elemeket

absztrakt

nemzetség

A Decalepis fajok földrajzi feltérképezése Indiában. A térképeket a Google Earth 7.1.7.2606-os verziójának (http://www.neowin.net/news/google-earth-pro-7172606) eszközeivel készítették a rögzített GPS-koordináták (Garmin) alapján a gyűjtőhelyeken.

Teljes méretű kép

A vadon élő D. arayalpathra populációk genetikai sokféleségének és populációszerkezetének értékelésére irányuló, a demográfiai vizsgálat és a marker tesztek genetikai adatai alapján végzett nemrégiben végzett vizsgálatunkban kimutattuk az alacsony genetikai sokféleség és a magas genetikai differenciáció előfordulását a populációk között 16. Ezenkívül megállapították, hogy a populációk eloszlása ​​korlátozott és széttöredezett, és romboló betakarítással túlkihasználják őket. A széles specifitás, a darázs károsodása, a szűk populáció állapota, a korlátozott génáramlás és a gombagyökér rothadása mind olyan tényezők, amelyek veszélyeztetik ezt a csoportot természetes élőhelyükön 16, 17. Ez jelzi, hogy el kell ismerni a taxonokat a biológiai sokféleség hotspotjaiban, ami kulcsfontosságú tényező a növényvédelmi előírások érvényesítésében és a fajok jövőbeli védelmében 18 .

Számos kutató eddig értékelte több javasolt plasztid és nukleáris régió kombinációját annak érdekében, hogy átfogó kutatásokat végezzenek taxonómiailag összetett 24, 25, 27, 29, 34, 35, 36 csoportokban. A vonalkód-kutatás jelenleg túlhalad az értékelés ezen szakaszán. A taxonómia faji szintű ismereteket nyújtó gyakorlati alkalmazása mellett ezt a technológiát hatékony eszközként ismerik el, mivel a kereskedelmi fajok számára megkülönböztető hatalmat nyújt (a CITES felsorolt), az igazságügyi és az ökológiai törvényszéki elemzéseket, valamint a fajok azonosítását. ritka faj. veszélyeztetett és veszélyeztetett növénycsoportok 37, 38, 39. A DNS-vonalkódok azon képessége, hogy még egy kis mennyiségű szövetből is azonosítsanak egy fajt (az egész növény helyett, lehetőleg a virágzás fázisában, ahogyan a jelenlegi taxonómiai módszerek megkövetelik), kibővíti a taxonómiai eszközök készletét a veszélyeztetett fajok illegális kereskedelmével.

Az univerzális növényi vonalkód egységes konszenzusának hiányában meg kell határozni az optimális régió (ka) t a érdekes taxonok szerint. A Decalepis nemzetség számára a megfelelő vonalkód megtalálása teljesen hiányzik. Ezért ezt a tanulmányt az első referencia könyvtár létrehozására tervezték, amely a leghatékonyabb vonalkód (oka) t használja a veszélyeztetett és endémiás Decalepis fajok molekuláris azonosságának biztosítására. A DNS vonalkódolási adatokra vonatkozó különböző analitikai megközelítések hatékonyságát értékelik, hogy teszteljék a Decalepis kiválasztott markereinek felbontását. E tanulmány megállapításai, amelyeket a közelmúltban publikált kutatásunkban 16 javasolt populációdinamika is megerősít, értékes eszközöket nyújtanak ahhoz, hogy létrehozzanak egy szabványos protokollt a fajok azonosságának a CITES-végrehajtás során történő katalogizálására és a veszélyeztetett fajok kezelésével kapcsolatos védelmi tervek kidolgozására. ez a csoport.

az eredmény

PCR-amplifikáció és szekvenálás sikere

Asztal teljes méretben

Asztal teljes méretben

Távolságelemzés és vonalkód területek a fajok azonosításához

Vonalkóddiagram öt egyedi vonalkódhoz. A fajonkénti megkülönböztetés céljából ábrázoltuk a Kimura-2 (K2P) által megvalósított maximális intra-specifikus távolságok (%) távolságát a legközelebbi szomszédhoz (NN). Minden pont egy vagy több egyedet képvisel, mivel ugyanazok az intra-specifikus és inter-specifikus távolságok. Az 1: 1 vonal fölötti pontok vonalkód jelenlétét jelzik.

Teljes méretű kép

A vonalkód-hiányosságok értékelése a Decalepis fajok vonalkód-kombinációinak szempontjából. A legközelebbi szomszédhoz (NN) való távolságokat a Kimura-2 paraméter (K2P) maximális intra-specifikus távolságaihoz viszonyítva ábrázoltuk (%). Minden pont egy vagy több egyedet képvisel, mivel ugyanazok az intra-specifikus és inter-specifikus távolságok. Az 1: 1 vonal fölötti pontok vonalkód jelenlétét jelzik.

Teljes méretű kép

A Decalepis fajok filogenetikai elemzése parsimon módszer alapján

A Decalepis fajok közötti evolúciós különbségek becsléséhez távolság (NJ) és karakter (MP) módszereket használtunk a vonalkódok minden területén. A kritériumokon alapuló megközelítés eredményei felülmúlták a távolságon alapuló NJ módszert az egyes fa karakterek kiosztásakor. Mivel az NJ módszerekben a jellemzők olyan távolságokra redukálódnak, amelyek időnként páros összehasonlításban elvesznek és torz távolságokhoz vezetnek, további elemzéseket végeztek az MP modell alkalmazásával a PAUP-ban.

Szigorú konszenzusfa, amely bemutatja a Decalepis fajok kapcsolatát, amely az rbcL + matK + ITS vonalkód segítségével végzett maximális parsimony elemzéséből származik. A fa hossza = 146, CI = 85%, Ri = 91, RC = 78%. A rendszerindítási rendszer 60% alatti értékei nem jelennek meg. A monofill fajoknak megfelelő egyedek: piros: D. arayalpathra, zöld: D. salicifolia, kék: D. hamiltonii .

Teljes méretű kép

Diszkrimináns módszerek és vonalkód-területek összehasonlítása

Asztal teljes méretben

A módszerek összehasonlítása alapján mind a TaxonDNA, mind a BLOG megközelítések átlagosan egyformán jól teljesítettek minden kedvező vonalkódban (mindkettő 75–100% -ban helyes azonosítást nyújtott). Az összes lókusz téves azonosítási aránya azonban 0% volt a TaxonDNA-ban, de 25% a BLOG-ban (3. táblázat, szürke színnel kiemelve). Ezzel szemben a BLOG az eredményül kapott 0% -os egyedeknél "azonosítatlan", míg a

Az egyének 11, 76% -át nem azonosították a TaxonDNA-ban. A Decalepis fajok karakter-alapú megközelítésen alapuló filogenetikai elemzése az egyes fadarabok hozzárendelését is eredményezte. Így a távolság-alapú karakteralapú módszerek alkalmasak a hipotézis tesztelésére.

vita

A vonalkódos régiók hatékonysága a Decalepis fajok molekuláris azonosságának felderítésében

Ez a tanulmány az első publikált kísérlet a veszélyeztetett és veszélyeztetett Decalepis fajok molekuláris filogenitásának leírására. Ez azt mutatja, hogy a vonalkódos markerek pontosan meg tudják különböztetni a fajokat, homogén, nagy felbontású burkolatokat tárva fel fajszinten (4. ábra). A tesztelt plasztid és nukleáris lokuszok közül az ITS volt a leghatékonyabb, mint az egyetlen lokusz a fajok azonosításában a Decalepis-ben (S3. Ábra). Az rRNS-gének magas kópiaszáma, nagyobb diszkriminatív erő alacsony taxonómiai szinten és a magasabb evolúciós ráta az ITS-t ígéretes lokussá teszi a növényi molekuláris rendszerben 40. Az ITS továbbfejlesztett filogenetikai jelzése a Decalepis plasztid vonalkódjelzőihez képest kompatibilis egyebek mellett a Passiflora 41, Euphorbia 42, Paeonia 43 és Melilotus 44 nemzetek szintjén végzett egyéb vizsgálatok eredményeivel.

Mind az rbcL, mind a psbA-trnH vonalkódoknak volt a legalacsonyabb a megkülönböztető ereje, mivel ez az egyetlen olyan lokusz, amely korlátozza azok hasznosságát a Decalepis-ben, annak ellenére, hogy értéket képviselnek más növénycsoportok vonalkódjai számára 20, 24. Mindkét terület nem tudta megkülönböztetni a fajokat, és az így létrejövő filogenetikai fa hatalmas egyedkeveredést mutatott, gyenge kládtámogatással. A lehetséges szubsztitúciót, a H. indicus-ot, a D. hamiltonii és a D. salicifolia egyedekkel csoportosítva, a fa alapján megoldatlannak találtuk (S3. Ábra). A psbA-trnH régió palindrom szekvenciáival kapcsolatos kétértelműség és gyakori inverziók problémáit több orrszármazék sorában találták meg, és valószínűleg megnehezítik vonalkódként való használatát, különösen, ha azok 29 fajon belül fordulnak elő. Az rbcL kloroplaszt régiójának alkalmassága faj-evolúciós molekuláris evolúciós vizsgálatokhoz ellentmondásos volt, részben annak hossza miatt

1430 bp. A fajok egyértelmű megkülönböztetése érdekében szükséges az egész régió szekvenálása, ami korlátozza annak vonalkódsorozatként történő használatát. Az ideális vonalkód-régiónak elég rövidnek kell lennie az amplifikáláshoz, és elemezni kell egy-pass szekvenálással 35. Más vonalkódjelzők hozzáadása azonban javítja a megkülönböztető képességüket, amint azt a korábbi 29., 31., 35., 45. tanulmány megmutatta. .

A kloroplaszt matK kódoló régiója jobb jelölt kódokat képviselt, mint a jelölt vonalkód, nagy szekvencia-helyreállítást és magas fokú azonosítást mutatva akár egyetlen lokuszként, akár az ITS-sel kombinálva. A matK + ITS kombináció a Decalepis teljes testvérfaját keretezte fő klaszterként, a H. indicus külső csoportként a fa tövében található csomóágban helyezkedik el (4. ábra). Az anya kloroplaszt gén nagyobb arányú nukleotid szubsztitúciót mutatott, mint a többi plasztid genomból vizsgált lókusz, ami magasabb interspecifikus divergencia értékeket biztosított a matK szekvenciák között. A két ITS + ITS2 lokusz vonalkód nukleáris kombinációja szintén nagyon hasonló eredményt mutatott, megerősítve a multiklokális konszenzusú vonalkód megközelítés előnyét a növényi DNS vonalkódolásban.

Analitikai módszerek megvalósíthatósága a Decalepis fajok egyértelmű megkülönböztetésének biztosítása érdekében

A $ config [ads_text16] nem található

A TaxonDNA-ban megvalósított három különböző modul ("BM", "BCM" és "Minden típusú vonalkód") közül az rbcL + matK + ITS kombinált vonalkód 15 fajt helyesen azonosított

Vonalkód eszközök alkalmazása a Decalepis védelemben

következtetés

Ez a tanulmány egyértelműen bemutatja a DNS-kódolás hatékonyságát az endemikus fajok azonosításában. A javasolt rbcL + matK + ITS vonalkód aláírási szekvenciái pontos jeleket szolgáltattak a Decalepis fajok molekuláris azonosságának megkönnyítése érdekében, annak legutóbbi taxonómiai felülvizsgálatának megfelelően. A régió egyértelműen a Decalepis testvérfajok teljes halmazát keretezte be fő klaszterként, a külső csoportban a H. indicus potenciális cseréje csomóágként a fa tövében található. A karakter megközelítés a PAUP és a BLOG segítségével sikeresen megkülönböztette a vizsgált minták 100% -át, pontosságuk és megbízhatóságuk lett a választott módszer a DNS vonalkódos vizsgálatokban. A matK kódoló régió kódoló régió szekvenciáiból származó fajspecifikus vizsgálatok tovább erősítik annak értékét a fajok megkülönböztetésének pontos módszerével. A különböző fajspecifikus populációk bevonása várhatóan betekintést nyer a Decalepis hotspot fajok védettségi állapotába, valamint hangsúlyozni fogja a DNS vonalkódolás gyakorlati alkalmazását mint az endemikus és veszélyeztetett növénycsoportok biológiai sokféleségének megőrzését szolgáló eszközt.

Anyagok és metódusok

Taxon mintavétel és etikai nyilatkozat

Tamil Nadu, Kerala és Karnataka különböző földrajzi területeiről három, különböző Decalepis fajhoz tartozó 15 egyedet gyűjtöttek össze. Két egyedet gyűjtöttünk a H. indicus-ból Tamil Naduból és Karnatakából (1. ábra). A mintákat szilikagélen megszárítottuk, és a DNS-kivonás előtt -20 ° C-on tároltuk. Az ebben a vizsgálatban vett egyes fajok utalványmintáit egy herbáriumban tároltuk az Alapítvány a Helyi Egészségügyi Hagyományok Újjáélesztéséért (FRLHT), Bangalore, India és a CSIR-Központi Intézet. Gyógy- és aromás növények (CIMAP), Lucknow, India. a referenciát és a hozzá tartozó részleteket a 2. táblázat tartalmazza.

Molekuláris módszerek

A teljes genom DNS-t referencia mintákból izoláltuk a cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB) 57-es protokoll alkalmazásával. Az izolált DNS minőségét és mennyiségét 0,8% -os agarózgél-elektroforézissel és spektrofotometriás analízissel teszteltük (NanoDrop, ND-1000, USA). A DNS-t végső koncentrációra hígítottuk

25-50 ng/ul PCR-amplifikációhoz. Öt jelölt DNS vonalkód lókuszt amplifikáltunk olyan bevált primerekkel, amelyek a két kódoló cpDNS lókuszt, az rbcL-t és a matK-t tartalmazzák; egy nem kódoló cpDNS intergenikus lokusz távtartó, psbA-trnH és DNS, ITS és ITS2 lokuszok. A primerek és a PCR-körülmények részleteit az SI táblázat tartalmazza. Minden primerkészlet PCR-amplifikációját 50 μl térfogatban végeztük, amely 1x Taq DNS-polimeráz puffert, 200 μM dNTP-t (dATP: dTTP: dCTP: dGTP 1: 1: 1: 1 arányban), egyenként 5-10 pmol mennyiségben tartalmazott. primer (előre és hátra), 1 egység DNS polimeráz Taq a

25-50 ng templát DNS. A sikeres amplikonokat elektroforézissel elemeztük 2% -os agarózgélen. Ezt követően a megcélzott molekulatömegű termékeket Nucleospin PCR tisztító készlettel tisztítottuk a gyártó (MACHEREY-NAGEL - 07/2014, Rev.03) protokoll alkalmazásával, majd elektroforézissel 2% agaróz gélen ellenőriztük. A kapott terméket Sanger di dezoxi szekvenálási reakcióinak vetettük alá, előre és hátra irányban, a BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) alkalmazásával ABI 3130 XL genetikai analizátoron (Applied Biosystems).

Databasing

Az egyes régiókra vonatkozó mintadarabokat a CRCB - „DNS vonalkódolás Decalepisben” (2. táblázat) - projekt keretében az Élet adatrendszereinek vonalkódja (BOLD) 58 (//www.boldsystems.org) tárolta. Minden adat elérhető a BOLD alatt a DS-CRCB adatkészlet alatt (dx.doi.org/10.5883/DS-CRCB). A szekvenciákat a GenBank elé terjesztették, és nyilvánosan hozzáférhetők a 2. táblázatban felsorolt ​​csatlakozási számok alatt.

Adatelemzés

Az egyes területekre kapott elektroferogramokat alapvetően PHRED alkalmazásával hívtuk meg; szekvenciákat állítottunk össze és módosítottunk egy Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA) felhasználásával. Végül a szekvenciákat robbantottuk az NCBI BLAST-ra a BLASTN 2.2.1+ 59, 60 programon belül, majd tovább a BOLD-ra egy azonosítási kérelem segítségével, hogy ellenőrizzük homológiájukat más elérhető szekvenciákkal. Az összes vonalkód-szekvencia több mint 500 bp hosszú volt, és nem volt szennyezett. A módosított szekvenciákat ezután az EMBLEBI weboldalán (//www.ebi.ac.uk) az alapértelmezett paraméterek alatt összehangoltuk a 3.8.31 izommal, és manuálisan módosítottuk a BioEdit v7.1.3.0 61-ben. A szekvenciákat mindkét végén megcsonkítottuk, hogy eltávolítsuk a primer szekvenciákat. Az összes webhelyváltozót az eredeti követési fájlok segítségével ellenőriztük. A megbékélést indokolt kérésre a megfelelő szerzőtől lehet beszerezni. Öt jelölt DNS-vonalkód-lókuszt és azok 26 lehetséges kombinációját, több génes lépésenkénti vonalkódolási megközelítéssel együtt értékeltük a fent leírt módszerek alapján.

Hézagelemzés vonalkódok alapján

Karakter-hozzáférés a BLOG-on keresztül

A vonalkódolás a LOGic-szal (BLOG) egy karaktergép-tanulási megközelítés a BLOG2.0 segítségével a mintaszekvenciák fajokba sorolásához, a 66., 67. diagnosztikai nukleotidok kulcs DNS-vonalkódjainak elhelyezésére vonatkozó osztályozási szabályok segítségével. A mellékelt képzési adatkészlet alapján megfogalmazza a besorolási szabályokat, majd ugyanazokat alkalmazza a képzési készletre és a tesztkészletre az azonosítás sikerének becsléséhez. Az ebben a vizsgálatban használt különféle vonalkód-adatsorokat 90% -os fajszeletelésnek vetettük alá, legfeljebb 500 iterációval (GRASPITER = 500) és legfeljebb 5 perc analitikai idővel (GRASPSECS = 300). Az azonosítás alapjául a referenciaadathoz képest a legalacsonyabb hamis pozitív arányú logikai képletet használtuk.

Filogenetikai fák távolságon és karakteren alapuló módszerekkel

A faj diszkrét kládokba vagy monofiletikus csoportokba történő meghatározásához filogenetikai elemzést végeztünk a vizsgált adathalmazokon. A szekvencia adatok fejlesztési folyamatát távolságon és karakteren alapuló módszerek alapján értékelték. A szekvenciák közötti evolúciós távolság kiszámításához a minimális evolúció (NJ) klaszterezés algoritmusát szomszédos kapcsolással alkalmaztuk. Az NJ fákat a PAUP 4.0 68-ban állítottuk össze K2P távolságok alapján genetikai mérésként, és negatív ághosszakat állítottunk nullára.

A karakteralapú megközelítések közül a maximális parsimone (MP) módszert alkalmazták a szekvenciák közötti evolúciós események legvalószínűbb történetének meghatározására. Az MP elemzést PAUP 4.0-ban HKY-gamma szubsztitúciós modellel végeztük, hogy figyelembe vegyük a helyek közötti sebesség változását. A kezdeti heurisztikus keresést 1000 replikával végeztük el, és az ágcserét fa-bisection-reconnection (TBR) alkalmazásával hajtottuk végre. Minden lépésben legfeljebb 10 fát tartottak, véletlenszerű, egymást követő összeadásokkal a kezdő fához minden ismétlésben. Az első forduló fáit egy második kutatásnak vetették alá, akár 15 000 fa kapacitású TBR cseréjével és teljes cserével. A csomópont megbízhatóságát egy bootstrap teszttel értékeltük, 1000 pszeudo-replikátummal 69, 70, 71. A H. indicust használták outgroupként minden módszerhez.

Az adatok elérhetősége

GenBank (NCBI) [//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank] A nukleotidszekvenciák hozzáférési számait a 2. táblázat tartalmazza. A szekvencia igazítást a BOLD projektben archiváltuk [//www.boldsystems.org] DS-CRCB (dx.doi.org/10.5883/DS-CRCB).

köszönöm

A szerzők hálásak a CSIR-CIMAP rendezőnek, Lucknow-nak, a biztatásért és a tanulmányi laboratóriumi létesítmények biztosításáért. Pénzügyi támogatás a tudományos és ipari kutatási tanácstól (CSIR), Új-Delhi, India XII-ig. A FYP Biopros-PR (BSC-0106) és a ChemBio (BSC-0203) projekteket hálásan elismerjük.

Elektronikus kiegészítő anyag

Karakter alapú vonalkód az IUCN hitelesítéséhez és megőrzéséhez A Decalepis nemzetség veszélyeztetett fajai (Apocynaceae) \ t

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.