elemeket

absztrakt

Csoportunk korábban szoros összefüggést mutatott a megnövekedett plazma CD13 enzimaktivitás és az újonnan diagnosztizált extenzív krónikus GVHD (cGVHD) között gyermekeknél. Mivel a citotoxikus anti-CD13 Abs-t vér és csontvelő-transzplantáció (BMT) után dokumentálták CMV és cGVHD fertőzéssel összefüggésben, feltételeztük, hogy az oldható CD13 hozzájárul a cGVHD patogeneziséhez azáltal, hogy indukálja a CD13 reaktív Abs-t, és hogy az anti-CD13 Abs lehet további biomarkerek az újonnan diagnosztizált kiterjedt cGVHD-vel. A cGVHD-s BMT-t (allo-BMT) és a cGVHD nélküli kontrollokat tartalmazó, gyermekkori allogén, prospektív módon összegyűjtött plazmaminták felhasználásával egy nagy terápiás vizsgálatba bevonták a cGVHD gyermek onkológiai csoport számos intézményével, és megvizsgáltuk, hogy az oldható CD13 korrelál-e az anti-CD13 Abs indukcióval . Megállapítottuk, hogy a CD13 reaktív Ab a betegek arányában van jelen az allo-BMT után, de úgy tűnik, hogy nem korrelál az oldható CD13 jelenlétével. Az anti-CD13 Abs szintén nem felelt meg a kritériumainknak, mint a cGVHD diagnosztikai biomarkere. Ezek az adatok nem erősítik meg, hogy a CD13-reaktív Abs indukciója a gyermekeknél a cGVHD mechanizmusa, és nem is része a megnövekedett oldható CD13-hoz társuló cGVHD patogenezisének. A CD13 pontos szerepét a cGVHD-ban még meg kell határozni.

Anyagok és metódusok

elemeket

A perifériás vérmintákat összegyűjtöttük és prospektív módon értékeltük az ASCT0031 gyermek onkológiai klinikai vizsgálatba beiratkozott alanyoktól, egy randomizált, placebo-kontrollos, kettős-vak, III. Fázisú vizsgálatban, amely két kezelési rendet értékelt újonnan diagnosztizált kiterjedt cGVHD-s gyermekgyógyászati ​​betegeknél, a fent leírtak szerint. Az ASCT0031-be bevont és kezelt 7 beteg kísérleti csoportot alkotott (n = 52). Az allo-BMT utáni immunkonstitúció szabályozásához cGVHD-s alanyokhoz idő-egyeztetett összehasonlítást végeztünk a kontroll csoporttal (n = 28), a cGVHD diagnózisának időpontjában az allo-BMT utáni napokat használtuk a kísérleti csoport kezdeti felosztására. cGVHD transzplantáció) vagy a cGVHD késői megjelenése (

9 hónappal a transzplantáció után), és összehasonlították a BMT nélküli kontroll betegekkel, akiknek cGVHD-ja nem volt 6 (korai) és 12 hónapos (késő) BMT után. Összehasonlításképpen értékelték a nem transzplantált véradók (n = 6) egészséges önkéntes kontrollját.

Értékelt minták

A perifériás vért cGVHD-s betegekből gyűjtöttük be a vizsgálatba való belépéskor (a cGVHD diagnosztizálásának időpontja), valamint a kontroll alanyoktól a 6. és 12. hónapban (transzplantáció után). A mintát centrifugálás után sejtekre és plazmára választottuk, és -80 ° C-on tároltuk. A fagyasztott plazmát 37 ° C-os vízfürdőben felolvasztottuk és ultracentrifugáltuk (15 000 fordulat/perc 5 percig), hogy felhasználásra kész állapotban eltávolítsuk a csapadékot. A biomarkerek 7 korábbi elemzését követően a betegek egy részének nem maradt megfelelő plazma térfogata az anti-CD13 Ab elemzéséhez, és nem vették őket bele az elemzésbe. Megfelelő plazma állt rendelkezésre az anti-CD13 Ab elemzéséhez (45 cGVHD minta és 26 ELISA kontroll; 42 cGVHD minta és 23 Cellomics kontroll, Pittsburgh, PA, USA).

Oldható CD13 (aminopeptidáz N) enzimatikus vizsgálat

A plazmamintákból megvizsgáltuk az oldható CD13 (aminopeptidáz N) aktivitást a fent leírtak szerint. Az oldható CD13 aktivitás eredményeit, amelyeket a 7. csoportunk publikált, az anti-CD13 Abs elleni korrelációs vizsgálatokhoz használtuk.

ELISA anti-CD13-hoz

Cellomika anti-CD13-hoz

A mintákat (30 μl) 1: 5 arányban hígítottuk PBS-ben (120 μl), és nem transzfektált egér hemangioendothelioma endothel sejteket (EOMA sejtvonal) tartalmazó 96 lyukú lemezekre adtuk, és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk a nem specifikus kötődés csökkentése érdekében. A lemezeket centrifugáltuk (800 fordulat/perc 5 percig), és 100 μl felülúszót gyűjtöttünk. A felülúszót 96 lyukú lemezekre adtuk, amelyek humán CD13 Ag-t expresszáló, plazmiddal transzfektált EOMA sejteket tartalmaztak, és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A lyukakat ezután háromszor PBS-sel mostuk, és FITC-konjugált egér anti-humán Ig-t (specifikus az emberi IgG-re) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Kanada) adtunk hozzá, 30 percig inkubáltuk, és PBS-sel mostuk. A MoAb WM15-et használtuk pozitív kontrollként (1:50 hígítás 2 μl WM15 és 98 μl PBS alkalmazásával) és MoAb izotípusú IgG 1 egeret (Ancell, Bayport, MN, USA) negatív kontrollként, majd FITC-konjugált anti- egér IgG 1. HOECHST 33342 festéket (Sigma-Aldrich) 1 ug/ml koncentrációban alkalmaztunk az EOMA sejt DNS kimutatására. Az egyes üregek FITC intenzitását az ArrayScan Reader 4.5 (Cellomics) alkalmazásából leolvastuk, és az anti-CD13 Abs markereként alkalmazott sejtenkénti átlagos FITC intenzitást.

Statisztikai analízis

A fentiek szerint az anti-CD13 Abs biológiailag és klinikailag relevánsnak tekinthető, ha a következő két kritérium teljesül: (1) 100% -kal magasabb vagy 50% -kal alacsonyabb a kontrollhoz képest (± 5%) és (2) statisztikai szignifikancia P-értékkel 7 érték Leíró statisztikát állítottunk elő az összes adatról a Prism 5. verziójával PC-hez (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA) vagy az SPSS-hez (15.0 verzió, Chicago, IL, USA). A megfigyelt változások szignifikanciáját Student t-próbájával és a kifejezett különbség 95% -os konfidencia intervallumával határoztuk meg. Minden P érték

krónikus

Az anti-CD13 Abs összehasonlítása ( a ) ELISA a ( b ) Cellomika az alanycsoportok között (P = NS az összes esetében). Az ELISA a sertés CD13-ját használta Ag-ként és OD-ként a relatív anti-CD13 Ab méréséhez. A cellómás vizsgálatban humán CD13-t használtak Ag-ként és sejtenként az átlagos FITC intenzitást a relatív anti-CD13 Ab mérésére.

Teljes méretű kép

A cGVHD-ból és a Cellomics-tesztből származó kontrollmintákból származó egyes mintákban magas volt az anti-CD13 szintje az egészséges önkéntesekhez képest (1b. Ábra). Pozitív anti-CD13-cut-off-ot használva, mint egészséges önkéntesek átlagos sejtenkénti FITC intenzitása plusz 2 sd, nem találtunk szignifikáns különbséget a pozitív anti-CD13 Abs-ben a korai cGVHD (14/32, 44%) és a korai kontroll között (5/5) 22, 23%) (különbség 21%; 95% konfidencia intervallum: -3,5 és + 45,6%). Hasonlóképpen nem volt szignifikáns különbség a késői cGVHD-ban (10-ből 7, 70%) a késői kontrollokhoz képest (12-ből 5, 42%) (különbség 28%; 95% konfidencia intervallum: -11,5 és + 68,1%). Nem találtak összefüggést az anti-CD13 Abs (pozitív vagy negatív) és a kórelőzményben szereplő akut GVHD között, valamint a cGVHD érintettségének semmilyen specifikus helye (bőr, orális, szemi, gyomor-bélrendszeri, máj-, tüdő- vagy mozgásszervi) (az adatokat nem mutatják).

Az anti-CD13 Abs korrelációja az sCD13 aktivitással

Annak értékelésére, hogy az oldható CD13 korrelál-e az anti-CD13 Ab indukcióval, korrelációanalízist végeztünk a Cellomics és az oldható CD13 enzimaktivitás adatainak felhasználásával. Nem volt összefüggés az oldható CD13 enzim és az anti-CD13 Ab aktivitásával (2. ábra; r értékek: 0, 03, -0, 06, -0, 34 és 0, 15 a korai cGVHD, a korai kontrollok, a késői cGVHD és késői ellenőrzések).

Az anti-CD13 Ab szintek összehasonlítása Cellomics sejtekben sCD13 aktivitással ( a ) cGVHD ( b ) α-BMT, de nem cGVHD (a BMT után 6 hónappal gyűjtött vér; korai kontrollok) ( c ) a cGVHD késői megjelenése ( d ) allo-BMT, de nem cGVHD (12 hónappal a BMT után gyűjtött vér; késői kontrollok).

Teljes méretű kép

vita

Miután nemrégiben bebizonyosodott, hogy az oldható CD13 erősen korrelál az újonnan diagnosztizált extenzív cGVHD-vel a gyermekeknél, 7 kombinálva az anti-CD13 Abs és a BMT utáni CMV-fertőzés 11 és cGVHD 12 korábban azonosított kapcsolatával, megkíséreltük meghatározni, hogy az oldható CD13-indukált CD13 reaktív-e Abs. mint a cGVHD alapját képező mechanizmus. Elemzésünk azt mutatja, hogy az oldható CD13 nem járul hozzá a cGVHD patogeneziséhez a CD13-reaktív Abs indukcióján keresztül, és az anti-CD13 Abs biomarkerek sem az extenzív cGVHD számára.

Az anti-CD13 Abs prevalenciánk (23-70%) megegyezett az anti-CD13 Abs (45%) korábbi jelentéseivel a BMT után. Ebben a korábbi vizsgálatban az anti-CD13 Ab-ot csak CMV virémiával vagy betegséggel mutatták ki. Vizsgálatunkban a donor/recipiens CMV és CMV fertőzés szerológiai adatait nem gyűjtöttük össze, ami lehetetlenné tette az anti-CD13 és a CMV fertőzés kapcsolatának értékelését. Az anti-CD13 semlegesíti a CMV fertőzést azáltal, hogy kölcsönhatásba lép a virionhoz társított CD1316-tal, és ezek az Abs-ek megjelennek a CMV detektálásával. Ezért az anti-CD13 Abs jelenléte összefüggésben lehet az allo-BMT utáni CMV reaktivációval, szemben a cGVHD-val.

A cGVHD-ban megnövekedett oldható CD13 mechanizmusa továbbra sem tisztázott. A membránhoz kötött CD13 kiterjedten expresszálódik számos szövettípuson, beleértve a cGVHD által érintetteket is. A 9., 10. oldható CD13 az intenzív szövetgyulladás nem specifikus mellékterméke lehet. Alternatív megoldásként az aminopeptidáz N-t számos professzionális APC-n expresszálják az MHC II molekulákkal, és az MHC II. Osztályba kötött peptidek NH2-terminális szekvenciájának mintázata befolyásolhatja az Ag in vivo folyamatát. 18.

Végül bebizonyítottuk, hogy a cGVHD-ban oldódó CD13 nem indukálja az anti-CD13 Abs-t, bár az allo-BMT után egyes alanyokban Abs vannak jelen. A CD13 mechanizmusa a cGVHD patogenezisében továbbra sem tisztázott, de magában foglalhatja a T-sejtek gyulladásos válaszainak közvetítését.