elemeket

absztrakt

Érdekes módon úgy tűnik, hogy az aS és az a70 nagyon hasonló promóter szekvenciákat ismer fel 6. Ennek eredményeként számos promótert azonos hatékonysággal ismer fel mind az EσS, mind az Eσ70 in vitro 7, és ezek előnyös felismerését az RNS polimeráz egyik formája in vivo a segítő szabályozó fehérjék által közvetített 6. A promóter szelektív felismerése akár 70, akár oS segítségével a közös konszenzus 6, 8 szekvenciától való eltéréssel érhető el, amely egy σ faktorra specifitást ad: például egy C nukleotid (-13C) jelenléte közvetlenül a −10 promoter Ez az elem ismert meghatározója a σ kötődésének. S a közös jellemző a σ S9-függő promoterekben. Korábbi munkánkban arra összpontosítottunk, hogy meghatározzuk, mely promótereket kötik meg előnyösen in vitro az Eσ 70 vagy az Eσ S mikroarray (RCA) alkalmazásával; megerősítettük a σS promóter felismerése szempontjából fontos szekvenciaelemek fontosságát, mint például a C-maradékok jelenléte a -13 és -12 C elemekben, és felvetettük, hogy egy A/T-ban gazdag diszkriminátor régió elősegíti az Eσ S transzkripció iniciálását in vitro .

Ebben a munkában kromatin-immunprecipitáció-szekvenálást (ChIP-seq) alkalmaztunk az Eσ S-kötő promoterek azonosítására a korai stacionárius fázisban, vagyis abban a pillanatban, amikor az σS felhalmozódik a baktériumsejtben. Eredményeink új σS-függő gének azonosításához vezettek, és betekintést nyújtottak a nem kódoló RNS-ek σS általi szabályozásába. Megmutathatjuk azt is, hogy az EσS-hez kapcsolt promóterek jelentős részhalmaza olyan géneket hajt, amelyek expressziója független az S-S-től, ami arra utal, hogy a promóter-felismerés jelentős átfedésben van különböző σ faktorokkal.

az eredmény

Az MG1655-rpoS His6 felépítése és az aS-His6 immunprecipitációja

coli

A. Növekedési görbék LB közegben az MG1655 (körök) és az MG1655-rpoS His6 (gyémánt) törzsekből. Az aS (az MG1655 esetében) és az aS-His6 (az MG1655-rpoS His6 esetében) intracelluláris mennyiségét, amelyet a Western blot határozza meg az állófázis kezdetén (a grafikon 1. és 2. pontja), a betét tartalmazza. B. A HPII kataláz specifikus aktivitása az MG1655, MG1655-rpoS His6 és az MG1655A rpoS törzsekben. Három független kísérlet értékeit elemezte az ANOVA; a betűk statisztikailag szignifikáns különbségeket mutató mintákat jelölnek. C. A dps promoter régió relatív reprezentációjának meghatározása az input minta immunprecipitált (IP) változatában RT-PCR-rel. Az adatok két azonos eredményű ismétlés átlaga.

Teljes méretű kép

Chromatin immunprecipitációs szekvenálás (ChIP-szekvencia)

Asztal teljes méretben

A kék profilok mutatják az ismert osmB, dps, osmE és csrA gének IP sűrűségét és belépési címke profilját ( A ) függ az rpoS-tól és a nem kódoló RNS-ekhez kapcsolódó lókuszoktól: sibC/ibsC, ryeA/ryeB és omrA/omrB ( B ). A piros profilok mutatják a log2 jelet, hogy ellenőrizzék az spp (csúcsok) által kapott dúsítási becslési értékeket ugyanazokra a génekre és nem kódoló RNS-ekre. Az X-tengely értékei a csúcsok genomi koordinátái; az Ecocyc-től (ecocyc.org) nyert megfelelő gének/intergenikus régiók ábrázolása látható.

Teljes méretű kép

Az oS-IP-csúcsok túlnyomó része (78-ból 63) közvetlenül a kódoló szekvenciák vagy az ismert szabályozó RNS-ek előtt helyezkedett el, összhangban a promóter régiókhoz kötődő aS-kel. E 63 csúcs közül 61 az intergenikus régiókban helyezkedett el, míg a két csúcs az ORF-ekben stfR és wbbH, de a tfaS és a wbbI gének fölött helyezkedett el, ami arra utal, hogy meghatározhatnak belső promotereket az operonokban. A fennmaradó csúcsok az intragén régiókba esnek, jelentős távolságra a többi ORF-től (az S2 kiegészítő táblázatban felsorolva). Bár lehetséges, hogy ezen csúcsok némelyike ​​meghatározhatja a jóhiszemű Eσ S kötőhelyeket (például a még ismeretlen antiszensz RNS-ek promóterei), ebben a vizsgálatban nem vették figyelembe őket. Még ha feltételezzük is, hogy az összes intragén csúcs ChIP-seq artefaktus, a hamis pozitív eredmények százalékos aránya (19%) még mindig alacsonyabb lenne, mint a hasonló vizsgálatoknál 13 .

Az ismert vagy feltételezett promóter régióknak megfelelő 63 csúcs közül 50-et egyértelműen egy specifikus génhez lehet hozzárendelni, a csúcs által lefedett DNS-szekvencia, a szomszédos gének transzkripciójának iránya, a legközelebbi ORF-ek távolsága és ha a kísérletileg meghatározott transzkripció alapján indulási hely a határok csúcsán belül. Az 50 egyértelműen azonosított gén közül 27-ről kiderült, hogy a korábbi jelentésekben legalább részben rpoS-függőek, amint azt az 1. táblázat mutatja. Ezzel szemben a 2. táblázatban felsorolt ​​13 csúcs a divergensen átírt gének vagy operonok közötti intergenikus régiókban fekszik, és nem társítható egy adott génhez. Gyakran tapasztaltuk azonban, hogy a két divergens gén egyikét (vagy akár mindkettőt, mint a dsrB-yodD intergenikus régióban, a 2. táblázatban) korábban rpoS-függőnek írták le, ami arra utal, hogy az EσS kötődése az rpoS- függő promoter az intergenikus területen. Példaként az osmE-nadE intergén régió feltételezett EσS kötőhelyét rendeltük az osmE-hez, mivel promótere az aS-14, 15, 16 függvénye (2. ábra és 2. táblázat).

Asztal teljes méretben

Összességében a ChIP-seq kísérletben azonosított csúcsok átfedésben voltak 36 gén promótereivel, amelyekről kimutatták, hogy legalább részben függnek az rpoS-tól (kiemelve az 1. és 2. táblázatban). A stressztől függő stressz gének határozták meg a legismertebb funkcionális kategóriát ChIP-seq elemzésünkben (lásd 1., 2. táblázat), összhangban σ S szerepével, mint az általános stresszválasz fő szabályozója. Érdekes módon az EσS kötőhelyeket a sejtburok struktúrájában (erfK, lpp, ynhG) és a lipopoliszacharid (LPS) biogenezisében (lpxC, wbbH, wbbI) részt vevő számos gén előtt is találtak, ami arra utal, hogy az Eσ S fontos lehet az expresszió szempontjából. sejtfelszíni gének válaszul a növekedés leállítására.

Asztal teljes méretben

Az rpoS-függő génekkel nem társított intergén régiók többsége tartalmazott ismert vagy feltételezett promótereket, amelyeket az Eσ 70 felismert, összhangban a korábbi eredményekkel, amelyek kiterjedt keresztfelismerésre utalnak az EσS és az Eσ 70 regulonok között 7, 9. Érdekes módon más promótereket más σ faktorok is felismernek, nevezetesen σE (ytfJ és lpxP) és σH (hepA, sdaA, raiA és rpmE) (1., 2. táblázat).

Asztal teljes méretben

ChIP-seq analízissel azonosított gének in vivo expressziója

A qRT-PCR kísérletek eredményei (3. ábra) igazolni tudták a dps, ycgB, ybiI és ydbK rpoS-függő génexpresszióját, ami arra utal, hogy az utóbbi kettő az rpoS regulon azonosítatlan tagja. Ezzel szemben a fennmaradó gének expresszióját nem befolyásolta a funkcionális rpoS gén hiánya, legalábbis a tesztelt körülmények között. Annak további vizsgálatára, hogy ezek a gének mutattak-e valamilyen oS-függőséget, expressziós szintjüket teszteltük egy rpoS-szuppresszált törzsben (MG1655/pBADrpoS), amelyet korai stacionárius fázisig növesztettünk 0,1% arabinózzal kiegészített LB táptalajban. Noha az aS intracelluláris mennyisége majdnem tízszer nagyobb volt a pBADrpoS-t hordozó törzsekben az MG1655-hez képest, a relatív expressziós szintek egyikében sem vizsgáltak szignifikáns változást a tesztelt gének egyikén sem (az adatokat nem mutatjuk be).

A. Gél retardációs vizsgálatok heparinnal kiváltott K-glutamát pufferben. B. KMnO 4 reaktivitási vizsgálatok: Az EσS és az Eσ70 mindkét RNS polimeráz formáját 50 nM nyomáson teszteltük. Minden panel esetében az első sáv a molekulatömeg-marker, amelyet a DNS-fragmens G + A szekvenciális reakciójaként kapunk. C. Az újonnan azonosított bsmA, ybiI és ydbK promóterek szekvenciája. A szekvenciák -17 és +10 közötti helyzetben vannak felsorolva a "+1" jelű és félkövérrel jelölt transzkripciós kezdőhely (TSS) szerint. A -10 promóter elem alá van húzva. A KMn04-reakciókban reaktív KMn04-reaktív timidin-maradékok a templát-szálban (32 P jelzéssel) reaktívak.

Teljes méretű kép

A nem kódoló RNS-ek szabályozása Eσ S segítségével

A. Northern blot hibridizáció. Az RNS-t az állófázis kezdetén (OD600nm 3) extraháltuk LB-ben 28 ° C-on vagy 37 ° C-on tenyésztett baktériumokból, és SibC, OmrA és RyeA transzkriptum szintet vizsgáltunk (balról jobbra). Az egyes panelek jobb oldalán található számok a megfelelő ncRNS méretét jelzik. A géleket megvizsgáltuk a kívánt gének után, majd a mintát mosással eltávolítottuk, és a géleket 5S RNS-re teszteltük, amelyet belső kontrollként használtunk. B. Az omrA és omrB promoterek transzkripciós fúzióinak relatív fluoreszcenciája a GFP riporter génhez. A promóter aktivitását (folytonos vonal) a fluoreszcencia és a tenyészet abszorbancia (szaggatott vonal) arányában fejezzük ki a háttér korrekció után (RFU/OD600 nm). C. A -12C szubsztitúció hatása az omrA promoter régió T nukleotidjára. Az adatokat egyéjszakás tenyészetekről vettük, és négy független kísérlet átlaga.

Teljes méretű kép

Az S-S-hez kapcsolt promóterek szekvenciaelemzése

Weblogo 3 (//weblogo.threeplusone.com/) az Eσ S kötőhelyeken elhelyezkedő, kísérletileg azonosított promóterek szekvenciaillesztéseinek ábrázolása - vagy σS-függő gének (felső panel), vagy σS-független gének (alsó panel) 10 régióját igazítottuk az alábbiak szerint a hexamer első −10 nukleotidját -12 helyzetbe állítottuk. A promóter szekvenciákat az S3 táblázat tartalmazza.

Teljes méretű kép

vita

Asztal teljes méretben

Az is látszik, hogy az oS promóter keresztfelismerése kiterjed az σE és σH alternatív tényezőkre (1., 2. táblázat), a korábbi eredményeknek megfelelően, amelyek az rpoE és rpoS szabályozók hasonló funkcióit mutatják, és néhány promoter átfedi egymást σ. in vitro faktorok 10, 34. Eredményeink valóban megerősítik az aS és az aH közötti erős kölcsönhatást, mivel az rpoH promótert az EσS közvetlenül felismeri (1. táblázat), összhangban annak rpoS-függő expressziójával 35. Eredményeink összhangban állnak a legutóbbi jelentésekkel, amelyek az rpoE, rpoH és rpoS regulonok együttes szabályozását mutatják be az ozmotikus stresszre adott válaszként enteropatogén E. coli O157: H7 36-ban, valamint az E. coli σ faktorhálózatának átfogó elemzését, amely kiterjedt átfedést mutat a promóter felismerése az σ alternatívával 33 .

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

Míg a stresszválaszok jól ismert példák az rpoS regulonnal társuló génfunkciókra, eredményeink azt sugallják, hogy az oS közvetlenül részt vesz az LPS és a külső membránfehérjék biogenezisében és szerkezetében részt vevő gének expressziójában (1., 2. táblázat). Ismeretes, hogy a sejtfelszín szerkezetében és összetételében a 38 állófázisban változások következnek be. Eredményeink szerint az LPS Eσ S gének mellett a ChIP-seq az lpp promóterhez is kötődik, kódolva az Lpp vagy Braun lipoproteint, amely a külső membránt a peptidoglikánhoz köti, és az E-ben a leggyakoribb a külső membránhoz kapcsolódó lipoprotein. coli 21. Noha az lpp génexpresszió független az rpoS géntől (3. ábra), az rpoS gén és a Braun lipoprotein funkció kapcsolatát további javasoljuk az erfK és ynhG gének két további, az alternatív transzpeptidázból kettőt kódoló két további EσS kötőhely azonosításával. hogy az Lpp a peptidoglikánhoz térhálós. Az erfK és az ynhG géneket rpoS-függő 15, 16-ként írták le. Tehát úgy tűnik, hogy a növekedés álló fázisába lépéskor rpoS-re lehet szükség az Lpp-transzpeptidáz aktivitás fenntartásához a periplazmatikus térben.

Asztal teljes méretben

Végül eredményeink rámutatnak az Eσ S közvetlen szerepére a nem kódoló RNS-ek szabályozásának finomhangolásában: például az Eσ S elősegíti az omrA transzkripcióját, a határgén, az omrB azonban nem (5. ábra). Mindkét gén nagyon hasonló, nem kódoló RNS-eket kódol, amelyek ugyanazokat a géneket célozzák meg. Úgy tűnik, hogy az EσS-tól való eltérő függőség kialakulhat e két promóter révén, lehetővé téve az OmrA és OmrB nem kódoló RNS-ek különböző expresszióját különböző jelekre reagálva, az OmrA-t az rpoS regulon részeként indukálva. Az omrA promóter -12 pozíciójában lévő mutagenezis eredményei erősen megerősítik azt a gondolatot, hogy a -12C nukleotid kedvezően befolyásolhatja az Eσ S transzkripció iniciálását számos 39 promóternél. Mivel mind az OmrA, mind az OmrB RNS számos külső membránfehérje és extracelluláris struktúra, például a curli és a flagella 40 transzlációját befolyásolja, szelektív szabályozásuk közvetítheti az Eσ S ezekre a szerkezetekre gyakorolt ​​hatását, hozzájárulva a baktérium sejtfelületének általános átszerveződéséhez válasz. az álló szakaszhoz.

mód

Feszítő szerkezet

s-His6 immuncsapása

A kezeletlen MG1655-rpoS His6 DNS-ét ultrahanggal kezeltük, és 200 μl-t használtunk kontrollként szekvenálási reakciókban (Input = nem immunrecipitált DNS). A bemeneti és az immunprecipitált DNS-mintákat Agilent Bioanalyzer segítségével elemeztük, nagy érzékenységű DNS-készlettel (Agilent Technologies). Öt IP mintát egyesítettünk ugyanazon a DNS-tisztító oszlopon (minElute, QIAGEN), így 5 ng teljes DNS-t kaptunk, ami a szekvencia könyvtár előállításához szükséges minimális mennyiség. Két készlet DNS-DNS-t készítettek. A szekvencia könyvtárak elkészítése előtt valós idejű kvantitatív reverz transzkriptáz PCR-t (qRT-PCR) hajtottak végre, hogy meghatározzuk a dps gén rpoS-függő promóter régiójának dúsulását immunprecipitált mintákban a bemeneti mintához képest. A qRT-PCR-hez használt láncindítók szekvenciáját az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza.

Könyvtár előkészítése és szekvenálása

Az Illumina könyvtárakat vagy az immunprecipitált DNS (RpoS-IP) két készletének mindegyikéből 5 ng-ból, vagy 5 ng két kontroll DNS-ből (bemenet) készítettünk az Illumina TruSeq ChIP-seq DNS-minta előkészítő készlet szerint; majd minden könyvtárat szekvenáltunk egy egyszálú, 51 bp-os Illumin útvonalon egy GAIIx szekvenszeren. A nyers adatok nyilvánosan elérhetők a Sequence Reads Archive BioProject SRP041323 csatlakozási szám alatt; BioSample SRS595203; Kísérlet SRX523029; Run1 SRR1265068; Run2 SRR1271103.

Az adatok statisztikai és bioinformatikai elemzése

A nyers számokat az Escherichia coli MG1655 genomjához hasonlítottuk össze Bowtie 45 segítségével, nulla eltéréssel. A kapott BAM fájlokat a SAMtools 46 és a BEDTools 47 segítségével dolgoztuk fel. Az egyes szekvenált minták minőségét az SPP R 48. csomagban végrehajtott keresztkorrelációs elemzéssel ellenőriztük. A ChIP-seq csúcshívás a CisGenome 12 segítségével történt, standard paraméterek tárolásával. A háttérzaj modellezéséhez bemeneti adatokat (kontroll DNS) használtunk.

Az rpoS-függő génexpresszió meghatározása in vivo

Az összes génexpressziós kísérlethez baktériumtörzseket növesztettünk LB táptalajban OD600nm = 3,0 értékre . A qRT-PCR-hez RNS-t extraháltunk és a kísérleteket a fent leírtak szerint hajtottuk végre, 16S RNS-t használva referenciaként. A qRT-PCR kísérletekben használt primereket az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza. Az Northern-blotokhoz a teljes RNS-t forró fenollal extraháltuk a kis RNS-molekulák megőrzése érdekében. 5-20 μg RNS-t elválasztottunk egy 6% -os denaturáló akrilamid gélen, mielőtt nejlonmembránra elektrotranszfert végeztünk volna. Génspecifikus próbaként 5 n-biotinilezett oligomereket (Kiegészítő S1 táblázat) 1 nM koncentrációban 20 pM 5S RNS próbával kombinálva használtunk belső kontrollként. A telítettséget és a hibridizációt ULTRAhyb®-oligo pufferrel (Ambion) végeztük 45 ° C-on, és a jeleket kimemi nukleinsavdetektáló modul (Thermo Scientific Pierce) segítségével detektáltuk. A GFP riportervizsgálatokat a fent leírt módon végezzük 50 .

RNS-polimeráz in vitro

Az RNS-polimeráz, a géleltolódás és a KMn04-reaktivitás helyreállítását a fentiek szerint végezzük 32. 32 P-jelölt DNS-t állítottunk elő PCR-rel a kódoló szálnak komplementer primer 5'-foszforilezését követően (lásd az S1. Kiegészítő táblázatot), hogy körülbelül 250 bp-os lineáris DNS-darabokat állítsunk elő, amelyek jellemzően a gén első 10 kodonját és 220 bp-t tartalmazzák. DNS-t, beleértve a promoter régiót is. A gélmozgás-elmozdulás (GMSA) vizsgálatokhoz a rekonstituált RNS-polimeráz (18-150 nM) és a DNS (1 nM) között komplexeket képeztünk 15 percig 37 ° C-on K-glu100 pufferben (40 mM HEPES, pH 8,0, 10,10). mM magnézium-klorid, 100 mM kálium-glutamát, 4 mM ditiotreitol (DTT) és 500 ug/ml szarvasmarha-szérum albumin) 10 ul végső reakciótérfogatban. A reakcióelegyet 5% natív poliakrilamid-gélre töltöttük, 2,5 μl heparinnal dúsított 32 töltőpuffer hozzáadása után, és a gélelektroforézist 0,5xTBE pufferben hajtottuk végre 120 V-on. A kísérleteket legalább kétszer hajtottuk végre, és nagyon hasonló eredményeket adtak. .

A KMnO 4 reaktivitási vizsgálatokhoz 50 nM RNS-polimeráz minden formáját (EσS és Eσ 70) kb. 3 nM jelzett promóter DNS-sel inkubáltuk 20 percig 37 ° C-on K-glu100 pufferben, DTT nélkül, hogy komplexet képezzünk. KMn04-et adtunk 10 mM végkoncentrációhoz, és a reakciót 30 másodperc után leállítottuk 2 mM DTT hozzáadásával. A mintákat fenollal extraháltuk és kicsaptuk, 1 mM piperidinnel kezeltük, tiszta kék formamidkékben szuszpendáltuk, mielőtt 7% poliakrilamid denaturáló gélre töltöttük volna. DNS-létra készült minden egyes jelölt DNS-fragmenshez hangyasav és piperidin alkalmazásával, részleges G/A szekvenálással.

Egyéb módszerek

A HPII kataláz aktivitás meghatározását és a Western blot kísérleteket a korábban 51, 52 szerint leírtak szerint hajtottuk végre. Az omrA promóter mutagenezisét a kívánt szubsztitúciókat hordozó mutagén primerekkel rendelkező PCR-termékek előállításával hajtottuk végre, a fentiek szerint. .

További részletek

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Peano, C. és mtsai. Az Escherichia coli σ S magregonjának jellemzése kromatin immunprecipitáció-szekvenálás (ChIP-seq) analízissel. ismétlés. 5., 10469; doi: 10.1038/srep10469 (2015).

További információ

PDF fájlok

További információ

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.