természetes

  • elemeket
  • absztrakt
  • Háttér:
  • mód:
  • az eredmények:
  • következtetés:
  • A fő
  • az eredmény
  • NK sejtpopuláció mérete
  • Az intellin-2 mRNS expressziója PBMC-ből izolált NK sejtekben
  • Az NK-sejtek citotoxicitása
  • NK-sejtekkel társult gének expressziója PBMC-ből izolált NK-sejtekben
  • vita
  • mód
  • vegyszerek
  • BLF
  • Táplálkozási kezelés és állatprotokoll
  • Mintavétel
  • PBMC izolálás
  • A sejtek teljes izolálása a léptől és az MLN-től
  • NK-sejtek izolálása és fenotípusos azonosítás a tisztaság érdekében
  • NK sejt-citotoxicitási teszt áramlási citometriával
  • A mononukleáris sejtek fenotípusos azonosítása a vérből, valamint az MLN és a lép sejtjeiből
  • NK sejt gén expresszió
  • Statisztikai analízis
  • Nyilatkozat a pénzügyi támogatásról
  • közzététel
  • További információ
  • Powerpoint fájlok
  • Kiegészítő S1 ábra.

elemeket

absztrakt

Háttér:

A természetes gyilkos (NK) sejtek a veleszületett immunvédelmi rendszer részét képezik, és azok szintje csecsemők és csecsemők között változik (FF). A laktoferrin (Lf) ex vivo modulálja az NK sejtek citotoxicitását. Feltételeztük, hogy az étkezési szarvasmarha Lf (bLf) növeli az NK sejtpopulációt és a citotoxicitást.

mód:

A malacokat 21 napon keresztül kocával (SR), FF vagy 1 g/l bLf (LF) neveltük. A vér NK sejtjeit (CD3 - CD4 - CD8 +) (perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC)), a lépet és a mesenterialis nyirokcsomót (MLN) áramlási citometriával határoztuk meg. NKMC-k A PBMC-ket citotoxikus aktivitásra teszteltük a K562 célsejtekkel szemben ex vivo tápközeg (stimulálatlan), interleukin-2 vagy bLf jelenlétében. Az NK sejt mRNS expresszióját reverz transzkripció-kvantitatív PCR-rel határoztuk meg.

az eredmények:

Az SR és LF malacokban több NK-sejt volt az MLN-ben (P = 0,0097) és a lépben (P = 0,0980), mint az FF malacokban. PBMC-ben az SR malacok több NK-sejtet tartalmaztak, mint az FF malacok (P = 0,0072); Az LF malacok közepes méretűek voltak, és nem különböztek az FF vagy SR malacoktól. Az intellin-2 mRNS expressziója NK sejtekben 2,5-szer nagyobb (P = 0,0095) volt LF-ben, mint SR vagy FF malacokban. A Szlovák Köztársaság malacainak NK-sejtjei magasabbak voltak (P

Az intellektin-2 mRNS-mennyisége magasabb volt 21 d d-es bLf-vel táplált malacok természetes gyilkos sejtjeiben (LF, n = 3), mint kocákon (SR, n = 7) vagy táplált tápszerekben (FF, n = 6) )) az állatok. Az intellin-2 normalizált értékeit úgy számítottuk ki, hogy a célmennyiség átlagát elosztottuk a referenciagén (peptidilprolil-izomeráz A) átlagos mennyiségével. Minden méréshez kiszámítottuk a különbség többszörösét úgy, hogy a normalizált célértékeket elosztottuk a sertések FF átlagos normalizált célértékével. Az adatokat az FF állatokhoz viszonyított különbség átlagának ± SD szorzataként fejezzük ki. * P

21 napos tenyésztett kocákból izolált természetes gyilkos (NK) sejtek citotoxicitása (SR; n = 11; fekete), táplált tápszer (FF; n = 14; fehér) és bLf táplált (LF; n = 11; szürke) malacok. A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) az NK sejteket vagy nem stimuláltuk (Unst), vagy stimuláltuk interleukin-2-vel (IL-2) (20 ng/ml) vagy Lf (25 μg/ml), és 48 órán át inkubáltuk DiOC18-jelölt K562-vel. célsejtek a hatások és a célsejtek arányában 10: 1. Az inkubáció végén propidium-jodidot (PI) adtunk az elhalt sejtek megjelöléséhez. A citotoxicitást elölt célsejtekként (PI + DiOC 18 +) jelentik az összes célsejt százalékában (DiOC 18 +). Az adatokat átlag ± SD-ként fejezzük ki. A teljes proc generalizált lineáris modell (GLM) modell, a P † jelentős különbségeket képvisel az étrendek között. bLf, szarvasmarha-laktoferrin.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

NK-sejtekkel társult gének expressziója PBMC-ből izolált NK-sejtekben

Az FF és LF állatokból származó NK-sejtek citotoxikus aktivitásának csökkentését elősegítő lehetséges molekuláris mechanizmusok azonosítása érdekében reverz transzkripciós-kvantitatív PCR-t hajtottunk végre stimulálatlan perifériás vér CD3 - CD4 - CD8 + NK sejtekből kivont RNS-en ( 3. kép. ). Az NK-sejtek effektor molekulája, a perforin mRNS feleslege háromszor, illetve hatszor alacsonyabb volt az FF és az LF malacok NK sejtjeiben, mint az SR malacok mRNS-ében (P = 0,0038, 3a. Ábra ). Ezenkívül a D2 receptor expressziója a 2. csoport NK2-tagjai (NKG2D), az NK-sejteken található aktiváló receptor és az 1. típusú Killer lektinsejtek (KLRK1) K-alcsoport 1-es receptorai néven ismert, 3,5-szer alacsonyabb volt a Az FF állatok NK sejtjei, mint az SR állatokban, míg az NKG2D receptor gén expressziója az LF állatok NK sejtjeiben mérsékelt volt, és nem különbözött szignifikánsan egyik csoporttól sem ( 3b. Ábra ).

D-felesleges (NKG2D) perforin receptor ( a ) és az NK 2. csoportjának tagja ( b ) mRNS-bőség a 21-d éves kocákból (SR, n = 7), tápszerrel (FF, n = 4) -5) és bLf-vel táplált malacokban (LF, n = 3) izolált természetes gyilkos sejtekben. A célgének normalizált értékeit úgy számítottuk ki, hogy a célmennyiség átlagát elosztottuk a referenciagén átlagos mennyiségével. Minden méréshez kiszámítottuk a különbség többszörösét úgy, hogy a normalizált célértékeket elosztottuk a sertések FF átlagos normalizált célértékével. Az adatokat átlag ± SD-ként fejezzük ki. Különböző szubindexek (*, †, ‡) szignifikáns különbségeket jeleznek a P-CD4 - CD8 + -okban, amelyeket ebben a vizsgálatban alacsony CD56-szint esetén alkalmaztak. CD16 + NK sejtek populációja emberekben, amelyek citotoxikus aktivitást és interferon-y termelést mutatnak.

A számos NK-sejtfunkciót kiértékelő jövőbeni kísérletek meg fogják deríteni, hogy az FF malacok NK-sejtjeinek csökkent-e az effektor funkciója, rossz a stimulációra adott válasza vagy aktívan elnyomják-e a citotoxicitást. Például a granzim, perforin vagy y-interferon termelésének mérése a receptor keresztkötésére adott válaszként vagy az NKG2D-re monoklonális antitestek alkalmazásával meghatározhatja, hogy a stimulációra adott sejtes válaszok eltérnek-e. Ezeknek a fehérjéknek az expresszióját áramlási citometriával, enzimmel kapcsolt immunszorbens foltvizsgálattal vagy enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálattal mérhetjük. Az ilyen kezelés utáni kalcium fluxus mérése azt is meghatározná, hogy a különböző kezelési csoportok malacainak NK sejtjei képesek-e egyformán reagálni a szignál transzdukciós útvonalakon keresztüli stimulációra. Az apoptózis közvetítője, a Fas sejtfelület csökkent expressziója csökkent effektor kapacitású sejteket jelez. Az újszülöttek étrendjének hatására az NK-sejtek működésének speciális szakaszának ismerete lehetővé teheti a megfelelő beavatkozások megtervezését. Ezért az ebben a dokumentumban tett megfigyelések alapján ezt a kutatási sort folytatni kell.

Összességében a diéta jelentős hatással volt az NK-sejtek populációjára és aktivitására. Az anyatejjel táplált malacoknak nagyobb volt az NK-sejtek populációja a vérben és az immunszövetekben, és nagyobb volt a citotoxikus aktivitásuk (PBMC), összehasonlítva az olyan malacokkal, amelyek FF-ek voltak. A bLf NK-sejtek fejlődésére gyakorolt ​​általános hatása azonban ebben a vizsgálatban nem volt meggyőző. Az étrendi bLf-kiegészítés nem növelte az NK-sejtek citotoxicitását; az a tény azonban, hogy az LF malacokban nagyobb a perifériás vér NK sejtjeinek száma megnövekedett LfR expresszióval, potenciálisan javíthatja az újszülött immunvédelmét. Ezenkívül a bLf-kiegészítés több mint 21 napig hatékonyabb lehet a veleszületett immunválasz fokozásában ezeknél az állatoknál, mivel az ebben a vizsgálatban alkalmazott dózis (1 g/l) az emberi anyatej (

2,1 g/l). Ezért jövőbeli vizsgálatokra van szükség annak megállapításához, hogy a bLf immunszabályozó funkciója az NK-sejtek aktivitására függ-e egy adott feltételrendszertől, azaz a patogén ingertől, az életkortól vagy a fajtól. Mivel az NK-sejtek fontos első védelmi vonalat jelentenek a fertőzéssel szemben, a számukat növelő és gyilkolási képességüket javító tényezők megértése lehetővé teheti számunkra, hogy táplálkozási eszközökkel jobban megvédjük az FF-gyermekeket a fertőzéstől.

mód

vegyszerek

Minden vegyszert a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO) vásároltunk, hacsak másképp nem jelezzük.

Porított bLf-t (98% -os tisztaság) a DMV International-től (FrieslandCampina, Hollandia) nyertünk. Az összes vastartalom 120 mg/kg por volt, ami 11,9% -os telítettséget jelentene, ha az összes vas kötődne a bLF-hez. A bLf-t kétszer desztillált ioncserélt vízben 100 g/l koncentrációra állítottuk elő. A készítmény előállítása során 10 ml ezt az oldatot hozzáadtuk a készítmény 1 l-jéhez 1 g/l bLf végkoncentrációig.

Táplálkozási kezelés és állatprotokoll

Mintavétel

A szülés utáni 21. napon a malacokat Telazol intramuszkuláris injekcióval (7 mg/testtömeg-kg; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA) injektáltuk, és a vért intrakardiális szúrás útján heparint tartalmazó vákuumcsövekbe vettük (BD Biosciences, San Jose, CA) a PBMC-k elkülönítésére. A malacokat ezután nátrium-pentobarbitál intrakardiális injekciójával (72 mg/testtömeg-kg, Fatal Plus; Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI) feláldoztuk. Eutanázia után lép- és MLN-mintákat vettünk a teljes sejtszigetelés érdekében.

PBMC izolálás

A vért 2: 1 arányban hígítottuk RPMI-1640-gyel (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY), Ficoll-Paque Plus-ra (GE Healthcare, Piscataway, NJ) rétegeztük és 400 g-vel 40 percig 20 ° C-on centrifugáltuk. PBMC-ket a gradiens felületről gyűjtötték. A vörösvértesteket lizáló puffer (0,15 M NH4CI, 10 mmol/l KHCO 3 és 0,1 mmol/l Na 2 EDTA) alkalmazásával lizáltuk. A PBMC-ket ezután háromszor mostuk Hank pufferolt sóoldatából (nem Ca 2+, Mg 2+ (HBSS; Invitrogen, Gibco)), amely 2% BSA-val, 1 mmol/l Na 2 EDTA-val, 50 μg/ml gentamicinnel volt kiegészítve. (Invitrogen, Gibco), 1000 E/ml penicillin és 100 μg/ml sztreptomicin). A PBMC-ket teljes RPMI-1640-ben (10% FBS, 2 mmol/l glutamin, 50 μg/ml gentamicin, 1 mmol/l nátrium-piruvát, 20 mmol/l HEPES (Invitrogen, Gibco), 1000 U/ml penicillin és 100%) szuszpendáltuk. μg/ml sztreptomicin). Az életképes sejtek számát tripánkék festés után (Invitrogen, Gibco) határoztuk meg. Ezután a sejteket fenotipizáljuk és áramlási citometriával kvantitatív módon meghatározzuk, vagy az NK-sejtek izolálására használjuk az alábbiakban leírtak szerint.

A sejtek teljes izolálása a léptől és az MLN-től

A lép- és az MLN-mintákat összegyűjtöttük és jégen tároltuk antibiotikum-gyűjtő pufferben a feldolgozásig. A szöveteket háromszor mostuk (PBS (Invitrogen, Gibco), 50 μg/ml gentamicin, 1000 U/ml penicillin és 100 μg/ml streptomicin). A megmosott szöveteket C-csövekbe (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) helyeztük 10 ml Hank pufferolt sóoldatával, és finom MACS (Miltenyi Biotec) alkalmazásával aprítottuk fel. A kapott sejtoldatokat 100 μm-en (BD Falcon, San Jose, CA) átmossuk, majd egy 40 μm-es membránszűrővel (BD Falcon). A vörösvértestek lízise után az izolált sejteket háromszor mossuk mosópufferben, és szuszpendáljuk a teljes RPMI-1640-ben. Az életképes sejtek számát tripánkék festés után (Invitrogen, Gibco) határoztuk meg. A sejteket ezután áramlási citometriával fenotipizáljuk az alábbiakban leírtak szerint.

NK-sejtek izolálása és fenotípusos azonosítás a tisztaság érdekében

NK sejt-citotoxicitási teszt áramlási citometriával

A mononukleáris sejtek fenotípusos azonosítása a vérből, valamint az MLN és a lép sejtjeiből

A perifériás vér, az MLN és a lép NK sejt fenotípusait áramlási citometriával követtük fluoreszcensen jelölt monoklonális antitestek paneljének felhasználásával. Az NK-sejteket egér anti-pig CD3: PECγ5 (Southern Biotech), egér anti-pig CD4: FITC (Southern Biotech) és egér anti-pig CD8: PE (Southern Biotech) alkalmazásával azonosítottuk. Az összes festési eljárást jégen hajtották végre, és különös gondot fordítottak a fény szükségtelen kitettségének elkerülésére. Röviden: lyukanként egymillió sejtet blokkoltunk 5 μg/ml jelöletlen anti-CD16 (G7 klón; AbD Serotec, Raleigh, NC) és 5% egérszérum (Southern Biotech) keverékével, hogy megakadályozzuk az antitestek nem specifikus kötődését a sejtek. Anti-CD3, anti-CD4 és anti-CD8 antitesteket adunk a lyukakhoz, 15 percig inkubáljuk, centrifugáljuk, majd a felülúszót leszívjuk. A sejteket kétszer mossuk festőpufferrel (PBS, nincs Ca 2+, nincs Mg 2+, 0,1% nátrium-azid és 1% BSA (Invitrogen, Gibco)), majd 2% paraformaldehiddel rögzítjük. A festést LSRII áramlási citométerrel (BD Biosciences) értékeltük. Az NK sejtpopuláció relatív százalékát FlowJo szoftverrel (7.0 verzió, FlowJo; TreeStar) határoztuk meg. Az NK sejteket CD3 - CD4 - CD8 + eseményként azonosítottuk (30), és a CD3 események százalékában fejezzük ki.

NK sejt gén expresszió

A teljes RNS-t extraháltuk és a PBMC-ből izolált NK-sejtekből TRIzole reagenssel (Invitrogen, Grand Island, NY) tisztítottuk a gyártó protokollja szerint. Az RNS-t spektrofotometriásán, Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL) alkalmazásával számítottuk 260 nm-en. Összesen 10 millió NK-sejtet alkalmaztunk az extrakcióhoz és biztosítottuk

800 - 1000 ng/μl RNS. Az RNS-koncentrációt RNáz-mentes vízzel (Invitrogen) 0,25 μg/ml-re állítottuk be, és az RNS minőségét Bioanalyzer (Model 2100; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) alkalmazásával elemeztük az Illinois-i Egyetem WM Keck Központjában. Valamennyi minta RNS-integritási száma> 6 volt.

A reverz transzkripciót Eppendorf Thermal Cycler (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) alkalmazásával hajtottuk végre. Minden reakció 3 μg teljes RNS-t és 10 μl nagy áteresztőképességű cDNS reverz transzkripciós készlet (Applied Biosystems, Foster City, CA) keverékét tartalmazta, amely 100 mmol/l dezoxiribonukleotid-trifoszfátot (dNTP), 10X RT puffert, 10X RT random primereket tartalmazott., MultiScribe Reverse Transcript RNSse inhibitor és dietil-pirokarbonát (DEPC) -kezelt víz (Invitrogen) 20 μl végtérfogatban.

Valós idejű kvantitatív PCR-t hajtottunk végre az ITLN-2 (Ss03374218_m1), a KLRK1 (NKG2DR; Ss03394782_g1) és a perforin (Ss03373694_m1), valamint a peptidilprolil-izomeráz A (Ss03392377_m1) Taqlied PCR Bios alkalmazásával. A mintákat futtatásonként összesen 40 amplifikációs ciklusnak vetettük alá, és a fluoreszcencia intenzitását Taqman ABI 7900 géppel (Applied Biosystems) detektáltuk. Peptidilprolil-izomerázt A alkalmaztunk referenciagénként (31). Az eredményeket a relatív standard görbe módszerrel fejeztük ki. Röviden, soros hígításokat (1: 5 és 1:15, 625 között) készítettünk sertés NK sejt cDNS törzséből, és mindegyik lemezen futtattuk őket. Mindegyik mintát primerekkel három példányban futtattuk a célgén és a peptidilprolil-izomeráz A értékelése céljából. Az egyes célpontok normalizált értékeit úgy számítottuk ki, hogy a célmennyiség átlagát elosztottuk a peptidilprolil-izomeráz A mennyiségi átlagával. Az egyes méréseknél a különbség számításakor kiszámítottuk a normalizált célértékeket a normalizált kalibrátor mintával (ebben az esetben az FF csoport átlagával). A statisztikai különbségek szempontjából tesztelt összes mintát ugyanazon a lemezen futtattuk.

Statisztikai analízis

Az adatokat a Proc általánosított lineáris modelljével elemeztük az SAS-ban (9.2-es verzió; SAS Institute, Cary, NC). Az NK sejtpopuláció és a génexpressziós elemzések modellje diétát tartalmazott fő hatásként. Az NK sejtek citotoxicitásának modellje az étrend, a kezelés és az étrend × kezelés interakció hatását tartalmazta. Az adatok normális eloszlását a SAS-ban végzett normalitási teszt megerősítette, és a ≥0,75 Shapiro-Wilk-szám azt mutatta, hogy az értékek normálisan eloszlottak. Az adatokat átlag ± SD értékként adjuk meg. Összehasonlítások P-vel