elemeket

absztrakt

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a prenatális élet során számos káros környezeti tényező befolyásolhatja a felnőttkori betegségek (pl. Magas vérnyomás, diabetes mellitus stb.) Kialakulását. 1, 2, 3 Számos prenatális sértés (pl. Nikotin, hipoxia, alacsony fehérjetartalmú étrend stb.) "Beprogramozhat" bizonyos szív- és érrendszeri problémákat, és későbbi életkorban növelheti a szív- és érrendszeri betegségek iránti fogékonyságot. 3, 4, 5, 6 A vemhesség alatti túlzott szacharózfogyasztás kimutatta, hogy elhízáshoz és glükóz-intoleranciához vezet a kölyköknél, valamint mindkét nemnél magas vérnyomásban 1, és patkányoknál inzulinrezisztenciával és hiperglikémiával járhat. A magas szacharóztartalmú étrend (HS) a magzat fejlődésére gyakorolt ​​számos káros hatásért is felelős lehet. A magas méhcukornak kitett utódok hipertóniájának kialakulásához hozzájáruló mechanizmusok azonban nem tisztázottak.

Patkányoknak vemhesség alatt történő beadása során kimutatták, hogy a kaptopril, az angiotenzin-konvertáló enzim inhibitor, megakadályozza az alacsony fehérjetartalmú anyai étrend által programozott magas vérnyomás kialakulását, ami a renin-angiotenzin rendszer (RAS) kulcsfontosságú szerepére utal a fejlődésben. magas vérnyomás. Ezenkívül egy specifikus AT1 receptor (AT1R) antagonista, a losartan kiküszöbölheti a vérnyomás (BP) emelkedését, ami az anyák alacsony fehérjetartalmú étrendi expozíciójából származik patkányokban, ami arra utal, hogy az angiotenzin II (Ang II), a kritikus hormon a szabályozásban A kardiovaszkuláris homeosztázis, fontos szerepet játszik a hipertónia prenatális programozásában. Ebben a tanulmányban a BP és az Ang II-re reagáló nyomást vizsgáltuk a prenatális magas cukornak kitett utódokban.

Az Ang II három fő módon stimulálhatja az érszűkületet: azáltal, hogy felszabadítja a Ca 2+ -ot az intracelluláris raktárakból, a transzmembrán Ca 2+ beáramlásával elsősorban az L-típusú Ca 2+ csatornákon keresztül (Ca a 1,2-ben), és egy vagy több protein-kináz C aktiválásával ( PKC) izoformák. Kimutatták, hogy a PKC növeli az intracelluláris Ca 2+ -ot a Ca-aktiváció révén az 1, 2-ben, ami viszont vazokonstrikciót vált ki. Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy a terhesség alatti túlzott cukorfogyasztás fokozott érválaszhoz vezetett az Ang II-re. 12 White et al. A 13. ábra azt mutatta, hogy a streptozotocin-diabéteszes patkányok mesenterialis artériáinak fokozott érzékenysége az alfa-adrenerg agonistákra jobban függ az extracelluláris kalciumtól. Más laboratóriumok kimutatták, hogy az 1-es típusú cukorbetegség egérmodelljéből származó aorta simaizomsejtek a Ca áram növekedését mutatják 1, 2-nél. Ezért ezt a tanulmányt arra tervezték, hogy megvizsgálják, hogy a PKC/Cao 1.2 út hozzájárul-e az Ang II- mediált nyomásválasz és érszűkület HS utódokban.

mód

A Soochowski Egyetem Állatközpontjának vemhes Sprague-Dawley patkányait kontrollált környezetben, 22 ° C hőmérsékleten, 12 órás világos/sötét ciklus mellett helyeztük el. Véletlenszerűen két csoportra osztották őket: (1) a kontrollcsoportot standard étrenddel etették, és (2) a HS csoportot ugyanazzal az étellel és 20% -os szacharózoldattal látták el a terhesség 1. napjától. csapvíz és szokásos patkányeledel 5 hónapig. Valamennyi eljárást az Állatok gondozásával foglalkozó intézményi bizottság hagyta jóvá, és összhangban voltak a laboratóriumi állatok gondozásával és felhasználásával kapcsolatos kézikönyvvel.

A vércukorszint és a testtömeg mérése

A vemhes patkányokat (a vemhesség 21. napján), valamint a hím felnőtt utódokat 5 hónapos korukban ketamin (75 mg kg-1) és xilazin (10 mg kg-1; Hengrui Medicine, Jiangsu, Kína) keverékével altattuk. intraperitoneálisan adják be. A lefejezés után magzati vérmintákat vettek. Az anya és az utódok vérmintáit a hasi aortából nyertük. A vérmintákat jéghideg, heparint tartalmazó műanyag csövekben vették. A vércukorszintet Nova analizátorral (Nova Biomedical, Waltham, MA, USA) határoztuk meg, és mértük a testtömeget.

BP mérés

Az utódokat katéterrel ültették a femor artériájukba, hogy a BP-t a leírás szerint rögzítsék. 3 napos műtét utáni gyógyulás után a BP-t folyamatosan mértük tudatos és szabadon mozgó patkányokban. Alatti alaplemez után

Az Ang II-t (100 ng kg-1; Sigma, St. Louis, Kalifornia, USA) 0,2 ml sóoldatban intravénásán injektáltuk a katéteren keresztül 60 perc alatt, és a BP-t további 120 percig rögzítettük Power eszközzel. -Lab rendszer és szoftver (AD Instruments, Bella Vista, Új-Dél-Wales, Ausztrália).

Az érrendszeri tónus mérése

A mesenterialis artériák kis szegmenseit (negyedik rendű elágazás) izoláltuk Krebs-Henseleit oldatban (mmol -1: NaCl 115, NaHCO 3 25, KCl 4, 6, NaH 2 PO 4 1, 2, MgCl 2 1, 2, CaCl 2 2, 5 és 10 glükóz). pH = 7, 4 és multimográfiai rendszerbe (Danish Myo Technology, Közép-Jylland, Dánia) szereltük fel, oxigénezett Krebs-Henseleit oldatban (95% O 2, 5% CO 2) 37 ° C-on tartva. 17, 18 Kiegyenlítés után 60 perc múlva a gyűrűk vaszkulárisan kumulatívan növekvő Ang II koncentrációval (10-11-10-5 mol-1) összehúzódtak. Losartán (AT1R antagonista, 10 μmol l -1), 19 PD123319 (AT2R antagonista, 10 μmol l -1), 19 GF109203X (PKC antagonista, 1 μmol l -1) 20 vagy nifedipin (Cav 1, 2, 10 μmol l antagonista ) - 1) 21-et alkalmaztunk a szegmensek előkezelésére 30 percig, mielőtt az Ang II-t felvittük volna. A PKC aktivátor, a forbol 12, a 13-dibutirát (PDBu, 10 - 9 - 10 - 5 l - 1) vagy a KCl (20 - 140 mmol l - 1) kumulatív koncentráció-válasz görbéit végeztük mind nifedipin hiányában, mind annak jelenlétében. a mesenterialis artériákban. Az ér tónusát a 60 mmol-1 KCl által kiváltott maximális összehúzódás vagy az ér egy adott agonistára adott maximális válasza normalizálta. Mindegyik edényt csak egyszer használták fel. A jeleket Power-Lab rendszer segítségével rögzítettük, az 5. ábra szoftverével (AD Instruments, Castle Hill, NSW, Ausztrália).

Vaszkuláris miociták izolálása

A myocytákat enzimatikusan izoláltuk külön mesenterialis artériákból. 22 edényt 1 mm-es csíkokra vágtunk jéghideg oldatban (PSS), amely (mmol-1) 137 NaCl, 5,6 KCl, 1 MgCl 2, 0,42 Na 2 HPO 4, 0,44 NaH 2 PO 4, 4,2 NaHCO 3 és 10 HEPES tartalmú volt. (pH 7, 4). Minden enzimoldat 1 mg ml-1 szarvasmarha-szérum albumint tartalmazott. Az izolált vaszkuláris simaizomsejteket PSS-ben enyhe eldörzsöléssel kaptuk. A sejteket 6 órán át 4 ° C-on tároltuk vizsgálat céljából.

Elektrofiziológiai mérés

A miocitákat közvetlenül a kísérleti kamra aljára helyeztük, és invertált mikroszkóp segítségével (OLYMPUS CKX41, Tokió, Japán) vizualizáltuk. A sejteket fürdőoldattal mossuk a szennyeződések eltávolítása céljából. A tapasz pipettákat vékony falú üvegkapillárisokból húztuk mikropipetta-sztriptíz eltávolítóval (Model P-30, Sutter Instruments, Novato, CA, USA). A tapasz pipetta hegyének ellenállása 3 x 4 MΩ volt, amikor megtöltötte a pipetta belső oldatával.

A teljes cellás feszültségbilincset egy számítógép által vezérelt áram- és feszültségszorító rendszer (Multiclamp 700B, Digidata 1440, Axon Instruments, Foster City, CA, USA) segítségével, Clampex 10.1 és Multiclamp Commander 1 segítségével hajtották végre. Pipetta eltolás és teljes cellás rendszer a kapacitást elektronikusan kompenzálták. A sejtmembránpotenciált rés nélküli módban, az egész cella áram-szorító konfigurációban mértük, és a teljes cella áramot epizodikus stimulációs módban, az egész cella feszültség-szorító konfigurációban, Axonpatch 700B és Clampex 10.1 erősítő segítségével. a sejtáramokat sejtkapacitással normalizáltuk az áramsűrűség elérése érdekében.

Western blot elemzés

A PKC α, δ és Cav 1,2 α1 alegység fehérjék jelenlétét a mesenterialis artériákban Western-blot analízissel mértük β-aktinná normalizálva. Elsődleges antitestek 23, 24 voltak kecske poliklonális antitestjei (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) az 1,2 és 1 c-alegységben (1: 200) lévő Ca alegységek ellen, a nyúl poliklonális antitestek (Santa Cruz Biotechnology) a PKCa ellen (1: 200) vagy PKCδ (1: 200). A másodlagos antitest szamár kecskeellenes antitest volt (1: 4000) vagy kecske nyúlellenes antitest (1: 4000; Beyotime Biotechnology, Jiangsu, Kína). Az immunszignálokat kemilumineszcencia detektálással (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) és UVP képalkotó rendszerrel (EC3-Imaging-System, Upland, CA, USA) tettük láthatóvá. A képi jeleket digitalizáltuk és elemeztük, majd a β-aktin sávintenzitási arányát kaptuk a relatív fehérje expresszió szintjének számszerűsítéséhez.

Elemzés és statisztika

Az adatokat átlag ± sem jelként fejeztük ki (P

terhesség

( a ) Ang II által közvetített nyomásreakciók utódokban. Nyíl: intravénás Ang II injekciós idő. Kontroll (n = 10 az öt gátból), HS: magas szacharóz (n = 12 az öt gátból). ( b ) Ang II által közvetített érszűkület az utódok mesenterialis artériáiban (n = 5, mindegyik csoport). ( c, d ) a losartan vagy a PD123319 hatása az Ang II által közvetített érszűkületre az utódok mesenterialis artériáiban (n = 5, mindegyik csoport). * P

( a, b ) A GF109203X vagy a nifedipin hatása az utódok mesenterialis artériáinak Ang II által közvetített érszűkületére (n = 5, mindegyik csoport). ( c, d ), A PDBu és a KCl által kiváltott érszűkület nifedipin hiányában és jelenlétében az utódok mesenterialis artériáiban (n = 5, mindegyik csoport). Data v d az edény KCl-ra adott maximális válaszának százalékában fejezzük ki. * P # P

( a, b ) a kontroll és a HS sejtekből felvett Cao 1.2 áramok reprezentatív nyomai. ( c ) Az I - V grafikonok +10 mV és +50 mV közötti megnövekedett belső áramot mutattak a HS sejtekben (n = 20) a kontrollhoz képest (n = 25). * P 0, 05). A V1/2 inaktiválása -9,00 ± 1,29 mV-nál történt a kontrollnál és -6,24 ± 1,13 mV-nál a HS-sejteknél (P> 0,05). Nem volt szignifikáns különbség a kontroll és a HS sejtek között a Ca aktiváció és inaktiválás feszültségfüggőségében az 1.2-ben (4. ábra).

( a, b ) Tipikus inaktivációs áramok, amelyeket +20 mV lépésekben kapunk 200 ms-ig, az 1000 ms -60-tól +60 mV-ig terjedő kondicionáló potenciálok sorozatának alkalmazása után. ( c ) A Ca-áramok aktiválási görbéinek feszültségfüggése 1, 2-ben a kontroll (n = 15) és a HS cellákban (n = 11) (G, vezetőképesség; Gmax, maximális vezetőképesség). ( d ) A Ca áramok inaktivációs görbéinek feszültségfüggése 1-ben, 2-ben a kontrollcsoportokban (n = 22) és a HS-ben (n = 19) (I, áram; I max, maximális áram). Az aktivációs áramok reprezentatív nyomait a 3. ábra mutatja ( a ) ( b ).

Teljes méretű kép

A PKC a, 5 izoformák, valamint a Cao 1,2 és 1 c expresszió mesenterialis artériákban

A Western blot analízis nem mutatott szignifikáns különbséget az α1c Cao 1.2 alegységek és a PKC8 izoform expressziós szintjeiben a mesenterialis artériákban a HS és a kontroll csoport között. A PKCα izoform magasabb expresszióját detektáltuk HS utódokban (5. ábra).

A PKC a, 8 izoformák, valamint a Cao 1.2 és 1 c alegységek expressziója az utód mesenterialis artériáiban (n = 5, mindegyik csoport). * A P 9, 25 és az 1,2-es PKC/Ca kritikus fontosságú az érösszehúzó és nyomásreakciókban. Az Ang II az AT1R-hez kötődve aktiválja a foszfolipáz C-t, majd a membrán-foszfoinozidokat diacil-glicerinné hidrolizálja a PKC aktiválásához. 26, 27 A PKC a 28. foszforilezéssel vagy a BK-csatornák gátlásával a membránpotenciál megváltoztatásával aktiválhatja a Cav 1.2-t. A Ca aktiválása 1,2-ben extracelluláris Ca 2+ beáramláshoz és érszűkülethez vezethet.

A terhesség alatti túlzott cukorfogyasztás az AT1R túlzott mértékű expressziójához vezethet az utódokban. Ebben a tanulmányban a losartan, egy specifikus AT1R antagonista, eltörölte a fokozott vaszkuláris választ az Ang II-re a HS csoportban, míg az AT2R blokkoló PD123319 nem mutatott szignifikáns hatást az Ang II által közvetített összehúzódásokra, ami arra utal, hogy az AT1R, nem az AT2R, közvetítette az Ang II-t. fokozott érszűkület és nyomásreakció HS utódokban. A magas cukortartalmú étrend terhesség alatt megváltoztathatja a vér és a hormon szintjét, beleértve a glükóz és az inzulin szintjét. Ismert kölcsönhatások vannak a RAS és más, a glükóz homeosztázissal összefüggő endokrin rendszerek között. Egy korábbi tanulmányban a hiperglikémia szabályozta az Ang II szintéziséhez és működéséhez szükséges RAS-összetevőket, amelyek hozzájárulhatnak a metabolikus szindrómához társuló magas vérnyomáshoz. Ezért ésszerű azt sugallni, hogy a prenatális cukor túladagolása után bekövetkező biokémiai és endokrin változások változást okozhatnak az utódok RAS-ában. Megállapítottuk azt is, hogy a GF109203X elnyomja az Ang II-vel fokozott érszűkületet, ami arra utal, hogy a fokozott PKC funkciók szerepet játszanak az Ang II által stimulált vazokonstrikció anginokonstrikciójában a HS utódokban. Az Ang II útvonal feletti komponenseként a túlzottan expresszált AT1R hozzájárulhat a PKC javulásához.

A gestációs diabetes mellitus a korai szöveti organogenezisben fokozott aktivitáshoz és számos PKC izoformának megnövekedett eloszlásához vezethet, a hiperglikémia pedig növelheti a PKC aktivitását különféle in vitro kérdésekben. A patkány mesenterialis artériáiban a PKC 32, 33, 34 izoformáit, köztük PKCα, PKCγ, PKC8, PKCɛ és PKCζ detektáltuk. Úgy tűnik, hogy csak az α és a δ izoformák vesznek részt a PDBu által kiváltott érszűkületben. A PKCa fokozhatja a Ca 2+ -függő sejtösszehúzódást, és túlexpressziója magas vérnyomással jár. Ez a tanulmány a PKCα és a PKCδ expresszióját mérte annak megállapítására, hogy részt vesznek-e a PKC javult működésében. Ezenkívül PDBu-t használtunk a PKC aktivitás tesztelésére. A HS utódokban a PKCα, nem pedig a PKCα túlexpresszióját találták. A mai napig kimutatták, hogy a prenatális hypoxia a PKCɛ gén epigenetikai programozását indukálja a patkány szívében. Így az epigenetikus tényezők lehetnek a PKCα változásának egyik alapvető mechanizmusa, egy olyan terület, amely további vizsgálatot érdemel. A PDBu nagyobb érszűkületet produkált a HS utódokban. Ezenkívül a nifedipin megfordította a PDB által fokozott érszűkületet, ami arra utal, hogy a megváltozott PKC/Cao 1.2 útvonal hozzájárulhat az Ang II által fokozott érrendszeri tónushoz.

Összegzésképpen elmondható, hogy a mikrohajókkal és sejtekkel végzett kísérletek potenciális útvonalakat javasolnak, amelyek összefüggésben lehetnek a megnövekedett PKC/Ca útaktivitással az 1.2-ben, és az AT1R, a PKCa és a Ca változásai az 1.2-ben. Ezek a megfigyelések új betekintést nyújthatnak az Ang II-vel fokozott válasz és az érrendszeri tónus alapjául szolgáló mechanizmusokba a prenatálisan magas cukornak kitett utódokban. Ez az információ fontos hozzájárulás a szív- és érrendszeri betegségek méhbe programozott korai megelőzésének vagy kezelésének megértéséhez .