aktivitás

  • absztrakt
  • a cél:
  • mód:
  • az eredmények:
  • következtetés:
  • bevezetés
  • Anyagok és metódusok
  • Állatok és kísérleti tervezés
  • Szövetgyűjtés és feldolgozás
  • Biokémiai elemzés
  • Szövettani és immunhisztokémiai festés
  • In situ TdT-közvetített dUTP-vizsgálatok az N-terminális jelöléshez
  • Western blotok
  • Statisztikai analízis
  • az eredmény
  • A TLR2 aktivitás blokkolása csökkenti és stabilizálja az érelmeszesedést a brachiocephalicus artériában
  • A TLR2 blokk enyhíti az érelmeszesedéses artériák gyulladását
  • A TLR2 blokád csökkenti a makrofág apoptózist és a CHOP expressziót előrehaladott érelmeszesedésben
  • A TLR2 közvetíti a felgyorsult érelmeszesedést és szabályozza a CHOP expressziót és az apoptózist ApoE-hiányos egerekben, akiknek HC-étrendjük van.
  • vita
  • A szerző közreműködése

absztrakt

Az autópálya-szerű receptor 2 (TLR2) szignalizáció döntő szerepet játszik az érelmeszesedés megindulásában. A tanulmány célja annak megvizsgálása volt, hogy a TLR2 aktivitás blokkolásának van-e terápiás hatása az előrehaladott érelmeszesedésre.

mód:

Negyven hét apolipoprotein E-hiányt (ApoE -/-), amelyet normál étrenddel tápláltak, intravénásán injektáltak TLR2-semlegesítő antitesttel vagy izotípushoz illeszkedő IgG-vel 18 hétig. A kettős kiütésű ApoE -/- Tlr2 -/- egereket pozitív kontrollnak tekintettük. A kezelés végén megmértük a plazma lipidszintjét, és elemeztük a plakk morfológiáját, a gyulladáscsökkentő citokin expressziót és az artériás apoptózist. A vizsgálat második részében a hathetes ApoE -/- és ApoE -/- Tlr2 -/- egereket 12–24 hétig magas koleszterinszinttel táplált egerekben vizsgálták a TLR2 és az apoptotikus markerek expressziós szintjeire. artériák.

az eredmények:

A TLR2 aktivitás TLR2 semlegesítő antitesttel történő blokkolása vagy a Tlr2 gén kiiktatása nem változtatta meg a plazma lipidszintjét az ApoE// - egerekben. A farmakológiai és genetikai manipulációk azonban jelentősen csökkentették a plakk méretét és az érszűkületet, és fokozták a plakk stabilitását a brachiocephalic artériákban. A TLR2 antagonizmus védőhatásai az IL-6 és TNF-α gyulladásgátló citokinek elnyomott expressziójával és az NF-κB és Stat3 transzkripciós faktorok inaktiválásával társultak. Ezenkívül a TLR2 aktivitás blokkolása gyengítette az ER stressz által kiváltott makrofág apoptózist a brachiocephalikus artériákban, ami elősegítheti a nekrotikus magok differenciálódását előrehaladott érelmeszesedésben. Ezenkívül a magas koleszterinszintű étrend jelentősen felgyorsította az ateroszklerotikus termelést, és fokozta a proapoptotikus fehérje PDO és az apoptózis expresszióját ApoE -/- egerekben, mint ApoE -/- Tlr2 -/- egerekben.

következtetés:

A TLR2 aktivitás farmakológiai vagy genetikai blokádja csökkenti és stabilizálja az előrehaladott érelmeszesedést az ApoE -/- egerekben. Így a TLR2 jelátvitel megcélzása ígéretes terápiás stratégia lehet az előrehaladott érelmeszesedés ellen.

Az érelmeszesedés a szív- és érrendszeri betegségek gyakori oka. A szív- és érrendszeri betegségek a halálozás legfőbb okai, és világszerte egyre nagyobb veszélyt jelentenek az emberi egészségre 1 Az epidemiológiai és kísérleti vizsgálatok megerősítették a gyulladásban az uralkodó szerepet az érelmeszesedés minden szakaszában, a korai stabil ateroszklerotikus plakkok kialakulásától a 2, 3, 4, 5 repedésre hajlamos fejlett plakkokig. A közelmúltban számos tanulmány foglalkozott a farmakológiai beavatkozások fejlett plakkok stabilitására gyakorolt ​​hatásával, mivel az instabil elváltozások megbomlása hozzájárul az akut 4, 6, 7 koronária szindrómához. Az instabil plakkokat nagy nekrotikus magok jellemzik, amelyek vékony rostos sapkába kapszulázott lipidekkel vannak tele, magas a gyulladásgátló mediátorok és a mátrix proteázok szintje, valamint az apoptózis. Az instabil plakkok kialakulása mind a veleszületett, mind az adaptív immunrendszer részvételével jár.

Az autópálya-szerű receptorok (TLR) a mintát felismerő receptorok családja, amelyek kulcsszerepet játszanak a veleszületett immunitásban és gyulladásos reakciókat indítanak el. Ezeknek a receptoroknak a ligálása megindítja a nukleáris faktor-KB (NF-kB) aktiválódását, ami a gyulladásos gének 8, 9 széles körének expressziójához vezet. A jellemzett TLR-k közül a TLR2 egyedülálló abban a képességében, hogy TLR1-gyel vagy TLR6-tal heterodimerizál, ami viszonylag széles ligandusspecifitást eredményez, ideértve az endogén és exogén 10, 11 ligandumokat is. Nevezetesen, minden lehetséges endogén TLR2 agonista, beleértve a biglycan-t, a nagyon mobil kromoszómális protein 1 (HMGB1) boxot és az oxidált lipoprotein-komponenseket, megtalálható a 12, 13, 14 érelmeszesedésben. Ezenkívül a TLR2 jelátviteli út társul az endoplazmatikus retikulum (ER) stresszválaszához. Az ER stressz növelheti a TLR2 expresszióját in vitro és in vivo, és a TLR2 hozzájárul az apoptózishoz azokban a makrofágokban, amelyek lipidek által indukált ER stresszt szenvednek 15. Így a TLR2 potenciális célpont lehet az érelmeszesedés kezelésében alkalmazott terápiás beavatkozások során.

Valójában a TLR2 ligandumokat és a TLR2 túlzott expresszióját figyelték meg az emberi érelmeszesedési plakkokban, és a TLR2 fontos szerepét a mátrix gyulladásában és lebontásában a humán carotis 16, 17 érelmeszesedéses elváltozásaiban talált sejtek jelzik. Ezenkívül a TLR2 génhiány egérmodellben szignifikánsan gátolta a korai érelmeszesedés progresszióját 18, 19. Állatmodellekben azonban a TLR2 előrehaladott elváltozásokra gyakorolt ​​hatásairól korlátozott adatok állnak rendelkezésre. A TLR2 aktivitás farmakológiai és genetikai gátlásának felhasználásával megvizsgáltuk a TLR2 blokád terápiás és profilaktikus hatásait az apolipoprotein E (ApoE) hiányos egerek brachiocephalic artériájában előrehaladott ateroszklerotikus plakkokra, amelyeket még nem értékeltek. Megállapítottuk, hogy a TLR2 aktivitás blokkolása csökkenti és stabilizálja az előrehaladott érelmeszesedést az ApoE-hiányos egerekben azáltal, hogy csillapítja az erek gyulladását és ER-stresszét. Munkánk arra utal, hogy a TLR2 aktivitás döntő szerepet játszik az előrehaladott érelmeszesedés patogenezisében, és hogy ennek a jelátviteli útnak a blokkolása ígéretes stratégia lehet az érelmeszesedés és szövődményeinek kezelésében.

Anyagok és metódusok

Állatok és kísérleti tervezés

Az ApoE -/- Tlr2 -/- egereket ApoE -/- egerek (C57BL/6 háttér, Jackson Laboratory) és Tlr2 -/- egerek (C57BL/6 háttér, Jackson Laboratory) heterozigóta keresztezéseiből állítottuk elő. A homozigóta kettős vagy egyszeres ApoE egerek genotípusait PCR-rel igazoltuk a fentiek szerint 18. Valamennyi állatot normál körülmények között, páratartalom, szobahőmérséklet és sötét fényciklus mellett, a vízhez és az ételhez ad libitum hozzáféréssel helyeztük el. A vizsgálatokat az állattartás és az orvosbiológiai kutatások etikai etikai intézményi bizottsága (Peking, Kína) által meghatározott elveknek megfelelően végezték el.

Az első kísérletben az összes egeret normál étrenddel etették [4% (tömeg/tömeg) zsír, 20% (tömeg/tömeg) fehérje, GB-14924]. 40 hetes korban az ApoE -/- Tlr2 +/+ egereket véletlenszerűen 3 csoportba osztották (n = 16 csoportonként), és sóoldattal, izotípushoz illesztett IgG antitesttel (SouthernBiotech, Birmingham, AR, USA) vagy TLR2-vel kezelték. semlegesítő antitest (R&D System, Minneapolis, MN, USA) intravénásan. Az antitest (ab) beadásának dózisát és ütemezését korábbi 20, 21 vizsgálataink alapján határoztuk meg. Az első adagolási rend 200 μg/kg volt 4 naponta 2 héten át, a fennmaradó adag pedig 100 μg/kg volt hetente egyszer további 16 hétig. A kettős knockout (DK) csoportnak nevezett ApoE -/- Tlr2 -/- egereket ugyanolyan körülmények között helyeztük el. Az összes egeret 58 hetes korukban feláldoztuk. A második kísérletben az ApoE -/- Tlr2 +/+ és az ApoE -/- Tlr2 -/- egereket magas koleszterin (HC) [15,8% (w/w) zsír, 1,25% (w/w) magas ateroszteroid táplálékkal etették ) wt) koleszterin] 6 hetes kortól, és elemzés céljából 12, 18 és 24 hetes korban feláldoztuk őket (n = 8 csoportonként).

A szövetek összegyűjtése és feldolgozása

Miután az egereket 4 órán át éheztettük, lipidméréshez vért nyertünk retro-orbitális vénás plexus segítségével. Az egereket ezután 50 mg/kg ip-pentobarbitállal altattuk, és a bal kamrán keresztül jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal fiziológiás nyomáson perfundáltuk. Az aortákat gyorsan kivágtuk, az aorta ívéből az ileum bifurkációja érdekében lefagyasztottuk, és a fehérje-elemzés előtt -80 ° C-on tartottuk. Minden állat teljes brachiocephalikus artériáját 4% paraformaldehidben rögzítettük 24 órán át 4 ° C-on, paraffinba ágyazva és sorozatban vágva (5 μm vastag).

Biokémiai elemzés

A teljes koleszterin, a nagy sűrűségű lipoprotein (HDL-C) koleszterin, az alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin (LDL-C) és a trigliceridek plazmaszintjét kereskedelmi készletek (Biosino, Peking, Kína) segítségével határozták meg a gyártók utasításai szerint.,

Szövettani és immunhisztokémiai festés

A sorozatok mindegyik ötödik szakaszát módosított Movata pentachrome festéssel vagy Sirius vörös festékkel festettük a brachiocephalicus artériában lévő fejlett ateroszklerotikus plakkok összetételének és stabilitásának értékelésére, és egérenként 12-15 metszetet elemeztünk minden színre. A festett szakaszokat 200-szoros nagyítással fényképeztük, és a teljes elváltozást tartalmazó szakaszonként 2-3 metszetet rögzítettünk és elemeztünk az Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA) alkalmazásával. Az összes szakasz átlaga egy egér ateroszklerotikus elváltozását jelentette.

Az immunhisztokémiai festéshez egérenként legalább 4 brachiocephalikus artéria-részt inkubáltunk patkány anti-egér makrofág antitesttel (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), egér simaizomellenes monoklonális antitesttel. aktin (α-SMA, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) vagy nyúl anti-mátrix metalloproteináz (MMP) -2 antitest (1: 100, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság). A megkötött antitesteket peroxidázzal társított másodlagos antitestekkel komplexáltuk és diaminobenzidinnel detektáltuk. A festett metszeteket 200x-os nagyítással fényképeztük, és 2-3 látómezőt vettünk fel, amelyek a szakaszonként a teljes elváltozást tartalmazták, és elemeztük az Image-Pro Plus 5.0 alkalmazásával. Az összes szakasz átlaga a célfehérjék expresszióját jelentette az érelmeszesedéses elváltozásban.

A makrofágok és a homológ C/EBP fehérje (CHOP) együttes lokalizációjának értékeléséhez patkány anti-egér makrofág antitest (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) és egér anti-CHOP monoklonális antitest ( 1: 100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) használtuk primer antitestként. Négy egérszövet-metszetet inkubáltunk Alexa 647-jelölt csirke anti-patkányokkal és Alexa 488-jelölt nyúl másodlagos antitestekkel (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A metszeteket E2000U konfokális mikroszkóppal néztük meg, és a Leica TCS SP2 szoftverrel értékeltük.

In situ TdT-közvetített dUTP-vizsgálatok az N-terminális jelöléshez

Az ateroszklerotikus elváltozásokban az apoptotikus sejteket TdT-közvetített dUTP nick-end jelöléssel (TUNEL) detektáltuk kitek felhasználásával (Promega, Madison, WI, USA). A sejtmagokat DAPI-val festettük. A TUNEL-pozitív magokat egy Olympus I720 invertált fluoreszcens mikroszkóp alatt számláltuk. A makrofágok lokalizációjának értékeléséhez makrofágokat detektáltunk patkány anti-egér makrofág antitest (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), majd egy csirke szekunder antitest, amelyet Alexa 647 jelölt (1: 200)., Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA).

Western blotok

A szöveti homogenizálás után az extrahált fehérjéket 12% -os SDS-PAGE-val elválasztottuk, és specifikus antitestekkel, köztük anti-MMP-2-vel (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), anti-foszfo-NF-κB p65, anti-NF-mel immunoblotizáltuk. -KB p65, hasított kaszpáz-3, anti-CHOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-foszfo-Stat3, anti-Stat3, anti-interleukin (IL) -6, anti-IL-10 vagy faktor tumorellenes nekrózis (TNF) -α (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). A másodlagos antitest szignálokat ECL Plus Western blot reagensekkel (Amersham Biosciences, PA, USA) detektáltuk a gyártó utasításainak megfelelően.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. Több csoport összehasonlítását SPSS segítségével egyirányú ANOVA-val végeztük. A normál eloszlást nem mutató adatokat a Mann-Whitney U teszttel elemeztük. P

A TLR2 aktivitás blokkolása nem befolyásolja a plazma lipidszintjét. Az összes koleszterin (A), a triglicerid (B), az LDL-C (C) és a HDL-C (D) szintjét 18 héten át sóoldattal, IgG-vel vagy TLR2ab iv-vel kezelt 58 hetes ApoE -/- egerekben határoztuk meg. TLR2-hiányos ApoE -/- egerekben (DK) takarmányt etettek. Az adatokat átlag ± SEM formájában adjuk meg (n = 12 egér/csoport).

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

A TLR2 blokád csökkenti és stabilizálja az előrehaladott ateroszklerotikus plakkokat a brachiocephalic artériában. (A és B) A Movat festés megmutatta a sóoldat, IgG és TLR2ab és TLR2 hiányos csoportok előrehaladott elváltozásainak összetételét. A nyilak a média erózióját jelzik. A skálasávok 200 μm-t képviselnek az A panelen és 50 μm a B panelen. A TLR2ab alkalmazása 18 hétig és a TLR2 hiány szignifikánsan csökkentette az átlagos elváltozás területét (C), a maximális elváltozás szűkületét (D), a maximális nekrotikus magokat/plakkot (E), és minimális közepes vastagságú (F) ApoE-hiányos egerekben. L, lumen; M, média. Az adatokat átlag ± SEM-ként adjuk meg (n = 10 egér/csoport). b P

A TLR2 blokád stabilizálja a fejlett ateroszklerotikus plakkokat. A TLR2ab és TLR2 hiányos festési csoportokban a Sirius vörös festés fokozott kollagéntartalmat mutatott (A). Az immunhisztokémiai festés a simaizomsejtek (B) bőségesebb eloszlását és a makrofágok (C) csökkenő csökkenését mutatta ki a brachiocephalicus artéria elváltozásaiban. A skála oszlopai 50 μm-t képviselnek. L jelentése lumen. Az adatokat átlag ± SEM-ként adjuk meg (n = 10 egér/csoport). b P c P

A TLR2 blokád gátolja az érgyulladást az érelmeszesedéses artériákban. Az MMP-2 expresszió (A és B), az NF-KB p65 foszforiláció (C), a Stat3 foszforiláció (D) és az IL-6, TNF-α és IL-10 (E) citokin expressziója csökkent a TLR2ab-ban. kezelt és TLR2-hiányos. A skála oszlopai 50 μm-t képviselnek. Az adatokat átlag ± SEM formájában adjuk meg (n = 6 egér/csoport). b P

A magas koleszterinszintű (HC) étrend növeli a TLR2 expressziót a makrofágokban, a TLR2 blokkolás pedig csökkenti a HC által kiváltott CHOP expressziót és az apoptózist az érelmeszesedéses elváltozásokban. (A) A Movat festés plakk morfológiát mutatott ki az ApoE -/- Tlr2 +/+ és az ApoE -/- Tlr2 -/- egerek brachiocephalikus artériáiban. A skála oszlopai 200 μm-t képviselnek. A TLR2 hiány szignifikánsan csökkentette az elváltozás átlagos területét (B) és a nekrotikus magméretet (C) (n = 8 egér/csoport). (D) A kettős immunfluoreszcencia a TLR2-t expresszáló makrofágok infiltrációját mutatta 12–24 hetes ApoE -/- egerek brachiocephal artériáinak elváltozásaiba, amelyeket 6 hetes kortól kezdve aterogén étrendre helyeztünk. A skála oszlopai 20 μm-t képviselnek. Ebben a korban az ApoE -/- Tlr2 -/- egerek szignifikánsan csökkent CHOP (E), Bcl-2 (F) és hasított kaszpáz-3 (G) expressziót mutattak az aortában. Az adatokat átlag ± SEM formájában adjuk meg (n = 4-6 egér/csoport). b azonos korú P -/- egerek. e P -/- 12 hetes korban etetésre szánt élelmiszereken.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

vita

A gyulladásos folyamatok kulcsszerepet játszanak az érelmeszesedés kialakulásában. Kimutatták, hogy a TLR2 részt vesz ebben a folyamatban 11, 27. Az érelmeszesedés korai stádiumának korábbi tanulmányaival összhangban a TLR2 aktivitás blokkolása csökkentette a makrofágok beszivárgását a plakkokba; a gyulladásos mediátorok expressziója, beleértve az MMP-2-t, a TNF-a-t és az IL-6-ot; és az NF-KB 20, 21, 23 transzkripciós faktor inaktiválása. Ezenkívül a TLR2 antagonizmus gátolta az IL-10 immunszuppresszív mediátorok és a Stat3 transzkripciós faktor expresszióját is, ami arra utal, hogy a TLR2 blokkolásának előnyei a gyulladás kiterjedt gátlásától függenek. Ez a tanulmány a TLR2 által kiváltott gyulladás első bizonyítékát nyújtja előrehaladott elváltozásokban, hogy kiegészítse a TLR2 korábban feltárt hozzájárulását a korai érelmeszesedésben.

A plakk instabilitása az előrehaladott érelmeszesedés fontos jellemzője. Bár a lepedék repedésének hátterében álló mechanizmusok továbbra is megfoghatatlanok, számos tényezőről kiderült, hogy hozzájárulnak ehhez a folyamathoz, beleértve a makrofágok felhalmozódását, a gyulladásgátló mediátorok magas szintjét, az MMP túlaktiválását, valamint a VSMC és a makrofágok apoptózisát. A gyulladásos válaszok szabályozása mellett megfigyeltük, hogy a TLR2 blokád TUNEL analízissel és immunfluoreszcenciával csökkentette a makrofág apoptózist.

Összefoglalva, bebizonyítottuk, hogy az ApoE -/- egerekben a TLR2 knockout gén az előrehaladott érelmeszesedés során csökkentette a plakk méretét és fokozta a plakk stabilitását a brachiocephalicus artériában az ER stressz okozta gyulladás és a makrofág apoptózis gátlása miatt, és ígéretes lehet. terápiás stratégia az előrehaladott érelmeszesedés ellen. Mivel a betegség megindításához a TLR2 fokozott expressziója szükséges az endothelsejteken, a TLR2 közvetítheti vagy amplifikálhatja az ER stressz által indukált apoptotikus jeleket előrehaladott ateroszklerotikus elváltozásokban. Munkánk azt sugallja, hogy a TLR2 jelátvitel farmakológiai blokádja vonzó megközelítést jelent az érelmeszesedés jövőbeli kezelésében.

A szerző közreműködése

A tanulmányt Xiao-xing WANG és Zhuo-wei HU tervezte; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV és Hui-min YAN hozzájárult a módszertan kidolgozásához; A kísérleteket Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV, Jia-ping WANG, Hui-min YAN, Zi-yan WANG, Han-zhi LIU és Xiao-ming FU végezték; Xiao-xing WANG és Zhuo-wei HU elemezték az adatokat, és dolgozatot írtak.