traf3

  • További információ
  • Word dokumentumok
  • Kiegészítő anyagok és módszerek
  • További jelmagyarázati táblázatok
  • További képmondák
  • Excel fájlok
  • 1. kiegészítő táblázat
  • 2. kiegészítő táblázat
  • Képfájlok
  • További 1. ábra
  • További 2. ábra
  • További 3. ábra

A TRAF3-ot, a citoplazmatikus adapter fehérjét, a közelmúltban számos humán humán B-sejt neoplazmában jelölt tumorszuppresszornak azonosították. Homozigóta deléciókat és inaktiváló mutációkat mutattak ki a Traf3 génben a non-Hodgkin limfómában, beleértve a lép peremzónás limfómát (MZL), a krónikus B-sejtes limfocita leukémiát, a köpenysejtes limfómát, valamint a myeloma multiplexet és a Waldenström-féle macroglobulinemiát. 1, 2, 3, 4 Mindazonáltal függetlenül attól, hogy a TRAF3 deléciók vagy mutációk ok-okozati szerepet játszanak-e a B limfomagenesisben, egy további in vivo vizsgálat TRAF3 knockout egerek alkalmazásával függőben van.

Nemrégiben létrehoztunk egy feltételes allélt a Traf3 gén funkcióvesztésével, amely lehetővé teszi a TRAF3 specifikus delécióját egerek B-sejtjeiben (B-TRAF3 -/- egerek). 5 Ezeken az egereken a B-sejtek igen elterjedt populációi mutatkoznak a másodlagos limfoid szervekben a BAFF-független érett B-sejtek figyelemre méltóan elhúzódó túlélése miatt, amelyet ezt követően Gardam és mtsai. 6 A TRAF3 és TRAF2 összeállítva szabályozó komplexet alkotnak a cIAP1/2-vel és a NIK-szel, hogy gátolják az NF-KB jelátviteli utat. 7, 8 Ezek a megfigyelések meghatározzák a TRAF3-NIK-NF-KB2 tengely központi szerepét a B-sejtek túlélésének szabályozásában. Az elhúzódó B-sejtek túlélése ismert hajlamosító tényező az autoimmunitás és a B-limfóma kialakulásában. 9, 10 öregedő B-TRAF3 -/- egereknél magas az autoantitestek szérumszintje a kettős szálú DNS-hez, valamint az immunokomplex glomerulonephritishez. Az autoimmunitás önmagában a B limfóma kockázati tényezőjének tekinthető szisztémás lupus erythematosusban vagy Sjogren-szindrómában szenvedő betegeknél. Ezért a B-TRAF3 -/- egerek hajlamosak lehetnek a B-sejt rosszindulatú daganataira. Itt beszámolunk arról, hogy a B-TRAF3 -/- egereknél 18 hónapos korukra spontán kialakultak az MZL vagy B1a klonális lép-limfómák.

Először megjegyeztük, hogy a B-TRAF3 -/- egerek szignifikánsan csökkentették a túlélést 9 hónaposnál fiatalabb korban (1a. Ábra). 50 B-TRAF3 -/- 9-18 hónapos egér szövetét vizsgáltuk, 18-at elpusztítottak halálukkor és 32-et, amelyeknek a vizsgálat idején nem voltak külső betegség jelei. Mind a 18 halandó B-TRAF3 -/- egér és a másik 32 közül 20-nak (62,5%) lépi B-limfóma volt (1. kiegészítő táblázat). Durva megfigyelések és mikroszkópos vizsgálatok más szövetek, köztük a csontvelő, a nyaki és a mesenterialis nyirokcsomók, a vese, a tüdő és a máj, valamint az ascites limfóma érintettségét is feltárták (1b és c ábra, valamint az S1 kiegészítő ábra, valamint kiegészítő anyagok és módszerek). A lymphoid neoplazmák Bethesd besorolásának 12 kritériumai alapján a B-TRAF3 -/- lép egerek daganatai MZL voltak, mind a magas fokú MZL-t, mind a centroblastikus diffúz nagy B-limfociták citológiáját, mind az alacsony fokú MZL-t, normális jelekkel MZ B sejtek.

Teljes méretű kép

Továbbá áramlási citometriával jellemeztük a lépben, a csontvelőben és az ascitesben található tumorsejtek immunfenotípusos jellemzőit (1d. Ábra és S2 kiegészítő ábra). 21 egyedi egér áramlási citometriájának adatait a 2. függelék táblázat foglalja össze. A szövettani diagnózisokkal összhangban az érett B-sejtes lymphomákra immunfenotípusos tumorprofilok voltak jellemzőek. Egy kivétellel, a kanonikus érett B-sejt markerek - B220, CD19, IgM, IgD és IgK vagy Igλ - összes vizsgálata változó mértékben pozitív volt. Az egyik kivételes eset (27–9) az IgG + IgM - IgD - 20% CD138 + volt. A kilenc vizsgált limfóma immunfenotípusos profilja hasonlított a B1a sejtprofilra, míg a másik két eset a B1b sejtprofilra. A fennmaradó 10 esetben 5 CD5 - CD11b - CD21 + CD23 volt, amelyek hasonlítottak a normál MZ B sejtekre. A TRAF3 -/- B limfómák több mint fele (11/21) a B1 B sejtekből származik, és további 23% (5/21) az MZ B sejtekből származik. Ez azt sugallja, hogy sok esetben szövettanilag diagnosztizált centroblastos diffúz nagy B-sejtes limfómák voltaképpen jó minőségű lép MZL voltak.

Ezután 21 egyedi B-TRAF3 -/- egér primer tumormintájának IgH génjének Southern blot-analízisét végeztük klonalitásuk meghatározása céljából. Az eredmények (1e. Ábra) egy vagy több nem csíravonalas sáv jelenlétét tárták fel a tesztelt DNS-ek mindegyikében, ami a rosszindulatú B-sejtek monoklonális vagy oligoklonális terjeszkedését jelzi. Ugyanannak az egérnek két vagy három szövetéből előállított DNS gyakran hasonló méretű átrendeződött sávokat mutatott, ami ugyanazon klón metasztatikus terjedését jelzi.

Ezek a megfigyelések arra késztettek bennünket, hogy közvetlenebb bizonyítékot keressünk a rosszindulatú transzformációra az ismert klonális populációjú tumorsejtek intraperitoneális átvitelével immunhiányos NOD SCID egerekbe. Az átvitel után 2-3 hónappal a befogadó egereknél limfóma infiltrátumot találtak több szövetben. Az átültetett daganatok immunfenotípusos tulajdonságokkal rendelkeztek, mint a donor populáció (1f. Ábra). A Southern blot analízis azt mutatta, hogy a primer TRAF3 -/- B limfómák egy vagy két klonális populációja szaporodott a NOD SCID recipiens egerekben (1g. Ábra). Így a B-TRAF3 -/- egerekben kifejlődött spontán B-limfómák klonálisak, rosszindulatúak és átültethetők.

A rosszindulatú B-sejtek eredetéről, eloszlásáról és kórelőzményéről további információk megszerzéséhez 11 B-TRAF3 -/- egérből klónoztuk és szekvenáltuk a limfómák IgH V (D) J régióját (1. táblázat). IgH szekvenciák A vizsgált 11 egérből 10-ben nem mutattak ki szignifikáns szomatikus hipermutációt, ami arra utal, hogy ezek nem a központban passzált csíra sejtekből származnak, hanem inkább naiv pregerminális középső B sejtekből, MZ B sejtekből vagy B1 sejtekből. . Érdekes módon a TRAF3 -/- B limfómákban azonosított összes fő VH szekvencia a négy VH család egyikéhez, a VH1 (J558), a VH3 (VH36-60), a VH5 (VH7183) és a VH12 családhoz tartozott. Ezek a géncsaládok gyakran MZ, B1 vagy autoreaktív B sejteket használnak. Ezért az IgH V (D) J szekvenciák, szövettani és immunfenotípusos adatokkal együtt lehetővé teszik a legtöbb B-TRAF3 -/- egérben kifejlődött B limfómák lépi MZL vagy B1 limfómákká történő besorolását.

Asztal teljes méretben

Korábban bemutattuk az NF-κB2 konstitutív aktiválódását és a csökkent PKC5 nukleáris transzlokációt, de a normál CD40-indukálta NF-κB1 aktivációt a TRAF3 -/- B premalignáns sejtekben.5 Itt ezeknek az útvonalaknak az elemzését kiterjesztettük a B-TRAF3 -/- egér limfómák. Megállapítottuk, hogy az NF-kB2, p52 és a RelB alegységek megnövekedett magszintje és a PKC5 csökkent nukleáris szintje szintén a primer B limfómákra utal (2a. Ábra). Érdekes módon a TRAF3 -/- B limfómák az NF-κB1 magszintjét is kissé megnövelték. Így a TRAF3 -/- B limfómák jelátképét az NF-kB2 és NF-KB1 (bár kisebb mértékben) útvonalak konstitutív aktiválása, valamint a csökkent PKC5 nukleáris transzlokáció jellemzi.

Teljes méretű kép

Annak tesztelésére, hogy az aberrált NF-κB aktivációs utak szolgálhatnak-e terápiás célpontként a TRAF3 inaktivációval járó B-sejt neoplazmák szempontjából, megvizsgáltuk azoknak a gyógyszereknek a hatását, amelyek modulálják az NF-κB aktivációt B-TRAF3-tisztított primer B-limfómasejtek alkalmazásával a sejtek életképességén. . -/- egerek. Az IKK2-gátlót, a BMS-345541, 13-at és az NF-κB-gátlót, az oridonint használtuk. Ezen anyagok hatásait összehasonlítottuk a B-limfómák vagy leukémiák kezelésére klinikailag alkalmazott gyógyszerekkel - vinkrisztinnel, minden transz-retinsavval, doxorubicinnel és ciklofoszfamiddal. Megállapítottuk, hogy az oridonin erős dózisfüggő tumoricid aktivitást mutatott az elsődleges lymphoma sejteken, míg a BMS-345541 és négy klinikai gyógyszer inaktív volt (2b. És c. Ábra és további S3. Ábra).

Az oridonin mechanizmusainak megértése érdekében meghatároztuk az NF-κB és NF-κB1 alegységek szintjét a primer B-limfómák citoszolos és magkivonataiban. Az aktivált NF-κB2 és NF-κB1 szintje a magban szignifikánsan csökkent az oridoninnal kezelt B-limfómasejtekben (2d. Ábra). Továbbá az oridonin nem befolyásolta a PKC5 nukleáris transzlokációt vagy az ERK, p38, JNK és AKT aktivációt (2d. Ábra és az adatok nem láthatók). Így az oridonin erős tumoricid hatása annak tulajdonítható, hogy aktivitása gátolja az NF-κB2 és NF-κB1 aktivációját, ami azt sugallja, hogy az oridonint vagy egy szorosan rokon anyagot új jelöltnek kell tekinteni a jellemzett B-sejtes neoplazmák kezelésében. . a TRAF3 genetikai/epigenetikai inaktiválása.

Megpróbáltuk továbbá az NF-κB2 szintjének specifikus csökkentését lentivirális shRNS vektorok segítségével, hogy értékeljük az NF-κB konstitutív aktivációjának szerepét a TRAF3 -/- B lymphomagenesisben, és 4 lentivirális shRNS vektorot teszteltünk NF-κB2 shRNS-t. Az NF-κB shRNS 653 és 1226 a p100, illetve a p52 NF-κB2 fehérjéket -95, illetve 75% -kal szuppresszálja. Ezt követően ezeket az shRNS lentivírusokat használtuk a jelen tanulmányban előállított 27-9.5.3 TRAF3 -/- B-lymphoma sejtvonal transzdukciójához (kiegészítő anyagok és módszerek). Érdekes módon az NF-kB2 shRNS 653 és 1226 gátolta a szaporodást és apoptózist indukált a 27-9.5.3 sejtekben. Fontos, hogy a két shRNS hatékonysága az NF-κB2 fehérjék alvadásában korrelált a TRAF3 -/- B-lymphoma sejtekben a proliferációt gátló és apoptózist kiváltó képességükkel (3. ábra). Noha más TRAF3 -/- B-lymphoma vonalakkal történő megerősítésre van szükség, adataink arra utalnak, hogy az NF-κB2 konstitutív aktiválása az egyik fő onkogén útvonal a TRAF3 -/- B sejtekben.

Az NF-κB shRNS-ek apoptózist indukáltak a TRAF3 -/- B-lymphoma sejtekben. Egér B-limfóma sejtek (M12.4.1 in ( a ) és a TRAF3 -/- B limfóma sejtvonal 27-9, 5, 3 in ( b, c, d ) egér NF-kB shRNS-t vagy rántott shRNS-t (SCR) expresszáló lentivírusokkal transzdukáltuk. a ) A p100 és a p52 NF-kB2 sejtfehérjék összes szintje immunoblot analízissel meghatározva. A fehérjéket kódolt shRNS-sel vagy NF-KBB 653, 1226, 2716 vagy 2996 shRNS-sel transzdukált B-limfóma sejtekből állítottuk elő. Terhelés kontrollként aktin immunblotot használtunk. ( b ) Az élő sejtek növekedési görbéi és ( c ) az élő versus elhalt sejtek százalékos aránya, amelyet tripán kékkel festett sejtek számlálásával határozunk meg. A grafikonok három független kísérlet eredményeit mutatják (átlag ± sd). d ) A transzdukált sejtek reprezentatív FACS profiljai elemezve az annekdin V és a propídium jodid (PI) festéssel. Az apoptotikus sejteket anneksein V + PI-, az elhalt sejteket anneksein V + PI +, az élő sejteket pedig anneksein V-PI−. Az adatok három független kísérletet jelentenek.

Teljes méretű kép

A B-sejtes krónikus limfocita leukémia, az MZL, a köpenysejtes limfóma, a Waldenström-féle makroglobulinémia és a myeloma multiplex TRAF3-delécióit és -mutációit azonosító tanulmányok a TRAF3 lehetséges tumorszuppresszív funkciójára utalnak. 1., 2., 3., 4. Paradox módon, a B-sejtekben a TRAF3-t túlzott mértékben expresszáló transzgénikus egerek autoimmun betegséget, szisztémás gyulladást mutatnak és hajlamosak a rákra. 15 Zapata és mtsai. A 15. ábra szerint a TRAF3 elősegítheti a plazma sejtek differenciálódását. Alternatív megoldásként a TRAF3-transzgénikus egerek váratlan fenotípusa potenciálisan kapcsolódhat egy olyan transzgén-inszerciós helyhez a genomban, amely befolyásolhatja más fontos gének (ek) expresszióját vagy működését, mivel csak egy transzgén alapító vonalat vizsgáltak részletesen. 15 Itt a B-limfómák spontán, nagyon behatoló fejlődése B-TRAF3 -/- egerekben meggyőző bizonyítékot szolgáltat arra vonatkozóan, hogy a Traf3 egy tumorszuppresszor gén a B-sejtekben.

Az ebben a tanulmányban bemutatott összesített adatok arra utalnak, hogy a B-TRAF3 -/- egerek szorosan modellezik az emberi lép MZL-t és a B-sejtek krónikus limfocita leukémiáját. A B-TRAF3 -/- egerekből származó B-limfóma sejteket használva modell rendszerként kimutattuk, hogy az oridonin és az NF-KBB2 shRNS-ek terápiás potenciállal bírnak. Eredményeink azt sugallják, hogy a TRAF3 fehérje vagy annak downstream jelátviteli útjának helyreállítása fontos terápiás út a B limfómák számára. Ebben a tekintetben a B-TRAF3 -/- egerek hasznos eszközt nyújtanak olyan terápiás gyógyszerek kifejlesztéséhez és teszteléséhez, amelyek olyan humán B-sejt neoplazmák kezelésére szolgálnak, amelyek magukban foglalják a TRAF3 inaktiválását vagy a kapcsolódó genetikai/epigenetikai változásokat.