elemeket

absztrakt

Vizsgálatunk során a brachypodium distachyont, egy kis, globulinokkal rendelkező egynyári füvet alkalmazták magvak tárolására, mint elsődleges fehérjetárolókat, hogy elemezzék a lisztérzékenységhez társuló, nem prolamin magokat tároló fehérjék toxikus természetét. A B. distachyon fő tárolófehérjei a 7S globulin típusú fehérjék és a 11S, 12S globulinok a mag tárolására, hasonlóan a zabhoz és a rizshez. A lisztérzékenységben szenvedő betegek szérummintáinak felhasználásával immunoblot elemzéseket hajtottunk végre, majd tömegspektrometriával azonosítottuk az immunreaktív fehérjéket. Crohn-kórban szenvedő betegek és egészséges egyének gluténmentes étrendben szenvedő cöliákiás betegek szérummintáit használtuk kontrollként. Az azonosított, intenzív szérum IgA reaktivitású fehérjék a 7S és 11–12S mag globulin családba tartoznak. A szerkezet-előrejelzések és az epitóp-predikciós elemzések megerősítették a lisztérzékenységgel összefüggő lineáris B-sejt-epitópok jelenlétét és az erős HLA-DQ8 és DQ2-kötő képességű peptid régiók jelenlétét. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az MHC-II megjelenése és a B-sejtek válasza nemcsak a prolaminok, hanem a magtároló globulinok esetében is kialakulhat. Ez a Brachypodium fehérjék első vizsgálata nem prolamin típusú vetőmag tárolására a lisztérzékenység szempontjából.

A gabonafajok - például a búza, a rozs és az árpa - prolamin típusú tárolófehérjeinek immunreaktív peptidjei úgy tekinthetők, hogy molekulákat indítanak a celiakia (CD), a vékonybélben villi atrófiát okozó szisztémás autoimmun betegség kialakulásában. A lisztérzékenységnek nagy genetikai összetevője van, és csak olyan egyéneknél fordul elő, akik humán leukocita-antigén (HLA) DQ2.5, DQ8 vagy DQ2.2 haplotípusokat hordoznak, amelyek toxikus peptidek sejtfelszíni receptoraként működnek az antigént bemutató sejten. A búza-gliadin-peptidek gyomorsavval vagy bizonyos enzimekkel (pl. A fő celiakia autoantigén, 2-es típusú transzglutamináz) történő dezaminálása erősen fokozza immunogén tulajdonságukat azáltal, hogy megfelelően bekapcsolja őket a DQ2 és DQ8 kötőhornyokba. Ezeknek a deamidált gliadin peptid (DGP) ellenanyagok elleni antitesteknek nagyobb diagnosztikai értéke van, mint a hagyományos anti-gliadin antitesteknek (AGA) 1, 2. Az egyetlen hatékony kezelés manapság az egész életen át tartó gluténmentes étrend, amely gyakran rizsben, kukoricában, quinoában, teffben vagy amarantban gazdag. Ezeknek a teljes kiőrlésű gabonáknak az a közös jellemzőjük, hogy magjaikban gazdag tárolási globulinok találhatók, a prolamin tároló fehérjék helyett.

Anyagok és metódusok

Betegek és szérumok

Szérum minták celiaciás betegekből, akiknek ismert HLA-DQ haplotípusuk van, és pozitívak a gluténbevitel elleni anticelliakus antitestekre (n = 13, 8 nő, 5 férfi), medián életkor 5, 7 év, 1, 4–13, 5 év) Szigorú minták szigorú gluténmentes étrenden (celfiak) szenvedő betegek normalizált antitestekhez (anti-transzglutamináz IgA 200 U/l) vezető 11, 12. Hat celiaciás beteg HLA DQ2 volt, 5 homozigóta; öt DQ8 homozigóta és egy heterozigóta (DQ8/X). A DQ tipizálás pontos eredménye egy esetben nem volt elérhető. A DQ8 egyik esetben két évvel a lisztérzékenység diagnózisa után alakult ki 1-es típusú diabetes mellitus. A szülők tájékozott írásbeli beleegyezést adtak a szérum mintavételhez. Az összes toborzási, adatgyűjtési és kísérleti módszert a vonatkozó irányelveknek és előírásoknak megfelelően hajtottuk végre. Valamennyi kísérletet jóváhagyta a budapesti Heim Pál Gyermekkórház etikai bizottsága, valamint a Semmelweis Egyetem Regionális és Intézményi Bizottsága és kutatási etika. A cöliákia diagnosztikai eljárás során szérummintákat vettek a cöliákia antitestek klinikai vizsgálatához az ESPGHAN irányelvek szerint, majd később a budapesti Heim Pal Gyermekkórház Etikai Bizottsága által jóváhagyott kísérletekhez használták.

Fehérjekivonások

50 mg zúzott B. distachyon beltenyésztett Bd21 mag összes fehérjét kivontuk Dupont és mtsai. Röviden: 2% SDS-t, 10% glicerint, 50 mM DTT-t és 40 mM Tris-HCl-t (pH 6,8, 8) tartalmazó SDS-Tris extrakciós puffert (pH 6, 8) alkalmaztunk szobahőmérsékleten egy órán át, rendszeresen. gyengéd örvény. Az extraktumot 16 000 g-vel 15 percig centrifugáltuk. A felülúszót négy térfogat jéghideg acetonnal kicsapjuk. Öt biológiai ismétlést alkalmaztunk az extrakciós folyamatban.

2D gélelektroforézis és immunblotolás

Csapás után az üledéket feloldjuk IEF pufferben (8 M karbamid, 2% CHAPS, 100 mM DTT, 0,2% CA és 0,1% bróm-fenol kék). Az izoelektromos fókuszálást 7 cm-es Immobiline DryStrips pH 3-10-ben (GE Healthcare) végeztük egy éjszakai rehidratálási körülmények között, 200 μg fehérjével, 150 μl IEF pufferben. 12% poliakrilamid géleket alkalmaztunk a fehérjék molekulatömegük alapján történő szétválasztására. A 2D GE három műszaki másolatban készült. Mivel a különböző biológiai és technikai replikátumok összes 2D fehérje mintája azonos volt, a végső online nano-LC-MS/MS-t három technikai 2D GE replikátumból készítettük, és a foltokat egyesítettük.

Miután a 2D GE fehérjéket átvittük egy ImmobilonP PVDF membránra (Millipore, Billerica, USA), és 1 órán át blokkoltuk 5% BSA-val és 0,05% TWEEN20-mal, majd éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on, 1:20 hígított vérszérummal. Az immunreaktív fehérjéket kecskékben termelt anti-humán IgA peroxidáz konjugált antitesttel (Sigma-Aldrich-A0295) detektáltuk a 4-klór-1-naftol kromogén peroxidáz szubsztrátjának jelenlétében. Az immunreaktív fehérjefoltokat kivágtuk és fehérje-azonosításra küldtük on-line nano-LC-MS/MS segítségével. Rizs-glutelin antitestet, nyúl anti-IgA-val másodlagos antitestként párosítva, 2D Western blot analízissel alkalmaztunk a magokat tároló globulinok jelenlétének megerősítésére. .

Fehérjék azonosítása on-line nano-LC-MS/MS

Szekvenciaelemzés és epitóp-előrejelzés

az eredmény

tároló

( A ) - A Bd21 beltenyésztett vonal teljes fehérjekivonatának 2D gélelektroforézise. A fehérjéket 3-10 pH-értékű IPG-csíkokon választottuk szét, majd 12% -os akrilamid-géleken. A jelzett fehérjefoltok immunreaktív fehérjéket képviselnek, és online nanoLC-MS/MS elemzésekre nyújtották be őket. A molekulatömeg tartománya a bal oldalon látható. ( B amíg F ) - IgA reaktivitású szérumot használó reprezentatív immunblotok előzetes cöliákia nélküli betegek kezelésében ( B - HLA DQ2, C - HLA DQ8, D - HLA DQ8/X), Crivn-betegségben szenvedő naiv beteg ileocol-betegség E ), HLA gluténmentes étrenden és egészséges kontrollon DIA2 celiakia-beteg G ). H- A teljes fehérjekivonat Western-blot-analízisét rizs-glutelin 12 antitestekkel és anti-nyúl IgA (Sigma-Aldrich) alkalmazásával végeztük másodlagos antitestként.

Teljes méretű kép

Asztal teljes méretben

A 7S globulinok két pontját (Uniprot ID I1GPS5 és I1GMC8) főleg a helyekről azonosították. Az I1GPS5-et 14 fehérjefolt elsődleges találataként ismerték el. Ez a fehérje mutatta a legnagyobb hasonlóságot a Globulin-3 és Globulin-3A búzatartály fehérjék homológjaival (Uniprot ID B7U6L4 és I6QQ39). Az I1GMC8-at két fehérjefoltban azonosítottuk, és a legnagyobb szekvencia-hasonlóság mutatkozott a Triticum urartu-ból (M7ZQM3) azonosított Globulin 1S típusú fehérjével. A Brachypodium I1HNH9 fehérje mutatta a legnagyobb homológiát a 11S globulinnal szemben (A. sativa Q38780). Az I1HMK7 és I1IPF2 fehérjéket 12S globulinokként azonosították, a legnagyobb hasonlóságot mutatva az A. sativa 12S magtároló fehérjéivel (P12615 és P14812). A szérum leggyakrabban a Globulin-3A búzafehérje-rezervoár (69, 23% - I1GPS5), valamint a 11S és 12S típusú globulinok (76, 92% - I1HNH9 és I1HMK7) homológjára reagált. Az alacsony molekulatömegű glutenin homológ (69, 23% I1HMR6) szintén erősen immunreaktív volt a lisztérzékenységben szenvedő betegek szérumaira.

A vetőmag-tároló globulinok jelenlétének bemutatására az immunreaktív fehérjefoltokban Western-blot-analízist végeztünk a rizs glutelinekre specifikus elsődleges antitestekkel, a rizs 11S vetőmag-tároló globulinok homológjaival (1H ábra). Erős globulin jeleket detektáltunk az ID 1–14 és 22–28 fehérjehelyekről.

A legfontosabb globulin találatokat (I1GPS5, I1GMC8, I1HMK7, I1IPF2I1HNH9), valamint a leggyakrabban azonosított prolamin fehérjét (I1HRM6) szilíciumanalízissel vizsgáltuk szerkezet-előrejelzéssel. Két szomszédos, a 7S és 11S - 12S magtároló globulinra jellemző cupin-1 domént találtunk a Brachypodium globulin összes találatában (2. ábra). A strukturált fehérjepartnerekhez 22 lehetséges kötődési képességű régiókat találtuk a legtöbb elemzett globulin fehérjében. Erős kötő régiókat találtunk a rendezett rendellenességi régiók határán a 7S típusú globulinokban (I1GPS5 és I1GMC8), míg a 11S és 12S globulinokban szignifikánsan gyengébb kötő régiókat találtunk, és az elemzett Brachypodium prolaminban nem találtunk kötő régiót. sorrend. (2. ábra)

Teljes méretű kép

Tíz aminosav hosszú peptidet, amelyek szekvenciája több mint 70% -ban homológ a B-sejt-specifikus lineáris glutén epitópokkal, az I1GPS5 fehérje-kötő régiók közvetlen közelében azonosítottuk (2. táblázat). Az azonosított epitóp-homológok peptidek voltak, amelyek polyQ régiókat tartalmaznak, és a glutaminban gazdag fehérje két régiójában helyezkednek el. Ezután egy hatmaradékos hosszú peptidet (QPEQPF) azonosítottunk a 11S globális magtároló génben, a 11HNH9-ben. Ez a peptid az ismert immunreaktív AGA-specifikus QPQQPF B-sejt epitóp (IEDB Epitope ID 147232) deamidált változata volt, amelyet a cöliákia során dezaminálnak. Ez a deamidált változat a szérum DGP antitestek egyik elsődleges célpontja a lisztérzékenységben. Érdekes módon a Poaceae egyik I1HNH9 homológja nem tartalmazta ezt a deamidált peptidet. Az anyagcserével kapcsolatos fehérjékben epitóp-homológokat nem találtak.

Asztal teljes méretben

A megjósolt kötőanyagok kiválasztását a felső 1% kötőanyag felhasználásával végeztük a konszenzus percentilis értékek alapján. Az előrejelzéseket minden allélra külön-külön számoltuk ki. A megjósolt epitópokat fehérje szekvenciákhoz térképezzük fel.

Teljes méretű kép

Az ISGPS5 7S globulin monomer harmadlagos szerkezeti modelljét növényekből izolált 7S globulinok nyilvánosan elérhető kristályszerkezeteinek felhasználásával hoztuk létre. Az azonosított gluténspecifikus B-sejt epitóp homológokat, amelyek körülbelül 350 aminosav távolságban vannak a szekvenciában, strukturális közelségben térképeztük fel. A B-sejt epitóp egyik homológja a második cupin-1 domén által képzett béta-hordó külső felületén található. A megjósolt HLA-DQ-specifikus T-sejt epitópok és az azonosított I típusú cukorbetegség epitópok a fehérjemolekula ellentétes helyén helyezkedtek el, amely szintén potenciálisan ki van téve az emésztőrendszer enzimjének (4A, B, C ábra). A 11SHHHHHHHHHHHHHH 11S mag esetében a megjósolt DQ2 epitóp eltemetett helyzetben volt, míg a QPEQPF B-sejt epitóp homológja a fehérje felületén található (4D és E ábra).

A monomer globulinok struktúráját a nyilvánosan hozzáférhető növényi ortológusok felhasználásával modelleztük strukturális sablonokként és egy szerverrel az I-Tasser fehérje szerkezetének és működésének előrejelzéséhez. Az azonosított gluténspecifikus B-sejt epitóp homológok és a DQ2 és DQ8 várható HLA-specifikus T-sejt epitópjainak helyzetét leképeztük a szerkezetre. ( A - C ) I1GPS5; ( D, E ) 11HNH9.

Teljes méretű kép

vita

Korábbi vizsgálataink alapján nagyszámú gabonafehérje tartalmazhat prolinban és glutaminban gazdag peptideket, így célpontjává válnak a lisztérzékenységhez kapcsolódó antigént bemutató sejteknek és az 10, 15, 24 immunoglobulinoknak. A búzában ezeknek a fehérjéknek a nagy része a prolamin szupercsaládjához tartozik, és a búzasikér természetes vegyülete. Vannak azonban olyan nem prolamin típusú fehérjék is, amelyek szintén tartalmaznak azonos vagy erősen hasonló gluténspecifikus T-sejt epitópokhoz és B-sejt epitópokhoz 10, 15 .

Vizsgálatunk megerősítette, hogy a globulin típusú gabonamagfehérjék specifikusan társulnak a lisztérzékenységhez, mivel más immunológiai gyulladásos betegségekben, például Crohn-betegségben szenvedő betegek nem ismerték fel ezeket a globulin típusú gabonatároló fehérjéket. A gluténmentes étrenden lisztérzékenységben szenvedő betegek szérumaival végzett immunblot-analízisek kedvezőtlen eredményei szintén megerősítették azt a hipotézist, miszerint a magtároló globulinok másodlagos B-sejt stimulánsokként működhetnek, mivel az elsődleges gluténindító tényezőkből származó epitópokkal erős szekvenciahomológiájuk van. A betegség progresszív stádiumában a villous atrófia és a fokozott bélpermeabilitás hozzájárul ahhoz, hogy ezek a fehérjék keresztantigénekként szolgálhassanak. Szigorú gluténmentes étrenden szenvedő, lisztérzékenységben szenvedő betegek helyreállított bélnyálkahártyája megakadályozza a bevitt fehérjék jobb átjutását, és valószínűleg ily módon szabályozható az erős immunreaktivitás.

A $ config [ads_text16] nem található

következtetések

További részletek

Hogyan idézhetem ezt a cikket: Gell, G. és mtsai. Alacsony prolaminszintű gabonafélék globulin tároló fehérjéinek jellemzése a lisztérzékenység kapcsán. Sci. ismétlés. 7, 39876; doi: 10.1038/srep39876 (2017).

Kiadói megjegyzés: A Springer Nature semleges marad a közzétett térképek és az intézményi kapcsolatok joghatósági állításai tekintetében.