- elemeket
- absztrakt
- a cél:
- mód:
- az eredmények:
- következtetés:
- bevezetés
- Anyagok és metódusok
- elemeket
- Egér fehér zsírszövet-expressziós vizsgálatok
- Az emberi fehér zsírszövet frakcionálási és expressziós vizsgálata
- Az elsődleges preadipociták tenyészetei
- 3T3-L1 preadipocita sejtvonalak generálása, tenyésztése és differenciálása
- RNS izolálás és kvantitatív reverz transzkripció PCR
- Fehérjekivonás és Western-blotolás
- Wnt-TCF4/LEF riporter teszt
- Statisztikai analízis
- az eredmény
- Az SFRP1 gén expressziója az embereknél és egereknél fokozódik az adipogenezis során
- Az SFRP1 overexpresszió elősegíti az adipogenezist a 3T3-L1 preadipocytákban a Wnt/β-catenin-függő jelátvitel gátlásán keresztül.
- Sfrp1 szabályozott in vivo táplálkozási és anyagcsere-állapot
- Az SFRP1 expressziója emberi zsírszövetben
- vita
- További információ
- Word dokumentumok
- További online kiegészítés
elemeket
- Sejtjelzés
- különbségtétel
- Metabolikus szindróma
- Elhízottság
absztrakt
A Wnt/ß-catenin jelátviteli hálózat potenciális célpontokat kínál az elhízás diagnosztizálására és elválasztására metabolikus szövődményeitől. Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a Wnt, a szekretált garnéla-kapcsolódó fehérje 1 (SFRP1) antagonistájának szerepét az in vitro adipogenezis és a zsírszövet-expanzió elősegítésében.
mód:
Humán és egér kombinációja, az adipogenezis, a zsírszövet-expanzió és az elhízással összefüggő metabolikus szindróma in vivo és in vitro modelljei felhasználják az SFRP1 érintettségének profilját.
az eredmények:
Az SFRP1 mind egér, mind humán érett adipocitákban expresszálódik. Az SFRP1 expresszió in vitro az adipogenezis során indukálódik, az SFRP1 előnyösen érett adipocitákban expresszálódik az emberi zsírszövetben. Az SFRP1 konstitutív méhen kívüli expressziója proadipogén és gátolja a Wnt/β-catenin jelátviteli utat. A zsíros SFRP1 in vivo endogén szintjét a proadipogén körülményeknek megfelelően szabályozzák. Nagy zsírtartalmú egerek longitudinális vizsgálata során azonban az endogén SFRP1 dinamikus időbeli, de kétfázisú szabályozását figyeltük meg. Ezzel a profillal összhangban megfigyeltük, hogy az SFRP1 expressziója az emberi szövetekben enyhén elhízott betegeknél a legmagasabb, és kórosan elhízott egyéneknél fokozatosan csökken.
következtetés:
Eredményeink arra utalnak, hogy az SFRP1 a Wnt/β-catenin szignalizáció endogén modulátora, és részt vesz az emberi adipogenezis parakrin szabályozásában. Az SFRP1 csökkent zsír-expressziója kóros elhízásban és annak a zsírszövet további terjeszkedését megakadályozó hatásuk hozzájárulhat az anyagcsere-szövődmények kialakulásához ezeknél az egyéneknél.
Az elhízás a krónikus betegségek, például a szív- és érrendszeri betegségek, a II-es típusú cukorbetegség, az érelmeszesedés és az úgynevezett metabolikus szindróma kialakulásának nagyobb kockázatával jár. 1, 2 A közvélemény tudatosságának javítása, az életmódváltást elősegítő politikák és az energiaegyensúlyt szabályozó mechanizmusok feltárásának tudományos sikere ellenére az elhízás gyakorisága tovább növekszik. A jelenlegi jóslatok szerint az elhízási járványt a pusztító kardiovaszkuláris szövődmények második hulláma követi. Ezért az elhízás kezelésére irányuló erőfeszítésekkel párhuzamosan egy gyakorlatiasabb megközelítés azt sugallja, hogy az erőfeszítéseknek az elhízás és a kardiometabolikus szövődmények elkülönítésére kell összpontosítaniuk.
Noha látszólag ellensúlyozzák az intuíciót, a stratégiák, amelyek növelik a zsírszövet lipidek tárolási képességét, és ezért növelik az egyéni elhízást, metabolikus előnyökkel járhatnak. Ha lehetővé teszi a zsírszövet több lipid tárolását, megelőzhetőek a nem zsírszervekben lévő lipidek tárolása által okozott másodlagos metabolikus szövődmények. A jó zsírszövet-terjeszkedés koncepcióját alátámasztja az a látszólagos paradoxon, miszerint a zsírszövet-hiány lipodystrophiához vezet, és ez is összefoglalja a metabolikus szindróma számos jellemzőjét. Összességében valószínű, hogy van egy optimális tartomány a test zsírszövetének teljes tömegéhez, amelyen túl metabolikus rendellenesség alakul ki. Ebben a tekintetben az elhízással járó metabolikus szindróma kialakulására való hajlam kulcsfontosságú tényezője lehet a zsírszövet tágulása és az energiafelesleg-tárolás szükségleteihez való alkalmazkodása. 1., 2., 3., 4. A titrált zsírszövet-tágulási folyamatot vezérlő jelátviteli tényezők megértése tehát a metabolikus szindróma megelőzésére és kezelésére szolgáló hatékony terápiák tervezésének ésszerű megközelítésének alapja. 5.
A szekretált Wnt növekedési faktorok családja parakrin és/vagy autokrin módon hat, és ismert, hogy szabályozza az adipocita differenciálódást. A 6, 7, 8, 9 Wnt jelzés egy kifinomult, szabályozott hálózaton alapul, amely a kontextustól függően képes kontextus szerinti választ adni. Röviden, a specifikus Wnt-fehérjék kötődése a hullámosított receptorokhoz intracelluláris jeleket vagy β-catenin-függő, vagy β-catenin-független útvonalakon keresztül transzdukál. Noha mindkét út aktív lehet a preadipocitákban10, ez az első, amelyet legjobban jellemeznek, és kimutatták, hogy erősen gátolja az adipogenezist in vitro és in vivo. 8, 9 A β-catenin-függő útvonalon a receptor aktiválása stabilizálódáshoz és a citoszolos β-catenin felhalmozódásához vezet. A Β-katenint ezután transzlokálják a sejtmagba, ahol kötődik és aktiválja a limfoid enhancer/T-sejt specifikus transzkripciós faktor (LEF/TCF) specifikus transzkripciós faktorokat. A Wnt/TCF célgének közé tartozik a ciklin D1, Id2 és c-myc, amelyek gátolják az adipogenezist. 11, 12
Anyagok és metódusok
elemeket
SFRP1 expresszió az adipogenezis során emberekben és egerekben. a ) A humán SFRP1 mRNS szintjét, 18S rRNS szintre normalizálva, valós idejű RT-PCR-rel mértük az elsődleges humán (A csoport) SVF kultúrák jelzett differenciálódási óráiban. * P ** P *** P ** P * P ** P * P ** P *** P 23 Az ebben a vizsgálatban használt összes állati protokollt az Egyesült Királyság Belügyminisztériuma és a Cambridge-i Egyetem hagyta jóvá.
Az emberi fehér zsírszövet frakcionálási és expressziós vizsgálata
A humán adipociták és a preadipociták izolálását az A. csoport alanyaiból nyert mintákon hajtottuk végre, amint azt korábban leírtuk. Röviden, a zsírszövet biopsziákat foszfáttal pufferolt sóoldatba (Sigma-Aldrich, Dorset, Anglia) helyeztük és 30 percen belül feldolgoztuk. A mintákat óvatosan felkockáztuk és emésztettük kollagenáz-oldatban (Hank kiegyensúlyozott sóoldata, amely 3 mg ml-1 típusú II típusú kollagenázt (Sigma-Aldrich) és 1,5% szarvasmarha-szérum albumint tartalmaz) 1 órán át 37 ° C-on. Ezt követően az emésztési oldatot rozsdamentes acél hálón átszűrjük, és 400 g-nál 5 percig centrifugáljuk, hogy az érett adipocitákat elválasszuk a sztrómás vaszkuláris sejtektől.
Az elsődleges preadipociták tenyészetei
Az emberi preadipociták izolálásához humán zsírszövetmintákat nyertünk az A csoportba tartozó alanyoktól, az egér primer preadipocitákat izoláltuk a 6 hetes hím C57B/6 egerek epididimális fehér zsírszövetéből (WAT), a korábban leírtak szerint. Az emberi és az egér primer tenyészeteit az összefolyás után 3 nappal differenciálásra indukáltuk Dulbecco módosított Eagle táptalajának/F12 sonkájának 33 μmol 1 -1 biotinnal, 17 μmol -1 pantoténsavval, 10 μg ml -1 apotranszferrinnel, 0,2 nmol l - 1 hozzáadásával. trijód-tironin, 100 nmol 1 -1 kortizol és 500 nmol 1 -1 inzulin. A tenyésztés első 3 napja alatt 0,25 mmol 1-1-metil-3-izobutilxantint (IBMX) is adunk a táptalajhoz. A differenciáló táptalajt az első lehetőségnél 3 nap múlva, majd 2 naponta cseréltük.
3T3-L1 preadipocita sejtvonalak generálása, tenyésztése és differenciálása
RNS izolálás és kvantitatív reverz transzkripció PCR
Az RNS előállítását, a reverz transzkripciót és a valós idejű TaqMan PCR körülményeket a reverz transzkripcióhoz a korábban leírtak szerint hajtottuk végre: lásd Christodoulides et al. 12 és Lagath et al. 23 az A csoport esetében, Ortega et al. 21 a B csoport és Pietilainen és mtsai. A primereket és a próbákat vagy Perkin Elmer-től (Cambridge, Egyesült Királyság) vásároltuk, vagy pedig a Primer Express szoftver (Applied Biosystems, Cheshire, Egyesült Királyság) és a GenBank adatbázis szekvenciáinak felhasználásával terveztük meg.
Fehérjekivonás és Western-blotolás
A fehérjék Western-blot-analízise előtt a táptalajt eltávolítottuk, és a sejt egyrétegeket jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal mostuk, majd folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. Ezeket jégen felolvasztottuk és lízispufferbe kapartuk, a fent leírtak szerint, 4 ° C-on. A fehérjéket nitrocellulóz membránra elektroblotoltuk (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). A specifikus fehérjéket megfelelő primer antitestekkel és torma-peroxidázzal konjugált szekunder antitestekkel történő inkubálás segítségével detektáltuk. Az immunkomplexeket fokozott kemilumineszcenciával detektálták (Amersham Biosciences).
Wnt-TCF4/LEF riporter teszt
A TCF4 riportervizsgálathoz az SFRP1 sejteket és az üres vektor (EV) 3T3-L1 összefolyásig növesztettük, és a Topflash-riporter promóter-riporter vizsgálatokat a korábban leírtak szerint hajtottuk végre. 12.
Statisztikai analízis
Az SFRP1 overexpresszió elősegíti az adipogenezist a 3T3-L1 preadipocytákban a Wnt/β-catenin-függő jelátvitel gátlásán keresztül.
Az SFRP1 a Wnt/β-catenin antagonistája a 3T3-L1 adipocitákban. A preadipocitákat egy retrovírussal fertőztük meg, amely egyedül emberi SFRP1-et vagy vektort (EV) hordozott. a ) Az SFRP1 mRNS szintjét 18S rRNS szintre normalizálva valós idejű RT-PCR-rel mértük a 0. és a differenciálódás napján az SFRP1 és EV expresszáló sejtekben. * P *** P * P ** P *** P -1) 48 órán át. Az eredményeket az EV-hez viszonyított különbség többszöröseként fejezzük ki. Az eredményeket három példányban végzett legalább három független kísérlet átlagának ± sem értékeként adjuk meg. * P ** P
Az SFRP1 elősegíti az adipogenezist a 3T3-L1 preadipocytákban. ( a ) Az SFRP1 és az EV 3T3-L1 sejteket szubmaximális körülmények között differenciálták vagy sem (-): önmagában az IBMX (M) vagy dexametazon és inzulin (DI), vagy teljes differenciálódási koktéllal (MDI). A sejteket Oil Red-O-val festettük a lipidcseppek láthatóvá tétele érdekében 8 nappal az indukció után. A festést 540 nm-en számszerűsítettük, és az EV (-) százalékában fejeztük ki. * P *** P * P ** P
Az Sfrp1-et táplálkozási jelek, genetikai elhízás és metabolikus állapot szabályozza in vivo. A 18S rRNS-re normalizált Sfrpl mRNS-szinteket a ( a ) az epididymális zsírszövetben és ( b ) érett adipociták 8 hetes hím C57/B16 egerekből, amelyeket a következő körülmények között stimuláltunk: tápláltuk (n = 8-9), éheztettük (24 óra) (n = 7-8) és éheztettük (24 óra) (n = 7–8). * P ** P *** P ** P *** P * P 23 Ennél is fontosabb, hogy ez a zsírszövet-nyújthatóság növekedése jelentősen megnövekedett Sfrp1-szinttel társult (4f. Ábra).
Összességében ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy az in vivo WAT Sfrp1 mRNS szintje megemelkedik, ha igény van a zsír tárolására és a zsírszövet kiterjesztésére; az új adipocita-toborzás és -érés elősegítésében in vitro betöltött szerepével összhangban álló megállapítás. Az Sfrp1 növekedése azonban nem tűnik fenntarthatónak a pozitív kalóriaegyensúly és a zsírraktározási igény fenntartása ellenére. Ez arra utal, hogy az SFRP1 hasznos marker lehet, és alátámasztja egy felső fiziológiai határ létezését, amelyen belül a zsírraktárak kibővíthetik és felhalmozhatják a lipideket. Érdekes módon az Sfrp1 szintjének csökkenése 6 hónapos HFD után a metabolikus szövődmények kialakulásával jár.
Az SFRP1 expressziója emberi zsírszövetben
Az SFRP1 szabályozása az emberi zsírszövetben. a ) Az SFRP1 mRNS szintje, ciklofilin A-ra normalizálva, 31 fehér európai nő szubkután zsírszövetében (B csoport). Minden alany esetében a BMI-határértéket a WHO osztályozás (BMI 40, n = 12) alapján határozzák meg. A varianciaanalízis (ANOVA) nem érte el a statisztikai szignifikanciát, P = 0, 059. ( b ) SFRP1 A mikroray expressziót 13 pár monozigóta iker szubkután zsírszövetében mértük, akik nem értettek egyet a tömegben (C csoport). Páros t-teszt, ** P = 0,005.
Teljes méretű kép
vita
Csoportunk másokkal együtt korábban kimutatta, hogy a Wnt/β-catenin jelátviteli út szabályozhatja az adipogenezist in vitro és in vivo (áttekintve Prestwich és Macdougald 8 és Christodoulides et al. 9). Ezen tanulmányok közül sok a Wnt/β-catenin szignálkomponensek genetikai és/vagy farmakológiai manipulálására összpontosított egérmodellekben. A közelmúltban azonban arra törekedtünk, hogy ezt a kutatást kibővítsük, hogy jobban megértsük az endogén Wnt szignalizáció szerepét a rágcsálók és az emberek zsírszöveti plaszticitásában. Nemrégiben bevezettük a táplálkozással szabályozott Dact1 preadipocita gént, amely az adipogenezist a génexpresszióra gyakorolt koordinált hatásokon keresztül segíti elő. Ez szelektív változáshoz vezet mind a Wnt/β-catenin jelátviteli út intracelluláris, mind parakrin/autokrin komponenseiben. 23 Ezenkívül a Wnt/β-catenin jelátviteli hálózat expressziója és aktivitása összefüggéstől és fajtól függ, sőt, egyes komponensek, például a Dkk1, úgy tűnik, hogy az emberi zsírszövetben, de egérmodellekben nem. 12.
Itt megmutatjuk, hogy az SFRP1 a Wnt/β-catenin szignalizáció fontos extracelluláris modulátora is lehet, és maga az adipogenezis és az adipozitás során szabályozott. Megmutattuk, hogy az SFRP1 dinamikusan szabályozott mind az emberi, mind az egér adipogenezise során, és elősegíti az adipocita differenciálódást in vitro. Az SFRP1 proadipogén szerepe összhangban van a nulla SFRP1-es egerek csökkent zsírosodásával. Ennél is fontosabb, hogy bizonyítékokat is szolgáltatunk arról, hogy az endogén SFRP1 akutan fel van-szabályozva az ismételt beadás és a rövid távú HFD in vivo reakciójaként WAT-ban. Ez az SFRP1-t erős jelöltvé teszi, amely hozzájárul a titrált zsírszövet-válaszhoz a rövid távú táplálkozási kihívásokra. Adataink azonban azt a gondolatot is alátámasztják, hogy ugyanaz a homeosztatikus rendszer, amely szabályozza a zsírszövet tágulását és működését, korlátozott, és kudarcot vallhat a krónikus táplálékfeleslegben, mint a kóros elhízásban. A zsírszövet tömegének megállapított határa mellett kimerül a zsírszövet további terjeszkedésének képessége, ami véleményünk szerint az elhízással járó metabolikus szövődményekhez vezet.
Annak ellenére, hogy az in vitro és in vivo adipogenezis során a Wnt/β-catenin szignalizációnak megalapozott szerepe van, fontos szempont, amelyet kevésbé jellemeznek, az, hogy ugyanazok a jelek szerepet játszanak-e az emberi zsírszövet tömegének szabályozásában. Megmutatjuk, hogy az endogén SFRP1 az emberi zsírszövetben is szabályozott, és hogy túlnyomórészt az adipocitákban expresszálódik. Keresztmetszeti vizsgálataink azt is sugallják, hogy az SFRP1 expressziónak kétfázisú profilja lehet az emberi zsírszövetben, hasonlóan a rágcsálóknál megfigyelthez. Különösen a humán zsír SFRP1 expressziója növekszik az enyhe elhízást mutató személyeknél (BMI 25 kg m-2 és 30 kg m-2 között), majd a kóros elhízás felé történő fejlődés során fokozatosan csökken. Nyilvánvaló, hogy ennek a modellnek az emberekben történő teljes validálása prospektív vizsgálatot igényel, ami jelenleg nem kivitelezhető.
Elhízott inzulinrezisztens körülmények között a zsírszövet lokalizált gyulladása lép fel, ami segíthet korlátozni a zsírszövet további terjeszkedését. Valójában mi és mások kimutattuk, hogy az inzulinrezisztens körülmények között fellelhető gyulladásgátló citokinek károsíthatják az adipogenezist azáltal, hogy konvergálnak a Wnt/β-catenin szignalizációval. 11, 26 Emellett bizonyíték van az emberi elhízás csökkent adipogén képességére is. Az elhízás inzulinrezisztens állapotában talált megemelkedett gyulladásos citokinek magyarázatot adhatnak a 6 hónapig HFD-vel táplált C57B16 egerekben talált csökkent SFRP1 szintre. Ennek a kapcsolatnak az emberi WAT-ban való megerősítéséhez szükséges lenne kezeletlen és/vagy kontrollálatlan cukorbetegségben szenvedő, súlyosan elhízott betegek zsírszövetéhez való hozzáférés. Ez azonban nem zárja ki annak lehetőségét, hogy a kóros elhízásban észlelt SFRP1 látszólag "normális" szintjét aránytalanul alacsonynak kell tekinteni ezen egyének zsírbővülésének mértékét tekintve. E tekintetben ezek a nem megfelelő SFRP1-szintek tükrözhetik azt a biológiai határt, amelyig ezek az egyének kibővíthetik zsírraktárukat.
Az SFRP1 feltételezett szerepe a zsírszövet plaszticitásában.
Teljes méretű kép
Összefoglalva, meghatároztuk és jellemeztük az SFRP1, a Wnt jelátvitel szekretált inhibitorának, a zsírszövet nyújthatóságának meghatározó szerepét. A nagyobb kohorszokat használó jövőbeni vizsgálatok bizonyítékot szolgáltathatnak az elhízással járó metabolikus szövődmények kockázatának indikátoraként való hasznosságára. Adataink együttesen alátámasztják a maximális zsírszövet-tágulási képesség koncepcióját, és tovább utalnak a Wnt-jelzésre, mint a zsírszövet-nyújthatóság fontos modulátorára, potenciális terápiás felhasználással az elhízáshoz kapcsolódó metabolikus szövődmények kezelésében.