével (1a-c. Ábra), és összességében nettó volt a tüszőszám elvesztése (1d. ábra). Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy a petefészek-tartalék kimerülése nem a primordialis follikulus aktiválódásának és a növekvő follikulus-medencébe való áttérésnek volt köszönhető. Ehelyett ezek a megfigyelések összhangban állnak azzal a hipotézissel, hogy a petefészek-tartalék körülbelül 50% -a (

1800 őstüsző) közvetlenül elvész ebben a 10 napos periódusban a BMF-függő atrófia miatt. Úgy tűnik, hogy az őshagymák drámai elvesztése erre a viszonylag rövid átmeneti periódusra korlátozódik, mivel korábbi tanulmányaink azt mutatják, hogy a primer tartalék kimerülése sokkal fokozatosabb a felnőtt egerekben a reproduktív élet hátralévő részében. Érdekes módon lényegesen több másodlagos és antrális tüsző volt jelen a PN50-nél a Bmf -/- nőstények petefészkeiben, mint a WT egerekben (1c. És f. Ábra), ami valószínűleg ennek a tüszőpopulációnak a megnövekedett túlélését jelzi. Ez utóbbi megfigyelés összhangban áll a BMF kritikus szerepével a másodlagos és antrális follikulus atresiában, amelyet korábban leírtunk. 5.

hormonálisan

Teljes méretű kép

Follikuláris atresia serdülő és felnőtt WT és Bmf -/- nőstény egerekben

Petefészek follikuláris atresia WT és Bmf -/- egerekben. Az atrétikus tüszők számát a WT és Bmf -/- egerek petefészkeiben határoztuk meg PN20, 30 40 és 50 értékeken (n = 6/életkor/genotípus). ( a ) Atretikus preantralis (szekunder) és antrális tüszők reprezentatív képei a PAS-festett petefészek szakaszokban WT és Bmf -/- egerekből PN50-nél. Az atrétikus preantralis és antrális tüszőket lebontó petesejtek és/vagy piknotikus granulosa sejtek jelenléte jellemezte. Méret = 50 μm. ( b ) A TUNEL-pozitív atrétikus tüszők (barna festés) reprezentatív képei a WT és Bmf -/- egerek szekunder follikulusaiban a PN50-nél. Méret = 50 μm. ( c ) Az adatokat a P -/- nőstények átlagos ± SEM számában fejezzük ki a WT nőstényekhez viszonyítva a P -/- nőstények minden életkorában. A genotípuson belüli összes páros összehasonlítás statisztikai szignifikanciáját lásd az 1. és 2. táblázatban

Teljes méretű kép

Pubertus átmenet WT és Bmf egerekben -/-

A pubertás kezdete WT és Bmf -/- egerekben. ( a ) A WT és Bmf -/- egerek százalékos arányát, amelyek petefészkeiben legalább egy sárgatest található, PN20, 30, 40 és 50 értékeken határozták meg (n = 6/életkor/genotípus). Az elemzett egerek számát minden oszlop felett feltüntetjük. ( b ) A petesejtben jelen lévő corpora lutea átlagos számát a WT és a Bmf -/- egerekben (csak az egereket, amelyek legalább egy corpora lutea-t tartalmaztak az elemzésben) PN20, 30, 40 és 50-ben határoztunk meg. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. (ahol n = 3 vagy több). # P -/- szemben a WT-vel a PN50-nél (kétpontos párosítatlan tanulói t-teszt). ( c ) A WT és a Bmf -/- egerek PAS-festett petefészek szakaszainak reprezentatív képei a PN20, 30, 40 és 50 értékeken. A "CL" jelölés az egyes sárgatestek helyét jelzi. Méret = 200 μm

Teljes méretű kép

A serdülőkorban a tüszővesztés hormonális, és nem életkorfüggő

Bár nem világos, miért ilyen nagyszámú tüsző eliminálódik a nemi érés jelenlegi szakaszában, két legutóbbi, egereken végzett tanulmány némi betekintést nyújthat. 33, 34 Ezek a tanulmányok azt sugallják, hogy a petefészkekben két primordiális tüsző van, amelyeknek különböző funkcionális szerepük van. A 33, 34 primer tüszőket, amelyek elsősorban a magzati petefészek follikuláris alapjában képződnek, a velőben elfoglalt helyzetük és a születéskor bekövetkező gyors aktiválás jellemzi. Ezen tüszők többsége a PN60 előtt elveszett/használt és elsősorban a funkcionális nemi érettség és az endokrin ciklikusság kialakulásához járul hozzá. A pubertás során a petefészkekből kiválasztott őshagymák kohorsza, amelyet ebben a vizsgálatban jellemeztünk, ebbe az első populációba tartozhat. Az őshagymák második populációja valamivel később alakul ki a magzat petefészkében, a petefészek kérgében helyezkedik el, és elsősorban a felnőttek termékenységéért felelős. 33, 34 Összességében ezek az adatok azt sugallják, hogy funkcionális különbségek vannak az őshagymákban a pubertás előtt és után, és hogy a serdülőkorban bekövetkező érési folyamatok, ideértve a kóros tüszők elvesztését és a tüszők kialakulásának fokozott képességét, fontosak lehetnek a teljes mértékben funkcionális tüszőképződés szempontjából. felnőtt petefészek.

Bár a pubertáshoz kapcsolódó tüszők számát nem vizsgálták kifejezetten a pubertás előtti és utáni lányoknál (és a megfelelő szövetminták korlátozott rendelkezésre állása miatt nem lehetséges), az életkor alapján végzett adatok arra utalnak, hogy az őshagymák száma kb. egy. fele a serdülő/fiatal felnőtt időszakban emberben (13-25 év), 1 hasonló ahhoz, amit egérmodellünkben megfigyeltünk. A közelmúltban kiderült, hogy az őshagymapopulációk morfológiai és funkcionális változásokon mennek keresztül az életkor és a pubertás során az embereknél: a pubertás előtti emberi petefészkekben az őshagymák közel 20% -a rendellenes volt (definiálva: olyan tüszők, amelyekben szokatlanul nagy petesejt található, gyengén foltos mag). mely kóros őshagymákat soha nem figyeltek meg felnőtt szövetekben. A szerzők feltételezték, hogy az alacsony minőségű őshagymákat a felnőttkorban az ovuláció bevezetése előtt eliminálták vagy előnyben részesítették. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a pubertás során a petefészkekben bekövetkező változások meghaladják az antrális tüszők ovulációhoz történő ciklikus toborzását, és magukban foglalják az őshagymák petefészek-tartalékának méretének változását.

Összefoglalva azt tapasztaltuk, hogy az őshagymák körülbelül 50% -a elvész közvetlenül a petefészek tartalékából közvetlenül a felnőttkor előtt egy olyan folyamatban, amelyhez proapoptotikus fehérje BMF szükséges, és amelyet a gonadotropin vált ki. A pubertást fontos fejlõdési idõpontként publikáltuk, amely alatt a petefészek-tartalék jelentõsen kimerül, és ami fontos, már megmutattuk, hogy a tüszõk számának ez a csökkenése végeredményben csökkenti a nõ termékeny életét. Munkánk új megvilágításba helyezi azokat a fejlődési mechanizmusokat, amelyek szabályozzák a petefészek-tartalékok méretét és meghatározzák a női termékenység támogatására rendelkezésre álló tüszők számát. Ezenkívül ezek az adatok új megértést nyújtanak a petefészek-tartalék időbeli szabályozásáról, megmutatva, hogy a posztnatális stabil primordialis follikulusvesztés helyett 6, 7, 8, 9, 10, 11, 36 egy aktív follikulusvesztési hullám. pubertáskor váltja ki, és a follikuláris medence gyors kimerülését eredményezi.

Anyagok és metódusok

A C57BL/6 háttérrel rendelkező Bmf -/- egereket fentebb leírtuk. 13 C57BL/6 (WT) és Bmf -/- egeret egy magas hőmérsékletű, szabályozott gáton (Monash University ARL) helyeztünk el, amelyhez szabad hozzáférés volt az egerekhez és a vízhez, valamint 12 órás világos-sötét ciklusban. Minden állatkísérletet és kísérletet az ausztrál NHMRC állatgondozási és használati szabályzatnak megfelelően hajtottak végre, és a Monash Állatetikai Bizottság jóváhagyta.

Az egészséges tüszők számának felmérése

Objektív sztereológiát alkalmaztak a tüszők számának meghatározásához. A sztereológiát a szöveti metszetek sejtjeinek számszerűsítésére szolgáló legjobb módszerként ismerik el. 37 WT és Bmf -/- egér petefészkét (PN20, 30, 40, 50, n = 6/életkor/genotípus) rögzítettünk Bouin oldatában, hidroxietil-metakrilát gyantával kezeltük (Technovit 7100; Kulzer and Co., Friedrichsdorf, Németország ), majd 20 μm-en sorozatosan elosztva egy Leica RM2165 mikrotommal (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Németország). A metszeteket perjodát-Schiff savval és hematoxilinnel festettük. Részletesen leírták a sztereológ tüszőszámok módszertanát. 6, 38 Röviden: Olympus BX50 mikroszkópon (Tokió, Japán) × 100-as olajmerítő lencsét használtunk Autoscan fázissal (Autoscan Systems Pty Ltd, Melbourne, VIC, Ausztrália), amelyet a StereoInvestigator sztereológiai rendszer irányított (11.06.02 verzió, MBF Bioscience 2015, MicroBrightField, Inc., Williston, VT, USA). Minden harmadik részt megszámláltunk, és a tüszők számát úgy határoztuk meg, hogy a nyers petesejt számokat (Q -) megszoroztuk mindhárom mintavételi frakcióval (1/f1, 1/f2 és 1/f3). 38

Az atrétikus tüszők számának felmérése

Az atretikus tüszők számát a petefészek egymást követő 20 μm-es glikometakrilát-szakaszain számláltuk a frakcionálás/fizikai boncolás módszerével, a fentiek szerint. Az ős-, elsődleges és másodlagos tüszőket atretikusnak minősítették, ha degenerált petesejtet tartalmaznak (szabálytalanul felgyorsult plazmamembrán vagy töredezett csíravezeték-vezikulum jelzi), vagy ha a granulosa sejtek széttöredezettek vagy piknotikus fuzionált magokkal rendelkeznek. Az antrális tüszőket atrétának tekintették, ha granulosa sejtjeinek több mint 10% -a apoptotikus volt, vagy ha degenerálódó petesejtet tartalmaznak.

Pubertás besorolás: corpora lutea számok

A sárgatestek számát minden egymást követő 20 μm-es, a teljes petefészket tartalmazó 20 μm-es glikometakrilát-szakasz közvetlen számlálásával határoztuk meg. A szomszédos metszeteket kiértékeltük annak biztosítására, hogy az egyes sárgatesteket csak egyszer számoljuk meg.

A pubertás elnyomása

A gonadotropin-felszabadító hormon antagonistát, a Cetrorelix-et (Sigma, Castle Hill, NSW, Ausztrália, Cat. No. 5249) alkalmazták a pubertás késleltetésére WT egerekben a rágcsálóknál fent leírt napi dózisok alkalmazásával. 39, 40, 41 injekciót (0,1 ml) sóoldatot vagy Cetrorelix-et (0,5 mg/testtömeg-kg/nap) adtunk be subcutan naponta, 25 napig (n = 6 egér/csoport). A kezelést a pubertás kezdete előtt kezdték meg, amely nőstény egereknél először hüvelynyílásként nyilvánul meg, amely körülbelül PN28 +/−2 értéknél következik be egértelepünkön. Ezért a kezelést PN25-nél kezdték, és a kísérlet végéig folytatták a PN50-nél. Valamennyi állatot naponta ellenőriztük a hüvely kinyílásának szemrevételezéssel. Miután észlelték a hüvely nyitását, naponta hüvelyi tamponokat gyűjtöttek az észterek ellenőrzésére.

Stimulálás ló koriongonadotropinnal és humán koriongonadotropinnal

A PN20 ivarérett nőstény WT egereket fiziológiás sóoldattal (kontroll) vagy ló koriongonadotropinnal (eCG, 5IU) injektáltuk, majd 44-48 órával később emberi koriongonadotropin (hCG, 5IU) injekcióval (n = 6/csoport). A PN30-ban összegyűjtötték a petefészkeket és megszámolták az őshagymákat.

TUNEL színezés

Az apoptotikus sejtek petefészek szakaszokban történő kimutatásához apoptózis detektáló készletet alkalmaztak az apoptózis kimutatására egy adott helyzetben (Chemicon International, Melbourne, Ausztrália) a gyártó utasításainak megfelelően. Az apoptotikus sejteket 0,05% DAB-kromagén (Sigma, Castle Hill, NSW, Ausztrália) hozzáadásával tettük láthatóvá, és a metszeteket tiszta Harris-hematoxilinnel ellenfestettük. Legalább három véletlenszerűen kiválasztott tárgylemezt (n = 6) értékeltünk minden állat esetében. A pozitív kontrollokat a DNSseI készítmények exponálásával hajtottuk végre (a készlet utasításainak megfelelően). Az egyik tárgylemezt az egyes tárgylemezeken használtuk a TUNEL elemzéshez, míg a másik negatív kontrollként szolgált (TdT hozzáadása nélkül).

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be, és a tüszőszám statisztikai elemzését a GraphPad Prism szoftver (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) segítségével végeztük el. A normálisan elosztott adatokat hallgatói t-teszt alkalmazásával elemeztük páros összehasonlítások vagy egyirányú ANOVA segítségével, és a szignifikanciát Tukeys post-hoc többszörös összehasonlító teszttel határoztuk meg. A különbségeket akkor tekintették jelentősnek, amikor P