csökkenti

  • elemeket
  • absztrakt
  • A fő
  • az eredmény
  • Ott az egerek zsírtartalmának csökkenését váltotta ki
  • Ott elősegítette az apoptózist és az autofágia kialakulását a zsírszövetben
  • Ott támogatta a ROS gyártását
  • Az antioxidáns megszüntette a Tam által kiváltott ROS-t, az apoptózist és az autofágia
  • Az antioxidáns megfordította a Tam által kiváltott sejtsűrűség és az adipocita populáció csökkenését
  • Az antioxidáns megfordítja a Tamox által indukált down-regulációt a peroxiszóma proliferátorral aktivált gamma receptor (PPARγ)
  • vita
  • Anyagok és metódusok
  • anyagok
  • egerek
  • Sejtkultúra és kezelés
  • ROS mérés
  • Western blottolás
  • Statisztikai elemzések
  • További információ
  • Képfájlok
  • További kép S1
  • További kép S2
  • Word dokumentumok
  • További képmondák
  • szójegyzék

elemeket

  • biokémia
  • Drog terápia
  • Elhízottság

absztrakt

Az elhízás kialakulásának molekuláris mechanizmusának megértése érdekében különféle rágcsáló-modelleket fejlesztettek ki, amelyek a különféle gének funkciójának növekedését vagy elvesztését tanulmányozzák. 6, 7 Ebből a célból a helyspecifikus rekombináns Cre/lox rendszer univerzális volt kondicionált egérmutánsok előállításához, a génexpresszió és a célszövetekben való aktivitás szabályozásához. 8, 9 A tamoxifent (Tam) főleg a Cre rekombinázok térbeli in vivo aktiválására használják intraperitoneális (IP) vagy szubkután beadással. 10, 11, 12 Tam injekció 1-8 mg/testtömeg-kg dózisban 5 egymást követő napon át törli a célgéneket, átfogó rendszert hozva létre az elhízás funkcionális génjeinek tanulmányozására. 8., 9., 10., 11., 12.

az eredmény

Ott az egerek zsírtartalmának csökkenését váltotta ki

A Tam zsírtömegre gyakorolt ​​hatásának tesztelésére Tam (5 mg/20 g testtömeg) 5 napos IP beadását végeztük az O1 villás egereken (Fox01) Cre rekombináz egerek nélkül (f-Fox01), 15, 16, 17 a korábban kialakított szabványos protokoll szerint. Két héttel az alkalmazás után az f-Fox01 egerekben a testzsír 34% -kal csökkent (P 15, 16, és azt tapasztaltuk, hogy a zsírtömeg is szignifikánsan csökkent (26%, P

Az f-Fox01 egerekben csökkent a zsírtömeg. a ) A zsírtömeg-szabályozás kinektikája 5 napos alkalmazás után Tam. ( b ) A testtömeg mérése a Tam (pre-Tam) kezelés előtt, 2 hét (2 hét) és 6 hét (6 hét) a Tam injekció után. ( c ) Epididymális zsírszövet súlya (eWAT) a Tam-kezelt egerekben a 2. héten. ( d ) eWAT-súly a 6. héten Tam-kezelt egerekben. n = 4-6; * P 18, 19, 20, 21, 22, 23 Annak megvizsgálására, hogy a Tam hatással van-e az apoptózisra és az autofágiára, a Tam beadása után a 2. és 6. héten eWAT-ot használtunk, és elemeztük az apoptózis és az autofágok mediátorait - aktivált vagy hasított kaszpáz 3 (Cas3 ). (c)) és egy 3A/1B könnyű láncú fehérje 3A/foszfatidil-etanol-amin konjugátum (LC3). 24., 25. Amint azt a 2a. És b. Ábra mutatja, a Tam kezelés 6-8-szorosára növelte a Cas3 (c) szintjét (P

Ott elősegítette a ROS-t és az oxidatív stresszt. ( a ) A HO1 Western-blot-vizsgálata az egér zsírszövetében a 2. és 6. héten, miután Tam-ot GAPDH-val (gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz) adtunk be terhelés kontrollként. ( b ) a nyugati átviteli képek denzitometrikus elemzése NIH ImageJ szoftver segítségével; n = 6–8. c ) A ROS mérése a zsírszövetben a Tam beadása után 2 héttel (n = 3-4). d ) A ROS mérése a zsírszövetben a 6. héten Tam beadása után (n = 3-4). ** P 32, 33 Amint azt a zsírszövetben megfigyelték, a Tam szignifikáns HO1 felemelkedést váltott ki a 3T3L1 adipocytákban, és a hatás dózistól függött a 0 - 128 μM vizsgálati tartományban (S2 kiegészítő ábra). Öt alkalommal is elősegítette a ROS 2 termelését (P

Az antioxidáns NAC gyengítette a ROS szintjét, és megfordította a hatásokat. a ) ROS mérése 3T3L1 adipocitákban. ( b a c ) Western blot elemzés ( b ) HO, Cas3 (c) és LC3 3T3L1 adipocitákban 48 órás Tam (128 μM) vagy Tam (128 μM) plusz NAC (1 mM) kezelés után, denzitometriás analízissel ( c ) Nyugati átviteli képek az NIH ImageJ szoftver segítségével; A GAPDH-t (glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz) teszteltük terhelés kontrollként. n = 3-5; * P 2 megkérdeztük, hogy a Tam-kezelés befolyásolja-e a sejtsűrűséget. A vivőanyaggal kezelt adipocitákkal összehasonlítva a Tam-kezelt sejtek szignifikáns csökkenést mutattak a sejtek sűrűségében (24%, P 34, 35, 36. Ennek ellenére a RAC-scavenger NAC hozzáadása jelentősen visszaállította a sejtek sűrűségét és az érett adipocita populációt (5c. e).

Az antioxidáns NAC csillapítja a sejtsűrűségre és az érett adipocita populációra gyakorolt ​​hatást. a - c ) hordozóval kezelt 3T3L1 adipociták mikroszkópos képalkotása ( a ), 128 μM Tam ( b ) és Tam (128 μM) plusz NAC (1 mM) ( c ). A mikroszkópot x 100-ra állítottuk. ( d a e ) Az érett adipociták sejtsűrűségének és populációjának mérése NIH ImageJ szoftverrel; n = 6–8. * P 34, 35, 37 Az érett adipocyták csökkent populációjának megfigyelése a Tam-kezelés után arra késztetett minket, hogy elemezzük a Tam PPARγ-ra gyakorolt ​​hatását. Amint a 6a. Ábra mutatja, a Tam-kezelt adipocitákban a PPAR-y fehérje szintje 74% -kal csökkent (P

A mechanizmus, amellyel a Tam csökkenti a zsírtömeget, több sejtes eseményt is magában foglal. Kezelés Megnövekedett apoptózis és autofágia, olyan folyamatok, amelyek csökkentik az adipocita számot és részt vesznek a zsír szabályozásában. 2., 18., 19., 20., 21., 22., 23. Az ott végzett kezelést követően a sejtsűrűség és az érett zsírsejtek populációja valóban csökkent. Ott is elősegítette az adipocita dedifferenciálódást és a ROS termelést, míg a ROS szint normalizálása jelentősen gyengítette a Tam által kiváltott adipocyta dedifferenciálódást, apoptózist és autofágia mellett helyreállította a régi adipocita populációt és zsírtömeget. Adataink együttesen határozottan arra utalnak, hogy a rövid távú (5 napos) Tam-kezelés csökkenti a zsírtömeget azáltal, hogy növeli a ROS-termelést.

Kimutatták, hogy ROS-t és oxidatív stresszt indukál az emlőrákos sejtekben, a hepatoblastoma sejtekben, a retina sejtekben és a vérlemezkékben a NAD (P) H-oxidáz, egy enzim, amely szintén elősegíti a makrofágok ROS-termelését. 32, 42, 43, 44, 45, 46 Az ottani ROS-fokozó hatást kiterjesztette és tovább erősítette az adipocytákon és a zsírszöveteken végzett vizsgálat. Fontos, hogy azt tapasztaltuk, hogy a megnövekedett ROS a PPARγ és az adipocita dediferenciáció down-szabályozását eredményezte, támogatva azt az elképzelést, hogy az érett adipocyták stressz körülmények között dedifferenciálódnak. 34, 35 Kimutatták, hogy a gyulladáscsökkentő adipocitokinek (pl. TNFα) elősegíthetik az adipocita dedifferenciálódást a PPARγ downregulációján keresztül. 34, 35 Mivel az ROS szint növekedése vagy az oxidatív stressz növeli a TNFα termelést, 47 Ez elősegítheti az adipocita dedifferenciálódást az ROS-TNF α - PPAR γ tengely aktiválásával. Ennek érdekében szerepet játszhat a zsírszövetbe történő makrofág infiltráció, mivel kimutatták, hogy ezek a fagociták ROS és TNFα termelését indukálják, valamint érzékenyen reagálnak a ROS és TNFα által közvetített jelátviteli kaszkádokra. 46, 48

Anyagok és metódusok

anyagok

A Dulbecco Eagle (DMEM) táptalaja a Corning Inc. cégtől származott. (Manassas, VA, USA). A szarvasmarha magzati széruma (FBS) a GeneMate-től (Kaysville, UT, USA) származott. A dexametazont, a 3-izobutil-1-metil-xantint (IBMX), a roziglitazont és a Tam-ot a Cayman Chemical-tól (Ann Arbor, MI, USA) szereztük be. A penicillin/sztreptomicin (P/S) a GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories cégtől (Logan, UT, USA) származott. Az inzulin és a NAC Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) származott. A foszfátpuffer (PBS) a Caisson Laboratories, Inc. cégtől származik. (North Logan, UT, USA).

A Foxx1 pelyhes egereket (f-Fox01) és az Irs1/Irs2 kettős phlox egereket (df-Irs) a fent leírtak szerint helyeztük el és helyeztük el. 15, 16, 52 Röviden: az egereket műanyag ketrecekben helyeztük el egy 12 órás világos-sötét fotocikluson, szabad hozzáféréssel a vízhez és rendszeres étrenden. A kezelési kísérletek előtt hím egereket (14-16 hetes korúak) lemértünk, és a zsírtömeget Bruker Minispec LF90 NMR analizátorral (Bruker Optics, Billerica, MA, USA) mértük. Ezután az egereket a Biosafety Room 2-be (BSL2) vittük át, és Tam-ot (1 mg/20 g testtömeg) vagy hordozót (napraforgóolaj) injektáltunk IP injekcióval (naponta egyszer, 5 egymást követő napon). A Tam beadása után a ketreceket 2 naponta cserélték a 2. hétig, amikor az egereket a BSL1 szobába helyezték, és folytatták a testzsír mérését. A kísérleti beállítástól függően az egereket lemértük és feláldoztuk a szövet eltávolítására a folyékony nitrogénben történő gyors fagyasztás céljából a Tam kezelés után 2 vagy 6 héttel. Valamennyi eljárást az NIH irányelvei szabályozták, és a Virginia Tech Intézményi Gondozási és Felhasználási Bizottság hagyta jóvá.

Sejtkultúra és kezelés

ROS mérés

Az adipocitákban és a zsírszövetekben a ROS-t a korábban leírtak szerint mértük, 54, 55, sejtáteresztő festékkel, 5,6-karboxi-2 ', 7'-diklór-fluoreszcein-diacetáttal (karboxi-DCFDA, molekuláris szondák, Grand Island, NY, USA). Azonnal megfagyott zsírszöveteket lemértük és pufferolt tápközegbe (5 mmol/l HEPES PBS-ben) helyeztük át a gyors felolvasztás érdekében, a próba diffúziójának javítása érdekében. Gyors felolvasztás után a táptalajt eldobtuk. A mintákat friss közegben 8 μM karboxi-DCFDA-nak tettük ki, és keverés közben 45 percig 37 ° C-on inkubáltuk. A táptalajt ezután eltávolítottuk, és a mintákat tovább inkubáltuk lízispufferben (0,1% SDS, Tris-HCl, pH 7,4) 15 percig 4 ° C-on. Homogenizálás után a mintákat 16 000 x g-vel 20 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. A felülúszókat összegyűjtöttük, és fluoreszcencia-analízisnek vetettük alá 530 nm-en 485 nm-es gerjesztés mellett, Synergy H4 hibrid multi-módú mikrolemez-olvasóval (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA).

A ROS mérésére 3T3L1 adipocitákban 1-5 × 106 sejtet gyűjtöttünk ki tipissel, és háromszor mossuk hideg PBS-sel, majd inkubáljuk 8 μM karboxi-DCFDA-val friss táptalajban (5 mmol/l HEPES PBS-ben) és 37 ° C-on inkubáljuk. ° C-on 45 percig keverés közben. A táptalajt ezután eltávolítottuk, és a mintákat tovább inkubáltuk PLC lízispufferben: 15, 52 (30 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10% glicerin, 1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10 mM NaPPi, 100 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4) proteáz inhibitor koktéllal (Roche, Branchburg, NJ, USA) és 1 mM PMSF-el kiegészítve 15 percig 4 ° C-on. Homogenizálás után a mintákat centrifugáltuk. 16 000 xg 20 percig 4 ° C-on. A felülúszókat összegyűjtöttük, és fluoreszcencia-analízisnek vetettük alá 530 nm-en 485 nm-es gerjesztés mellett, és az összes fehérjét DC fehérje vizsgálattal (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) hibriddel határoztuk meg. multimódusú mikrolemez-olvasó. Synergy H4 (BioTek) Instruments, Inc.). A ROS-szinteket az egyes sejtek összes fehérjéjére normalizáltuk.

Western blottolás

A szöveti lizátumok előállításához a gyorsan fagyasztott zsírszöveteket megmérjük és homogenizáljuk Bullet Blender (Next Advance, Averill Park, NY, USA) alkalmazásával, PLC lízispufferben, proteáz inhibitor koktéllal (Roche), 1 mM PMSF, 10 μM TSA alkalmazásával. . (Trichostatin A, Selleckchem, Houston, TX, USA) és 5 mM nikotinamid (Alpha Aesar, Ward Hill, MA, USA). 15, 52 Sejtlizátumok esetében a 3T3L1 adipocitákat jéghideg PBS-sel mostuk és Bullet Blenderrel homogenizáltuk. A lizátum összes fehérjekoncentrációját DC fehérje assay (Bio-Rad) alkalmazásával határoztuk meg. Western-blotot és képelemzést a fent leírtak szerint végeztünk. Az antitest katalógusszámok és gyártók a következők: hasított nyúl kaszpáz-3 mAb (9664) és LC3B antitest (# 2775) a Cell Signaling Technology-tól (Beverly, MA, USA); PPAR-gamma antitest (MA5-14889) és GAPDH antitest (MA5-15738) Pierce-től (Rockford, IL, USA) vagy a Thermo Fisher Scientific-tól (Waltham, MA, USA); és HO1 antitest (3391-100) a Biovision cégtől (Milpitas, CA, USA).

Statisztikai elemzések

Valamennyi eredményt átlag ± SD-ként fejezzük ki, és varianciaanalízissel elemezzük a P-értékek meghatározásához; P karboxi-DCFDA

5,6-karboxi-2 ', 7'-diklór-fluoreszcein-diacetát

hasított kaszpáz 3

Irs1/Irs2 egerek kettős nemezeléssel

epididymális fehér zsírszövet

villa doboz O1

FoxO1 lebegett egerek

hem-oxigenáz 1

inzulinreceptor szubsztrát

a 3A/1B könnyűlánc fehérje konjugálása 3-foszfatidil-etanol-aminnal mikrotubulusokkal

a peroxiszóma proliferátor által aktivált gamma receptor