lévő

  • elemeket
  • absztrakt
  • A fő
  • az eredmény
  • Express formula kilométerre egymástól a zebra organogenezise során
  • Szabályozás megszegése távolság egymástól megzavarja a szőrsejtek és a fültüszők fejlődését
  • Szabályozás megszegése távolságokat befolyásolja a hallással kapcsolatos gének expresszióját a zebrafish embriókban
  • A hajsejtek túlélése összefüggésben lehet a funkcióval távolságokat elnyomás zBax2 és támogatás zMcl1b
  • vita
  • Anyagok és metódusok
  • Etikai megállapítás
  • Az embriók karbantartása és gyűjtése
  • MO-k és mRNS szintézise korlátozott távolság egymástól
  • mikroinjekciók
  • A fülhólyagok megfigyelése
  • Ban ben te itt vagy hibridizáció in situ
  • Hajsejtek festése az apoptózis/halál megszámolásához és kimutatásához
  • RT-PCR és qPCR
  • Statisztikai analízis
  • szójegyzék

elemeket

  • apoptózis
  • Hallásrendszer
  • Az idegrendszer fejlődése
  • genetika

absztrakt

A fő

A halláskárosodás nemcsak a személyes testi és lelki egészséget károsítja, hanem növeli a társadalmi és gazdasági terheket is. A halláskárosodást számos tényező okozhatja, beleértve a szőrsejtek és a belső fül struktúrájának rendellenességeit, de a hibás molekuláris célok továbbra is megfoghatatlanok. A hallószervek fejlődési folyamataival társuló új molekuláris mechanizmusok, mint például a neuromasztikus ősvándorlás, a belső fülképződés, a szőrsejtek differenciálódása és fenntartása, valamint a szőrsejtek apoptózisa, ezáltal hozzájárul a hallásvesztés jobb megértéséhez. patológia. Ez a tudásfejlesztés megkönnyíti az ototoxicitás és a hallásvédelem megelőzésére szolgáló új gyógyszerek kifejlesztését.

Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a mérföldes zebrafish funkcióit a szőrsejtek és a neuromasztok fejlődésében és túlélésében, és beszámoltunk a távoli mérföldes aktivitás első összefüggéséről a neuromast, a szőrsejt és a fül hólyagjának fejlődésével, valamint a hallás génexpressziójával és a bcl-2 géncsalád. Megállapítottuk, hogy Mil fontos szabályozója lehet a zebrák hallásszerveinek kialakulásának és fenntartásának. Eredményeink hozzájárulnak a hallásfejlődési folyamatok jobb megértéséhez, és megkönnyítik az otoprotektív szerek kutatását.

az eredmény

Az expressziós minta mérföldekre van egymástól a zebra organogenezise során

A hegynek átívelő in situ hibridizációt alkalmaztuk a térbeli-időbeli expresszió mintázatának detektálására egymástól távol a zebrafish embrionális fejlődése során. A kilométerektől távol eső expressziót elsősorban az agyvelő régiójában összesítették, különösen a középagy/hátsó agy és a hasi hátsó agy határán; és gyenge expressziót figyeltek meg somitokban is, de nem notochordokban 24 hpf mellett (1a. ábra, a 'és a' ''). A garat fázisában (48 hpf) a transzkripció mérföldekre koncentrálódott a közép-/hátsó, a középső, a ventrális hátsó agy, valamint az idegcső- és érrendszeri padlólemezektől, főleg szabályos és diszkrét mintákban. jövőbeli neuromasztok az oldalsó vonalakon (1b., b 'és b' 'ábra). A kikelés periódusában (72 LE/s) azonban az mRNS távoli mérföldeket nem észlelték az oldalsó vonalakban és a hátsó padlólemezen, de még mindig erősen kifejeződtek az agy középső/hátsó agyának határán, az agytörzsön és a padlólemezen (1c. Ábra) ). ). Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a mérföldnyire lévő expressziós mintázat korrelál az idegrendszer fejlődésével, beleértve az agyat, a központi idegcsövet és az idegrendszeri rendszert a zebrafish-ban.

Az expressziós minta mérföldekre van egymástól a zebra organogenezise során. Az in situ hibridizációt egy antiszensz RNS próbával végeztük mérföldnyire a ), b ) a ( c ); A ponttól távoli érzéki érzék érzékelőt használtunk negatív kontroll szondaként ( d ). A ventrális szakaszokat embriók közül választottuk ki a fejek és törzsek elsődleges leképezéséhez. Az egész testet 1 dpf-n ( a ), 2 dpf ( b ) és 3 dpf ( c ); a vonatkozó címek ( a ') a ( b ') és törzseiket ( a '') a ( b ''). A fekete nyilak jelzik a neuromasták tervezett helyzetét a poszt-laterális vonalakon ( b ''). A fekete fél zárójelek a határ középső/hátsó határát jelölték ( a ') a ( b '). Az összes képen a fej balra, a farok jobbra; a lábak hátsó része, a lemez alsó része. A skála 310 μm ( a ) a ( b ), 330 μm v ( c ), 380 μm v ( d ), 160 μm v ( a '), ( b '), 130 μm v ( a 180 μm v ( b '')

Teljes méretű kép

Az egymástól való távolság szabályozatlansága megzavarja a szőrsejtek és a fültüszők fejlődését

Kilométerektől távol eső diszreguláció okozta otolitok és félköríves csatornák fejlődési hibái. Az embriókat 40 μM MOmil-rel vagy 40 ng/μl mil-mRNS-vel injektáltuk egy-négy sejtfázisban, és 2 dpf-n figyeltük meg ( a ) és 3 dpf ( b ). A WT embriókhoz képest 2 dpf-nél a tengerimalacok szokatlan formái jelentek meg a morfánsokban, például megnagyobbodott és nem ovális fülek (fekete nyilak) és a tasakok zsugorodása (narancssárga nyilak) MOmil injekcióval (9/10). Bár a misMO kontrollcsoportban az otolitok alakja (12/13) hasonló a WT-hez (10/10). Az egymástól mérföldekre mRNS-injekcióval kezelt embriók deformált, osztott vagy syncytium-szerű tasakot (piros nyilak) és kisebb méheket (fekete nyíl) mutatnak mRNS-injekcióval mérföldekre (11/12). A hisztogram azt mutatja, hogy az otolitméretek eltérései a gén leütése vagy a gén túlexpressziója miatt, az otolit terület kilométeres kilométereinek felhasználásával, amelyben markerként a sacculus és a méh területének arányát használták. A készítmények és SD-k a meghatározott fülhólyagokból származnak. ** P-értékek

A hallással kapcsolatos génexpresszió csökkent vagy fokozódott lefelé a zebrafish lárvákban. A hallással társított hmx2, fgf3, fgf8a, foxi1, otop1, pax2.1 és tmieb gének transzkripcióját RT-PCR-rel vizsgáltuk 48 hpf embrióban, és morfánsokban koncentrációfüggőnek találtuk (és c ) és megnövekedett az milliméteres távolságú embriókban, amelyeket mRNS-vel injektáltak ( e a f ). A felső paneleken a MOmil reprezentatív RT-PCR elektroforézis eredményei láthatók ( a ) és mRNS-vel injektált mRNS-t ( e ) és a triplikált RT-PCR sűrűség-vizsgálatából származó megfelelő hisztogramok eredményeként ( c a f) ). A kontroll csoportot injektált misMO-val szimulálták, és a b ) a ( d ). * P-értékek

A hajsejtek apoptózisát leütéssel indukálták. A zebrafish lárvákat 6 dpf-nél a három festék kevert oldatában festettük 30 percig 28 ° C-on, a készlet utasításainak megfelelően. a ) Az ml1 neuromast képei olyan lárvákban, amelyeket MOmil-rel injektáltak 40 vagy 500 μM mellett, és misMO 40 vagy 500 μM-et külön-külön a WT ml1 neuromasthoz viszonyítva. b ) megfelelő hisztogramja az 5a. ábrán. ( c ) A Neuromast O2 képeket ugyanúgy dolgozták fel, mint a ml1 MOmil és a misMO neuromastot, külön-külön. d ) megfelelő hisztogramja az 5c. ábrán. * P-értékek

Korábbi kutatások kimutatták, hogy Mil volt felelős a szív prekurzor sejtjeinek migrációjának és fúziójának szabályozásáért a szívrégióban és az ezt követő funkcionális szervdé történő differenciálódásért a szív- és érrendszeri fejlődésben. 5, 8, 24 Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy a Mil-funkció részben szerepet játszhat a szőrsejt-prekurzorok és a pro-neuromasztikus primódusok migrációjában és fejlődésében ALL-ben és PLL-ben (3. ábra). A Miles funkcionális megfelelősége a divergens szervekben a Mils alapvető közös szerepére utal a prekurzor sejtek migrációjának és a zebrafish organogenesisében való elhelyezkedésük szabályozásában.

Ez a tanulmány először bizonyítékot szolgáltat arra, hogy az egymástól mérföldekre elhelyezkedő gének működése részt vesz a fülhólyagok, az oldalsó szőrsejtvonalak és a neuromasztok kialakulásában a zebrafish-ban, és hogy a Mil-szint megváltozása szabályozhatja a bcl-2 család zBax2 és Mcl1B génexpresszióját.,

Anyagok és metódusok

Etikai megállapítás

Ezt a vizsgálatot szigorúan a kínai Tudományos és Technológiai Minisztérium laboratóriumi állatgazdálkodási rendeletében megfogalmazott ajánlásoknak megfelelően végezték el. A protokollt a Kínai Orvostudományi Akadémia Orvosi Biotechnológiai Intézetének állatkísérleti etikai bizottsága hagyta jóvá (IMBF20060302).

Az embriók karbantartása és gyűjtése

A Zebrafish (Danio rerio) WT Tuebingen törzset eredetileg a Pekingi Egyetem Élettudományi Egyetemétől szerezték be. A halakat 28,5 ± 1 ° C-on tartottuk 14/10 órás világos-sötét ciklusban. 27 embriót nyertek természetes párosítással; Megfelelő stádiumú szinkron embriókat gyűjtöttünk és rögzítettünk hpf és dpf 28 alkalmazásával. Az embriókat 4% paraformaldehiddel foszfátpufferolt sóoldatban rögzítettük in situ hibridizáció céljából, vagy Trizol reagensbe (Invitrogen) merítettük az mRNS izolálására. A 24 hpf feletti embriókban a pigmentálódást megakadályoztuk feniltiokarbamidban (PTU) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) történő inkubálással a rögzítés előtt.

MO-k és mRNS szintézise korlátozott távolságban egymástól

A MOmil és a misMO antiszensz morfolin oligonukleotidokat a Genetools-tól (Philomath, OR, USA; //www.gene-tools.com) terveztük és vásároltuk. A MOmil-t arra használták, hogy gátolja a mérföld mérföldeket, az 5'-CCGCAAACAGACGGCAAGTAGTCAT-3 'szekvenciával mérföldnyire lévő iniciációs helyekhez kötődve. A misMO kontrollt negatív injekciós kontrollhoz tervezték, amelyben öt bázis elveszett és aláhúzásra került az 5'-CCCCAAACACACCGCAACTACTCAT-3 'szekvenciában. Mindkét MO-t újra feloldottuk 1,0 μmol/ml ddH 2 O-törzsoldatban.

A teljes kilométeres távolságban levő CDNA-szekvenciát 24 hpf WT embriókból fordított transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) és a GenBank által közölt zebrafish futásteljesítmény-szekvenciának megfelelően tervezett és primerrel klónoztuk (Sangon Biotech, Shanghai), Kína). Ezt a cDNS-t használták templátként a zárt hurkú mRNS szintéziséhez az Ambion mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével, és a termék minőségét és hozamát elektroforézissel tesztelték.

mikroinjekciók

A hajsejtfestéshez 1 nl 20 μM MOmilt vagy 20 ng/μl zárt hurkú mRNS-t egy-négy sejtes szakaszban külön injektáltunk a WT embriókba; legalább öt lárvát 6 dpf-nél alkalmaztunk az o1, 02, ml1, ml2 és io4 idegsejtek szőrsejtjeinek megszámlálására, valamint a poszt-laterális vonalakon lévő neuromasztok számlálására. Az élő lárvák megfigyeléséhez a fülekben és a szőrsejtek számlálásához az embriókat ugyanabban a szakaszban 1 nl 20 μM MOmil-rel vagy 20 ng/μl mRNS-vel injektáltuk, a kupak egymástól elhatárolva. A szőrsejtek apoptózissal történő festésére 1 nl MOmilt 40 μM és 500 μM koncentrációban, valamint a misMO-t azonos koncentrációkban injektáltunk egysejtű vagy négysejtes embriókba; majd lárvákat gyűjtöttünk 6 dpf-nél. A halláshoz kapcsolódó gének RT-PCR analíziséhez 1 nl 10, 20 vagy 40 μM MOmilt és 10, 20 vagy 40 ng/μl mérföldig lezárt mRNS-t injektáltunk. ugyanaz az embrionális szakasz. Az embriókat inkubáltuk és 48 hpf-on gyűjtöttük össze. A zBax2 és zMcl1b qPCR analíziséhez 1 nl 40 μM MOmilt és 50 ng/μl lezárt mRNS-t külön-külön injektáltunk ugyanabba az embrionális fázisba. Az embriókat a fentiekkel megegyező körülmények között inkubáltuk.

A fülhólyagok megfigyelése

A WT, MOmil és Mil beinjektált mRNS-szel injektált zebrafish embriókban a fülhólyagok morfológiáját és szerkezetét 48 és 72 hpf sebesség mellett IX71 differenciál interferencia kontrasztmikroszkóp alatt (Olympus, Tokió, Japán) figyelték meg, és 500D digitális fényképezőgéppel rögzítették ( Canon, Tokió, Japán). Minden csoportnak több mint 10 lárvája van az otolithok számlálásához és a hisztogram.

In situ hibridizáció in situ

Az in vitro RNS-próba szintéziséhez egymástól (kilométerekben) elosztott génszekvenciát illesztettünk be a pBluescript KS-be (Agilent, Santa Clara, CA, USA), amelyet templátként alkalmaztunk egy szensz és antiszensz RNS próba szintéziséhez. kilométernyi DIG RNS szétválasztó készlet (Roche Applied Sciences, Basel, Svájc). A WT-expressziós minták mérföldekre történő meghatározása érdekében az embriókat 24, 48 és 72 hpf sebességgel gyűjtöttük, MOmil vagy mRNS injekciókkal kezelt embriókat, valamint WT kontrollokat gyűjtöttünk 48 hpf sebességgel. a pigmentáció elnyomására 4% paraformaldehidben történő rögzítés előtt egy éjszakán át 4 ° C-on. Az embriókat a hibridizáció előtt DNase-sel kezeltük a genom DNS okozta pszeudo-pozitív interferencia eltávolítása érdekében. A beépített in situ hibridizációs eljárás következő lépései a szokásos protokollt követték. 29.

Hajsejtek festése az apoptózis/halál megszámolásához és kimutatásához

A hajsejtek számlálásához a 6 dpf-n lévő zebrafish lárvákat 0,016% tricaine-ban (Sigma-Aldrich) érzéstelenítettük, és YO-PRO-1 fluoreszcens festékben (Invitrogen) inkubáltuk 1 μmol/l végkoncentrációban a hajsejtek festésére. az öt neuromaszt, az o1, ml1, ml2, o2 és io431 30 magja, amelyek a fülhólyag felszínén helyezkedtek el. Ezután a lárvákat IX51 invertált fázisú fluoreszcens mikroszkóppal (Olympus) vizualizáltuk. Minden csoportnak öt lárvája van a hajsejtek festésére és számlálására. A fényképeket Canon 500D kamerával készítették.

RT-PCR és qPCR

Asztal teljes méretben

Statisztikai analízis

Az összes adat statisztikai elemzését (átlag ± SD) egyirányú ANOVA tesztekkel végeztük, és a P, 0,05 értékeket jelöltük szignifikánsnak. A hisztogramokban sávokkal ellátott adatok átlagokat és SD-ket képviselnek, amelyek legalább három kiviteli alakból származnak.