elemeket

absztrakt

Az EBI2 egy oxigén-7a, 25-dihidroxi-koleszterin (7a25HC) által aktivált G-fehérjéhez kapcsolt receptor, amely szabályozza a T-sejt-függő antitest választ és a B-sejtek migrációját. Nemrégiben azt tapasztaltuk, hogy az EBI2 humán asztrocitákban expresszálódik, szabályozza az intracelluláris jelátvitelt és modulálja az asztrocita migrációt. Itt arról számolunk be, hogy az LPS kezelése egér asztrocitákban megváltoztatja az EBI2 és az oxiszterol mRNS szintjét, ami arra utal, hogy az EBI2 jelátviteli út érzékeny az LPS által közvetített immun kihívásra. Megállapítottuk azt is, hogy az LPS-stimulált egér asztrocitákból nyert kondicionált táptalaj makrofág-migrációt indukál, amelyet az EBI2 antagonista NIBR189 gátol. Ezek az eredmények bemutatják az EBI2 jelátviteli út szerepét az asztrocitákban, mint érzékelőt az immunstimulációhoz és a veleszületett immunsejtekkel, például a makrofágokkal való kommunikációhoz.

Az asztrocitákban az EBI2 jelátviteli út további szerepeinek meghatározásához megvizsgáltuk az egér asztrociták LPS általi modulációját. Azt is megvizsgáltuk, hogy az EBI2 szignalizáció szerepet játszik-e az asztrocita sejtes kommunikációjában a makrofágokkal.

az eredmény

Az LPS-stimulált egér asztrocita kondicionált táptalaj makrofág-migrációt indukál

Egyre több bizonyíték van arra, hogy az asztrociták számos olyan jelzőmolekulát (citokin, kemokin, növekedési faktor, nitrogén-oxid és más) termelnek, amelyek lehetővé teszik a veleszületett immunsejtekkel való kommunikációt és esetleg elősegítik azok migrációját24. Először arra törekedtünk, hogy bemutassuk, hogy az LPS által stimulált asztrociták képesek kiváltani a veleszületett immunsejtek migrációját, és ebben a tanulmányban arra összpontosítottunk, hogy képesek legyenek szabályozni a makrofág-migrációt. A 7α25HC-vel (0,01 μM) kiegészített vagy LPS-ből (100 ng/ml, 0-24 óra) az egér asztrocitákból (LPS-Astro-Med) gyűjtött táptalajokat az RAW264 makrofágokat tartalmazó xCELLigence® migrációs transzwell rendszer alsó kamrájába helyeztük. 7 sejt a felső kamrában (1a. Ábra). Ez az LPS-Astro-Med idõfüggõ módon szignifikáns RAW264.7 makrofág sejtek migrációját indukálta a kezeletlen asztrocitákkal szemben (192,2% +/- 50,2% 6 óra után, 211,0% +/- 66,5% 8 óra után) (ábra (1b). Az LPS-sel kezelt asztrocitákból származó táptalajok 2, 4 és 24 órán át nem indukáltak makrofág-migrációt, jelezve az időválaszt, és azt is, hogy önmagában a hozzáadott LPS nem változtatta meg közvetlenül a makrofág-migrációt ezekben a kísérletsorozatokban (1b. Ábra).

szerepet

Az elsődleges egér asztrociták kezelése LPS-sel (100 ng/ml) négy és nyolc óra elteltével 25HC-szintet indukált ( a ) 7a25HC nyolc és 15 óra elteltével ( b ) és 7p25HC négy, nyolc és 15 óra elteltével ( c ). Az adatok átlagként +/− SEM, n = 3 - 6. egyirányú ANOVA Dunnett utótesztjeivel, * p> 0,05, ** p> 0,01, *** p> 0,001 a megfelelő kontrollhoz viszonyítva.

Teljes méretű kép

Az EBI2 szabályozza az egér asztrocita kondicionált táptalaj által kiváltott makrofág-migrációt

Végül annak megállapítására, hogy az LPS-Astro-Med által kiváltott megfigyelt migrációs hatások függenek-e az EBI2-től, a táptalajt kiegészítettük egy EBI2 antagonistával (NIBR189 ref. [30], 10 μM). Kimutatták, hogy az EBI2 antagonista (NIBR189) az oxiszterolok makrofág-migrációra gyakorolt ​​hatásait részben gátolja, jelezve ezzel az EBI2-közvetített jelátvitelt 12. Ennek a korábbi 12 tanulmánynak megfelelően az NIBR189 EBI2 antagonista gátolta a 7α25HC makrofág-migrációra gyakorolt ​​hatását (109,5% +/- 57,9%), amelyet exogén módon az xCELLigence® migrációs rendszer alsó kamrájába vittek. Fontos, hogy az LPS-stimulált asztrocitákból 6 és 8 órán át (LPS-Astro-Med) gyűjtött és EBI2 antagonistával (NIBR189) kiegészített kondicionált táptalaj gyengítette a megfigyelt makrofág-migrációt (4. ábra). Erre a hatásra csökkenő tendenciát figyeltek meg, ami arra utal, hogy az EBI2 részlegesen részt vesz a makrofág migráció szabályozásában (4. ábra). Összességében az adatok arra utalnak, hogy az LPS által stimulált asztrociták indukálhatják a makrofágok migrációját, és emellett az EBI2 szabályozhatja ezt a sejtes áthallást.

A kísérleti beállítás megtalálható az 1. ábrán. Mind a 7α25HC (0,01 μM), mind az asztrocita kondicionált táptalaj, amelyet LPS-sel kezelt asztrocita egerek 6 és 8 órájában kaptak, makrofág migrációt indukált. Az EBI2 antagonista (NIBR189, 10 μM) hozzáadása 7α25HC vagy LPS kezelt egér asztrocita táptalajhoz gyengítette az asztrocita által közvetített táptalaj makrofág migrációra gyakorolt ​​hatását. Az adatokat átlag +/- SEM n = 3, egyirányú ANOVA és Bonferroni utóvizsgálatok formájában mutatjuk be, * p 21 azt mutatta, hogy a Ch25h-hiányos makrofágok gyulladásgátló fenotípussal rendelkeznek, az állatok pedig az EAE lefolyását károsítják, Chalmin és munkatársai 26 azt találta, hogy a Ch25h deléciója jelentősen gyengítette az EAE lefolyását azáltal, hogy korlátozta a patogén CD4 + T-sejtek központi idegrendszerbe történő átvitelét. Kimutatták, hogy az EBI2 jelátviteli út (különösen a receptor és a 7a25HC, valamint metabolikus enzimjei) az elsődleges monocita eredetű makrofágok immunreakciójára is reagálnak 12. Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk az EBI2 jelátvitelt és funkciót egér asztrocitákban, és bemutattuk az EBI2 szerepét az asztrociták és a makrofágok közötti sejtkommunikációban.

Itt azt találtuk, hogy az LPS-re adott válaszként az elsődleges egér asztrociták jelentősen csökkentették az EBI2 mRNS expresszióját. Adataink azt is kimutatták, hogy az egér asztrociták szabályozták a 7a25HC mRNS szintetizáló és lebontó enzimek szintjét az LPS-nek való kitettségre adott válaszként. Csak spekulálhatunk a CYP7B1 és a HSD3B7 viszonylag lassabb ideiglenes aktiválódásának okaira a CH25H aktivációjához képest, amely jelenleg nem tisztázott. Fontos, hogy ezek az adatok összhangban vannak ezen enzimek mRNS-expressziójával az LPS-sel kezelt makrofágokban, ami azt jelzi, hogy a CH25H expresszió két óra múlva csúcsosodik meg, a CYP7B1 mRNS megfigyelhető az LPS kezelési ideje alatt, és a CYP27A1 és HSD3B7 átiratokat két vagy több órán át szabályozzák 12 óra hat óra .

Megállapítottuk, hogy a szintetikus enzimek felpörgetésével az egér asztrocitákkal kezelt táptalajban a LPS kezelést követően a 7a25HC szintek felnövekedtek. Azok a megállapítások, amelyek szerint az LPS megnövelte a 7a25HC szintet az egér asztrocita kondicionált táptalajban, összefüggésben voltak a közeg képességével a makrofág migráció elősegítésére. Megállapítottuk azt is, hogy az LPS-stimulált asztrocitákból származó kondicionált táptalaj makrofág-migrációt indukált, amelyet az EBI2 antagonista NIBR189 részben gyengített. Így úgy tűnik, hogy az EBI2 jelátviteli út (mind a receptor, mind a ligandumszintet szabályozó enzimek) szabályozása asztrocitákban elősegíti a makrofág sejtek migrációját.

Összefoglalva, az adatok arra utalnak, hogy az EBI2 jelátviteli útvonalban lévő molekulák érzékenyek a gyulladásgátló jelekre, és hogy az EBI2 szerepet játszik az asztrociták és a makrofágok közötti kommunikációban.

mód

Sejtkultúra

Minden állatkísérletet az Intézményi Etikai Bizottság hagyott jóvá (Novartis Pharma, Svájc, Bázel és Dublin, Trinity College, Írország). A módszereket a jóváhagyott irányelveknek megfelelően hajtottuk végre. A 27, 28, 29, 30 egér asztrocitákat és az egér makrofág sejteket (RAW264.7) 12 a fent leírtak szerint tenyésztettük. A stimuláció előtt az asztrocitákat 4 órán át szérummentes táptalajban éheztettük. Az asztrocitákat ezután LPS-sel (100 ng/ml, Sigma) kezeltük EBI2 antagonistával vagy anélkül (NIBR189, Novartis) 31 és/vagy 7a25HC (10 mM törzsoldatként előállítva 90% DMSO-ban).

Valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (RT-qPCR)

Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia és tandem tömegspektrometria (UHPLC-MS/MS)

Migrációs tesztek

Az egér makrofágok (RAW264.7) vándorlását 37 ° C-on és 5% CO 2 -on végeztük nedvesített inkubátorban, xCELLigence® által vezérelt migrációs platform (Roche Applied Biosciences) alkalmazásával 16 üreges CIM lemezekkel, a fentiek szerint 22. Röviden, a sejtek migrációját az elektródarendszeren a felső és az alsó kamra között az impedancia növekedésével mérjük. A lemez alsó kamráját asztrocitákkal kezelt vagy szérummentes táptalajjal töltöttük meg, kiegészítve 7α25HC-val (0,01 μM) az NIBR189 EBI2 antagonistával vagy anélkül (10 μM). A sejtmigrációt azonnal rögzítettük a lemez behelyezése és 2 órán át tartó felvétele után.

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Rutkowska, A. és mtsai. Az EBI2 jelátviteli út szerepet játszik az asztrociták és a makrofágok közötti sejt áthallásban. Sci. ismétlés. 6., 25520; doi: 10.1038/srep25520 (2016).

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.