elemeket

absztrakt

Az elhízás előfordulása az utóbbi évtizedekben növekszik 1. Az Egészségügyi Világszervezet szerint az elhízás és a túlsúly világszerte több alsósúlyú halálozással jár. Az elhízás és metabolikus szindróma egészségügyi, társadalmi és gazdasági problémává vált. Az elhízást a zsírszövet túlzott felhalmozódása jellemzi a testben 2; míg a zsírszövetekkel járó centrális elhízás főleg a hasi szubkután és zsigeri depókban halmozódik fel 3, 4. Ezek a szubkután zsírszövetek szorosan kapcsolódnak a 3, 4, 5 inzulinrezisztenciához, és az elhízottak hajlamosak metabolikus szövődményekre 3 .

Az adipociták kanonikus szerepe az, hogy szabályozóként szolgáljon a test energiaháztartásának fenntartására 6. A triacil-glicerint (TG) az adipociták citoszolos lipidcseppjeiben tárolják az energiafelesleg idején, és mozgósítják a zsírsavak felszabadítására lipolízissel, ha energiára van szükség, vagy hormonális hatás alatt 7. Az elhízás azonban mindig a katekolamin 8 által stimulált lipolízisre adott csökkent reakcióval jár, mivel elhízott egyéneknél a béta-adrenerg receptor 8 által stimulált lipolízis károsodott. Az elhízott egyének adipocitáinak hormonális stimulált körülmények között alacsonyabb az adenilil-cikláz aktivitása, mint az elhízott kontrollok adipocitáiban 9, 10. A tanulmány kimutatta, hogy dibutiril cAMP-val történő stimulálás után az elhízott egyénekből izolált adipocytákban a maximális lipolitikus kapacitás alacsonyabb volt, mint a nem elhízott egyénekből izolált adipocytákban 8. Ez a megállapítás azt is sugallja, hogy az elhízott alanyok adipocitáinak károsodott lipolitikus válasza van a béta-adrenerg stimulációra.

A Schisandrin B (SchB) az egyik leggyakoribb és legaktívabb dibenzociklooktadién-származék, amely megtalálható a Schisandra chinensis gyümölcseiben. A Schisandra chinensis (Turcz.) Baill Észak-Kínában, Japánban, Koreában és Oroszország szomszédos területein található, és gyógynövényként alkalmazzák az egészségügyben 18. A mai napig beszámoltak arról, hogy az SchB hepatoprotektív tulajdonságokkal rendelkezik, 19, 20, csökkenti a máj lipidtartalmát 21, javítja a glükóz homeosztázisát és növeli a máj inzulinérzékenységét22. Funkcionális szerepét az adipocita lipid metabolizmusának szabályozásában azonban még nem vizsgálták. Ebben a tanulmányban az SchB funkcionális szerepét vizsgáltuk a szubkután zsírszövet redukciójában az adipocita lipid metabolizmusának szabályozásával.

az eredmény

Az SchB csökkenti a 3T3-L1 adipociták lipidtartalmát

Az SchB a dibenzociklooktadién származéka (1a. Ábra). Először az UHPLC analízist használtuk a SchB tisztaságának megerősítésére, amely 97% volt (1b. Ábra).

lipid

Schisandrin B. ( a ) A Schisandrin B (SchB) szerkezete; ( b ) SchB kromatogramja UHPLC analízisben.

Teljes méretű kép

Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a SchB szabályozta-e a lipid anyagcserét a fehér adipocitákban. In vitro modellként 3T3-L1 adipocitákat használtunk. A kísérletekhez szükséges SchB szubtotoxikus koncentrációjának meghatározásához a 3T3-L1 adipocitákat SchB-vel kezeltük különböző koncentrációkban 24 órán keresztül, és MTT vizsgálatot végeztünk. Amint az a 2. ábrán látható. A 2a. Ábrán a 3T3-L1 adipociták SchB-jének IC50-értéke 172,8 μM volt. Ezután a 3T3-L1 SchB adipocitákat 80 μM-mal kezeltük az ötödik napon a differenciálódás során. Érdekes módon azt tapasztaltuk, hogy az SchB csökkenti a lipidcseppek számát (2b. Ábra) és ezen adipociták lipidtartalmát (2c. Ábra, d). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az SchB szabályozza a lipid metabolizmust a 3T3-L1 adipocitákban.

Az SchB csökkenti a 3T3-L1 adipociták lipidtartalmát. a ) SchB sejtek életképességi vizsgálata 3T3-L1 adipocitákon. ( b ) Lipidcseppek a kontroll és SchB-vel kezelt (80 μM) 3T3-L1 adipocytákban. A lipidfestés mennyiségi meghatározása a kontroll és SchB-vel kezelt 3T3-L1 adipocytákban ( c ) Olajvörös O a ( d ) Nílus vörös. Átlagok ± SE, n = 3 egyedi kísérlet látható. * o

Az SchB lipolízist indukál a 3T3-L1 adipocitákban. ( a ) A reprezentatív Western az ATGL, a HSL és a foszfo-HSL fehérje expresszióját mutatja kontroll és SchB-vel kezelt (80 μM) 3T3-L1 adipocitákban és ( b ) a nyugati jel számszerűsítése a HSL és a p-HSL esetében. ( c ) cAMP szintek a kontroll és SchB-vel kezelt 3T3-L1 adipocitákban. Átlagok ± SE, n = 3 egyedi kísérlet látható. * p a p b p

Az SchB növeli a zsírsav oxidációs gének expresszióját a 3T3-L1 adipocitákban. a ) Acil-CoA-oxidáz 1 (Acox1), malát-dehidrogenáz 2 (Mdl2), karnitin-palmitoil-transzferáz 1 (CPT1), citokróm c-oxidáz VIIIb alegység (Cox8b), nagyon hosszú láncú acil-CoA dehidrogenáz (Acadvl) expressziója kontrollban és SchB- o (80 μM) 3T3-L1 adipociták. Átlagok ± SE, n = 3 egyedi kísérlet látható. * p 7, 12, 13, 14, 16, ex vivo és in vivo vizsgálatokhoz hoztuk létre az elhízás okozta étrend (DIO) egérmodelljét, hogy megvizsgáljuk a SchB adipocita lipid anyagcserére gyakorolt ​​hatását. Ebben a tanulmányban a DIO egérmodelljét használtuk, mivel ezek a DIO egerek nincsenek genetikailag módosítva. Emellett utánozzák az elhízás jelenlegi elterjedtségét, ahol az egyének többségénél túlzott kalóriabevitel mellett alakul ki elhízás. Meghatároztuk a DIO egér modelljét magas zsírtartalmú (HFD) C57BL/6 egerek etetésével vagy ennek megfelelő kontroll étrenddel 12 héten keresztül. Amint az a 2. ábrán látható. A 6.a ábrán a 10. héttől kezdődően a HFD-vel táplált egerek testsúlya szignifikánsan nagyobb volt, mint a kontroll étrenden lévő egerek súlya (6a. Ábra). A súlygyarapodás százalékos aránya 62,06 ± 5,55% volt a HFD-vel táplált egereknél és 33,49 ± 3,41% azoknál az egereknél, akik 12 héten át táplált kontroll étrendet kaptak.

Az elhízás okozta étrend által kiváltott egerek. ( a ) Testtömeg és ( b ) különböző súlyú zsírraktárak DIO egerekben. Szubkután zsírszövet (SAT), epididymális zsírszövet (EAT), perirenalis zsírszövet (PAT) és barna zsírszövet (BAT) DIO egerekben. Az egyes csoportok átlag ± SE, n = 10 egere látható. * o

Az SchB ex vivo vizsgálatban fokozza a lipolízist a DIO egerektől elválasztott zsírpárnákban. ( a ) A reprezentatív Western bemutatja a HSL és a β-HSL expresszióját a szubkután adipocitákban, elosztva DIO egerektől és ( b ) a nyugati jelek számszerűsítése. A NEFA megjelent ( c ) szubkután zsírszövet (SAT), ( d ) epididymális zsírszövet (EAT) és ( e ) DIO egerekből boncolt perirenális zsírszövet (PAT). Az egyes kísérletek átlagát ± SE, n = 5 mutatjuk be. * p a p b p

A szubkután zsírszövet szorosan összefügg a 3., 4., 5. metabolikus szindrómával. A szubkután zsírszövet felhalmozódása elhízott egyénekben részben annak tudható be, hogy a szubkután zsírszövetek rezisztensek a lipolízissel szemben3. A HSL szabályozza a 11. lipolízis szabályozási lépését, a HSL expressziója és aktivitása alacsonyabb a szubkután adipocitákban, mint más zsírraktárakból származó adipocitákban 25. Ezenkívül a szubkután adipociták alacsonyabb érzékenységgel rendelkeznek a katekolamin által kiváltott lipolízissel szemben, és nagyobb érzékenységet mutatnak az inzulin anti-lipolitikus hatásokkal szemben, mint más adipociták 3. Ezért a korlátozott táplálékfelvétel és a testmozgás általában sokkal jobban csökkenti a zsigeri zsírszövetet, mint a szubkután zsírszövet 3, 26. Ezen túlmenően, elhízott állapotban, amelyet inzulinrezisztencia kísér, a fehér adipocitákban a katekolamin által kiváltott lipolízis általában megszakad 15, 27, ami elhízott egyéneknél a zsírszövet felhalmozódásához is vezet.

Vizsgálatunk kimutatta, hogy az SchB fokozza a lipolízist és a zsírsavoxidációs gén expressziót a szubkután adipocytákban DIO egerekben, új terápiás megközelítést javasolva a szubkután zsírszövet csökkentésére elhízott egyéneknél. Az Sch B egy természetes vegyület, amelyet nem mérgező kínai gyógynövényekből izoláltak. Állatkísérletek kimutatták, hogy a SchB hosszú távú kezelésének nincs kimutatható káros hatása28. Adataink azt is megmutatták, hogy az SchB-kezelés nem okozott megfigyelhető káros hatást egerekben vagy indukált apoptózist adipocitákban (az adatokat nem mutatjuk be), ami arra utal, hogy az SchB biztonságos terápiás szer.

A Schisandra beadása utáni SchB szinteket egér plazmában mértük, és az adatok azt mutatták, hogy a SchB maximális volt a gyomorban 15 perccel az intragasztrikus beadás után, és a beadás után 2 órával az összes szövetben elérte a maximális koncentrációt. Az intravénás injekciót követően az SchB elsődlegesen a plazmában, a májban és a vesében oszlott el 15 perccel az injekció beadása után. Ezek a tanulmányok azt sugallják, hogy az SchB nem toxikus állatmodellekben. Az SchB eloszlását a szubkután zsírszövetben intragasztrikus beadást vagy intravénás injekciót követően nem vizsgálták 36. Kísérleti tervezésünk során szubkután injekciót alkalmaztunk, amely elősegítheti az Sch B lokalizálását a szubkután zsírszövetben a maximális elhízás elleni hatás elérése érdekében. Az egerekben a 0,4 g/kg dózis 0,03 g/kg emberi dózisnak felel meg. Az USA Gyógyszerészeti Egyezménye (USP) által közzétett Herbal Medicines Survey (HMC) alapján a Schisandra chinensis (Turcz.) Szárított, érett gyümölcs kivonata az összes ligandum legalább 90% -át és legfeljebb 110% -át tartalmazza, beleértve \ t skizandrin B (y-skizandrin, C23H28O6), szkizandrol B (C23H28O7) és szkizandrin A (deoxyschisandrin, C24H32O6) szárított alapon. A tanulmány azt is kimutatta, hogy a kínai különböző területekről gyűjtött tíz Schinsandra chinensis minta lignántartalma eltérő volt 37 .

Vizsgálatunk egyértelműen igazolta a SchB által szabályozott adipocita lipid anyagcserét, a PKA által közvetített HSL aktivitást, a fokozott zsírsav felszabadulást és a zsírsav oxidációs gén expresszióját DIO egerek szubkután adipocitáiban. Adataink tisztázzák az Sch B-t tartalmazó Sch B vagy Schisandra chinensis magok lehetséges terápiás alkalmazását az elhízás és ezáltal az elhízással összefüggő, elhízással összefüggő állapotok csökkentésére.

Anyagok és metódusok

anyagok

A Schisandrin B-t (SchB) a Ningli Technology Co.-tól vásárolták. Ltd. (Kunming, Kína). A 3T3-L1 adipocitákat az American Type Culture Collection (ATCC) -től szereztük be. A Dulbecco módosított esszenciális táptalaját (DMEM), a magzati borjúszérumot, a penicillint, a sztreptomicint, a Hank kiegyensúlyozott sóoldatát (HBSS) és a Fluo-3/AM-t a Life Technologies Limited-től vásároltuk. Az adipocita triglicerid lipáz (ATGL), a hormonérzékeny lipáz (HSL), a β-HSL (563 és 565 szerin), a hasított kaszpáz 3 és a GAPDH antitesteket a Cell Signaling vagy a Santa Cruz Biotechnology Inc. cégtől vásároltuk. izoproterenol, szabad glicerin-reagens, glükóz, zsírsavmentes BSA, vörös O-olaj, Nílus-vörös, hematoxilin és eozin, dimetil-szulfoxid és 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolium-bromid (MTT) ) a Sigma-Aldrich Chemical Co.-tól vásároltuk. A H89-et Calbioch vásárolta meg. A CAY10499-et a Cayman Chemical cégtől vásároltuk. Valamennyi szerves oldószer HPLC minőségű volt a Sigma-Aldrich Chemical Co-tól.

3T3-L1 sejttenyészet és adipocita differenciálódás

A 3T3-L1 adipocitákat Dulbecco módosított esszenciális táptalajában (DMEM) tenyésztettük, amely 25 mM glükózt tartalmaz, és 10% magzati borjúszérummal, 100 NE/ml penicillin G-vel és 0,1 mg/ml sztreptomicinnel kiegészítve. A differenciálódás kiváltása érdekében az összefolyó 3T3-L1 sejteket 1 μM dexametazont, 0,5 mM metilizobutilxantánt és 1,7 μM inzulint tartalmazó differenciálási koktéllal kezeltük. 48 óra elteltével a differenciálási koktélt 2 napig inzulintartalmú fenntartó tápközeggel helyettesítették, mielőtt inzulinmentes táptalajra váltottak .

Az állatok kezelése

Minden állatkísérletet a Hongkongi Egyetem Baptista Egyetem irányelveinek megfelelően hagytak jóvá és hajtottak végre, az egyetem Emberi és Állatkutatási Bizottsága, valamint az Egészségügyi Minisztérium, Hongkong Különleges Közigazgatási Terület jóváhagyta. 5 hetes hím C57BL/6 (C57) egereket vásároltunk a Hongkongi Kínai Egyetemen. Az egereket véletlenszerűen választottuk ki kontroll kontroll étrendre (D12450J Research Diets) vagy magas zsírtartalmú étrendre (D12762 Research Diets), amelyet elhízás kiváltására használtak. Az étrend és a víz ad libitum volt. Minden egér testtömegét hetente regisztráltuk. 12 hetes diétás beavatkozás után az étrend okozta elhízás (DIO) bevett modelljeit használták a kísérletekben. Az in vivo kísérletekhez a DIO egereket vagy SchB-vel adtuk 0,4 g/kg/nap szubkután injekcióval 0,02 ml dimetil-szulfoxidban, vagy önmagában vivőanyaggal (0,02 ml dimetil-szulfoxid) kontrollként 5 napig. Ezen egerek viselkedési változásait, testtömegét és táplálékfelvételét naponta regisztrálták.

Adipociták izolálása

Az adipociták izolálását a zsírszövetből a máshol leírtak szerint végeztük 38. Röviden: az egerekből összegyűjtött zsírszövetet egy órán át 37 ° C-on emésztettük Kreagen-Ringer pufferben (KRB; 12 mM HEPES, 121 mM NaCl, 4,9 mM KCl, 1,2 mM MgS04 és 0,33 mM CaCl2) kollagénázzal kiegészítve. 3 mM glükóz és 1% zsírsavmentes BSA, nylon hálón átszűrve. Az adipocitákat centrifugálás után eltávolítottuk a felső fázisból. Az izolált adipocitákat egy 39-es hemocitométer alkalmazásával számoltuk meg .

lipolízis

A DIO egerek zsírpárnáit kivágtuk és 50 mg-os mintákra vágtuk, és 37 ° C-on inkubáltuk KRB-nél történő rázás nélkül (12 mM HEPES, 121 mM NaCl, 4,9 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 0,33 mM CaCl 2), 2% zsírtartalommal. savak. BSA és 0,1% glükóz 38 SchB vagy hordozó jelenlétében. Ebben az időpontban a NEFA és a glicerin felszabadulást inkubációs puffer alikvot részeiben mértük LabAssay NEFA kit (Wako Chemicals) és szabad glicerin reagens alkalmazásával. A 3T3-L1 adipociták lipolízisének mérésére a sejteket KRB-vel mossuk, és 2% zsírsavmentes BSA-val és 0,1% glükózzal kiegészített KRB-vel inkubáljuk SchB vagy hordozó jelenlétében. Izoproterenolt használtunk pozitív kontrollként. Ebben az időpontban a NEFA és a glicerin felszabadulását inkubációs puffer alikvot részeiben mértük LabAssay NEFA készlet és szabad glicerin reagens alkalmazásával. Mindegyik kezelést három példányban hajtottuk végre.

A sejtek életképességének vizsgálata

Az SchB 3T3-L1 adipocitákra gyakorolt ​​citotoxicitását a 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolium-bromid (MTT) vizsgálattal értékeltük. A 96 üregű lemezeken lévő sejteket SchB-vel kezeltük, és inkubálás után mindegyik mélyedéshez 20 μl MTT-oldatot (5 mg/ml) adtunk. A lemezeket tovább inkubáltuk 37 ° C-on 4 órán át, majd 100 μl DMSO-t adtunk hozzá. Az optikai abszorbanciát 570 nm-en határoztuk meg mikrolemezes spektrofotométerrel. Mindegyik kezelést három példányban hajtottuk végre.

Olajfestés Vörös O

A 3T3-L1 hordozóval vagy SchB-vel kezelt adipocitákat frissen előállított Oil Red O munkaoldattal festettük 20 percig szobahőmérsékleten. A festés számszerűsítése érdekében az olajos Red-O-t 4% Nonidet P-40-et tartalmazó izopropanollal extraháltuk, majd az optikai sűrűséget 520 nm-en 40 mértük. Mindegyik kezelést három példányban hajtottuk végre.

Nílus vörös színű

A 3T3-L1 adipocitákat vivőanyaggal vagy SchB-kezeléssel 1 μM Nile Red-rel festettük Hank kiegyensúlyozott sóoldatában (HBSS) 15 percig. 10 000 nílusi vörösrel festett sejt mintáit áramlási citométerrel (BD Bioscience) 41 számoltuk meg. Mindegyik kezelést három példányban hajtottuk végre.

Hematoxilin és eozin festés a szubkután zsírszövetben

A SAT-kat 10% -os pufferelt formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk, 6 μm vastag metszetekre vágtuk, és hematoxilinnel és eozinnal festettük. .

Western blot elemzés

Western-blot-analízist a leírtak szerint végeztünk. Röviden, az átvitt fehérjéket hordozó nitrocellulóz membránt egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk a megfelelő antitesttel 1: 1000 arányban. Az immundetektálást torma-peroxidázzal konjugált szekunder antitest, majd ECL-detektáló rendszer (Amersham) alkalmazásával végeztük.

A polimeráz láncreakció valós idejű elemzése

Az összes RNS-t Trizol reagenssel (Invitrogen) extraháltuk, és DNáz 1-gyel (Invitrogen) kezeltük. Az RNS-t (2 μg) reverz átírással oligo-dT-vel írtuk át M-MLV reverz transzkriptáz (Promeg) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint. A valós idejű PCR-t zöld SYBR reakcióelegy alkalmazásával hajtottuk végre egy ABI 7500 gyors, valós idejű PCR rendszerben (Applied Biosystemsm). A génexpressziós adatokat normalizáltuk az endogén kontroll béta-aktinná. A relatív génexpressziós szinteket a 2-ACt képlet szerint mértük, ahol az ACt a küszöbérték-különbség a célpontok és a β-aktin között. Az összes mintát három példányban elemeztük.

a cAMP meghatározása

Az adipociták CAMP-szintjét a 42. részben leírtak szerint mértük. Röviden, a 3T3-L1 adipocitákat vagy SchB-vel kezeltük a megadott koncentrációban, vagy vivőanyagként kontrollként 6 órán keresztül. Az adipocitákat ezután PBS-sel mostuk, és a cAMP-méréshez immunanalízissel (BioVision) lizáltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Az adipocita fehérjék mennyiségét minden csoportban Bradford módszerrel mértük. Mindegyik kezelést három példányban hajtottuk végre.

Mintakészítés LC/MS-hez

A 3T3-L1 adipocitákat vivőanyagként 120 μM SchB-vel vagy DMSO-val kezeltük 24 órán át. A lipidomikus vizsgálat céljából ezekből a sejtekből lipideket extraháltunk. 0,3 ml 0,5 M KH2P04-et, 1,5 ml kloroformot és 0,5 ml metanolt adunk mindegyik mintához. 2 percig tartó vortexelés és 2000 x g sebességgel történő centrifugálás után az alsó fázist elválasztjuk és nitrogénáram alatt bepároljuk. A maradékot 100 ul izopropanol-acetonitrilben (1: 9, v/v) oldjuk fel LC/MS 43 elemzés céljából. .

LC/MS elemzés és adatfeldolgozás

köszönöm

Ezt a munkát részben támogatta az Egészségügyi Kutatási Alap (HMRF/14-15/03), a Hongkongi Baptista Egyetem FRG2/14-15/017, FRG2/16-17/076 és FRG2/16-17/010 innovációt díjazta és technológia Hongkongban (UIM/290) és a Consun Pharmaceutical Group Limited.

Elektronikus kiegészítő anyag

További információ

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.