elemeket

absztrakt

Több mint 40 évvel ezelőtt Rothwell, Stock és munkatársai kimutatták, hogy az alacsony fehérjetartalmú étrend növeli az energiafelhasználást (EE) 1, 2. A Stock Lab későbbi munkája azt mutatta, hogy az LP-diéták mind az BAT-ban, mind a WAT ​​3-ban fokozzák az Ucp1 génexpressziót, ami azt jelzi, hogy az UCP1-függő termogenezis hozzájárult az EE növekedéséhez. A közelmúltban laboratóriumunk endokrin mechanizmust biztosított az EE ezen fehérje-függő szabályozásának magyarázatára, mivel bebizonyítottuk, hogy az LP-diétákhoz az FGF21 hormonra van szükség az EE és az Ucp1 expressziójának fokozásához, valamint az ételbevitel és a súlygyarapodás megváltoztatásához 4, 5. Ezek az adatok összhangban állnak azzal a bizonyítékkal, hogy az FGF21 farmakológiai kezelése az agyban és közvetlenül a zsírszövetben is hat az EE növelésére, a szimpatikus kiáramlás serkentésére és a termogén markerek szabályozásának fokozására a BAT és a WAT ​​6, 7, 8, 9, 10 esetében. Így az FGF21-függő hőszabályozó jelátvitel aktiválása kulcsfontosságú közvetítője az alacsony fehérjetartalmú étrend metabolikus hatásainak.

Míg az FGF21 egyértelműen befolyásolja az EE-t, továbbra sem tisztázott, hogy mennyire szükséges az UE1 UCP1-függő növekedése az FGF21 metabolikus hatásához. Egyes tanulmányok azt sugallják, hogy az FGF21 nem igényli az UCP1-et az EE 11 növeléséhez, míg más vizsgálatokban az UCP1 törlése gyengíti az FGF21 12, 13 hatását. Tekintettel arra, hogy a fehérjeszűkítés az EE krónikus upregulációjához és a zsírszövet 4 átalakulásához vezet, lehetségesnek tűnik az is, hogy ezek a hatások megváltoztathatják az akut stresszre adott metabolikus választ, és számos korábbi tanulmány szerint az FGF21 fokozódhat a hideg stressz miatt 15, 16, 17, 18. Végül az is ismert, hogy a fehérje korlátozás az EE 19, 20 bevitel mellett növeli a táplálékfelvételt. Az energiaegyensúly szempontjából ez a modell szokatlan, mivel az energiaegyensúly-hormonok (leptin) általában támogatják az élelmiszer-bevitel és az EE ellentmondásos változását. Így lehetségesnek tűnik, hogy az élelmiszer-bevitel és az EE változásai összefüggenek egymással, vagy az élelmiszer-bevitel növekedése adaptív válasz a megnövekedett EE-re (védelem a fogyás ellen), vagy alternatív megoldásként az EE növekedése adaptív válasz a növekedésre. az étel bevitelében (védelem a súlygyarapodás ellen).

Itt egy tanulmánysorozatot írunk le, amelynek célja a táplálékfelvétel, az energiafelhasználás, az UCP1 és az FGF21 közötti kapcsolat tesztelése étrendi fehérjeszűkítő modell alkalmazásával. Ezekben a vizsgálatokban az LP által kiváltott EE növekedéséhez mind az FGF21, mind az UCP1 szükséges volt. Annak ellenére, hogy növekszik az EE, az FGF21 és az UCP1, a fehérje korlátozásnak nincs hatása a testhőmérsékletre vagy az akut hideg stresszre adott válaszra. Érdekes módon az LP-indukálta hiperfágia szintén nem volt szükséges az EE növelésére a fehérje-korlátozás során. Összességében ezek az adatok egy olyan modellt alátámasztanak, amelyben az LP által kiváltott FGF21 az UCP1-függő energiaköltség-növekedést befolyásolja az anyagcsere, de nem a termogén végpontok befolyásolásában.

az eredmény

Az LP által kiváltott energiafelhasználás növekedése a termoneutralitásban jelentkezik, és ehhez UCP1 szükséges

A Wildype és az Ucp1-KO egereket kontroll és LP táplálékra helyeztük 6 hétig 28 ° C-on, az első 7 nap során mért energiafogyasztással (1A, B ábra). Korábbi vizsgálatainkkal összhangban az LP-diéta az EE jelentős növekedését eredményezte a vad típusú egerekben (p

által

Az alacsony fehérjetartalmú energiafogyasztáshoz UCP1 szükséges. A vad típusú és az Ucp1-KO egereket kontroll vagy LP táplálékra helyeztük (8/csoport) 28 ° C-on, az energiafelhasználást étrendenként az első 6 nap alatt regisztráltuk. Nyers oxigénfogyasztás (VO2) a vad típusú egerek kontroll vagy LP étrendre való átállása után ( A ) és Ucp1-KO ( B ). Átlagos EE ( C ), Az EE testtömegre normalizálódott D ), RER ( E ) és tevékenység ( F ) a kísérlet 5. és 6. napján. * P

Az UCP1 törlése fokozta a fogyást az alacsony fehérjetartalom miatt, részben azáltal, hogy visszafordította az alacsony fehérjetartalmú étel bevitelére gyakorolt ​​hatást. A testtömeg változása ( A ), az átlagos napi táplálékfelvétel B ), zsír ( C ) és a sovány anyag ( D ) vad típusú és Ucp1-KO egerekben kontroll vagy LP étrendet fogyasztva (8/csoport) 6 hétig 28 ° C-on, * P # P

Az alacsony fehérje hatása az FGF21-re, a máj génexpressziójára és a BAT-ra Ucp1-KO egerekben. A szöveteket vad típusú és Ucp1-KO egerekből gyűjtöttük, miután 6 hétig kontroll vagy LP étrendet fogyasztottunk (8/csoport). Az FGF21 szérumot ELISA-val mértük ( A ), míg az Fgf21 májgén expressziója ( B, C ) és BAT ( D ) valós idejű PCR-rel mértük. * P + P # P 4, ami arra utal, hogy az LP étrendnek való kitettség fokozhatja az akut hideg stresszre adott metabolikus választ. Ezenkívül az FGF21 külön társult mind a fehérje-restrikciós válaszhoz, mind a hideg stressz-válaszhoz, és így az FGF21 elvesztésének enyhítenie kell az LP-étrend minden kedvező hatását. Ennek a kérdésnek a teszteléséhez a vad típusú és az Fgf21-KO egereket kontroll vagy LP táplálékra helyeztük 10 napig szobahőmérsékleten (az EE növelése a WT egerekben), majd akut hideg stressznek tettük ki (6 óra 4 ° C-on 4 óra étel). ). Korábbi munkánkkal összhangban az LP-étrend a testtömeg jelentős csökkenését eredményezte a WT egerekben (p

Az FGF21 által indukált alacsony fehérjetartalom növeli az EE-t, de nem változtatja meg az akut hideg stresszre adott választ. A WT és Fgf21-KO egereket 10 napig (10 csoport/csoport) LP étrendbe helyeztük szobahőmérsékleten, a testtömeg változásával ( A ) és a rektális hőmérséklet ( B ) kétnaponta mértük. A 10. napon az ételt eltávolítottuk, és a hőmérsékletet rektális hőmérsékleten 6 órán át 4 ° C-ra csökkentettük ( C ) és az EE mérése ( D, E, F ). Nyers EE ( E ) és az EE-t testtömegre normalizálták ( F ) 24 órán át hideg (23 ° C) és az utolsó 3 óra hideg (4 ° C) expozíció előtt. A D panel szürke árnyalata a kialudt lámpákat, a kék árnyalat pedig a hidegnek való kitettséget jelenti. * P

Az alacsony fehérjetartalmú étrend és az FGF21 deléció hatása az anyagcsere végpontokra akut hideg stressz után. A WT és Fgf21-KO egereket 10 napig LP-re helyeztük, a 10. napon az ételt eltávolítottuk, és a hőmérsékletet 4 ° C-ra csökkentettük. Az egereket 6 óra múlva 4 ° C-on leöltük, és a szérum FGF21-et megmértük ( A ), máj Fgf21 mRNS ( B ), máj ( C ) és BAT ( D ) mRNS expressziója. 10/csoport. * P

Hyperphagia nem szükséges az alacsony fehérjetartalmú fehérje ráfordítás növeléséhez. A vad típusú egereket 7 napig ad libitum kontroll- vagy LP-étrendre helyezték, vagy LP-re helyezték, de a hyperphagia megelőzése érdekében a kontrollcsoport (LPPF) napi bevitelét etették. Napi táplálékfelvétel ( A, B ), testsúlya a 0. napon ( C ) és a 7. napon ( D ) és a BW változása 7 napon belül ( E ). Kiigazítatlan átlagos napi energiafelhasználás ( F ) és átlagosan 5-7 nap alatt ( G ) és az EE a testsúlyhoz igazítva a 7. napon ( H a én ). 8 egér/csoport. * P # P 1, 2, 19, 21, 22, 23, 24. Laboratóriumunk és mások által végzett legújabb munka azt mutatja, hogy az FGF21 endokrin hormont fokozza a fehérje korlátozása, és szükséges ezekhez a változásokhoz 4, 5, 25, 26, 27, 28, 29. Számos további kérdés marad azonban az FGF21 fehérje-korlátozás összefüggésében fellépő mechanizmusával kapcsolatban, valamint azzal kapcsolatban, hogy ezek az FGF21-függő hatások az élelmiszer-bevitelre, az EE-re és a testtömegre egymástól függetlenül indukálódnak-e, vagy összefüggenek-e egymással.

Ezek az adatok együttesen négy fontos következtetéshez vezettek. (1) Korábbi munkánknak megfelelően az LP-étrend növeli az FGF21-et és az FGF21 szükséges az LP-étrendre adott metabolikus válaszokhoz. (2) Az LP okozta EE növekedéshez UCP1 szükséges, az UCP1 elvesztése pedig megfordítja az LP étrend táplálkozási hatását. az akut hideg stressz és végül (4) az EE indukciója tűnik az elsődleges adaptív válasznak a fehérje korlátozására, míg a teljes táplálékbevitel növekedése másodlagosnak tűnik az EE növekedésével szemben. Mint ilyen, ezek az adatok támogatják azt a modellt, amelyben az LP által kiváltott FGF21 vezérli az UCP1 energiafüggőségét, ezáltal befolyásolja az anyagcsere, de nem a termogén végpontokat.

Anyagok és metódusok

Állatok és diéták

Kísérleti terv

1. kísérlet: A fehérje korlátozásának hatása a termoneutralitásban elhelyezett Ucpl-hiányos egerekre

Hím vad típusú és Ucp1-KO egerek (

3 hónapos korban) kontroll vagy LP étrendbe helyeztük 6 hétig (8 egér/étrend/genotípus), és 28 ° C-on tartottuk a vizsgálati időszak alatt. A kezdeti étrendet metabolikus kamrákban (Oxymax, Columbus Instruments) hajtották végre, 1 hét múlva az állatokat standard tartási helyekre helyezték át. Az egerek 6 hétig maradtak étrendjükön, testtömegüket és táplálékfelvételüket hetente mérték. A testösszetételt TD-NMR-rel (Bruker Minispec) mértük a kísérleti étrend kezdetén (0. nap), az OxyMax metabolikus elemzés utolsó napján (7. nap) és az áldozat napján (42. nap).

2. kísérlet: Fgf21-hiányos egerekben a fehérje-korlátozás és a hidegstressz hatása

A vad típusú hím és Fgf21-KO egereket kb. 3 hónapos korban vonták be a vizsgálatba, és szobahőmérsékleten (23 ° C) tartották őket, 10 napig kontroll vagy LP diétára helyezték őket (10 egér/diéta/genotípus) és étel. a bevitel, a testsúly és a végbél hőmérséklete 2 naponta regisztrálva van. A 9. napon mindegyik csoportban az egerek felét metabolikus kamrákba helyezték, hogy 23 ° C-on rögzítsék az EE kiindulási értékét. A 10. napon az összes egér tartási hőmérsékletét 6 órán át 4 ° C-ra csökkentették 11:00 órai kezdettel. Az EE-t metabolikus kamrákban rögzítették egerekben, és a rektális hőmérsékleteket 30 percenként regisztrálták a többi egér esetében. 6 óra múlva az egereket feláldoztuk, és a szöveteket a fent leírtak szerint összegyűjtöttük.

3. kísérlet: A párosítás hatása a vad típusú egerek LP által kiváltott energiafelhasználásának növekedésére

3 hónapos korban a vad típusú hím egereket véletlenszerűen három kezelési csoportba osztották, és kontroll vagy LP étrendet ad libitum tápláltak, vagy LP étrendet tápláltak, de egy kontroll csoport napi bevitelét etették (az LP okozta hiperfágia elkerülése érdekében). . ). Az egereket 7 napig etették e táplálékkal, az egész kísérletet metabolikus kamrákban (23 ° C) végezték, hogy értékeljék az energiafelhasználás változását. A táplálékfelvételt naponta mértük a testtömeg és összetétel alapján, a kísérlet elején (0. nap) és végén (7. nap).

Az FGF21 immunvizsgálat meghatározása

A szérum FGF21 koncentrációkat egerekben ELISA-val határoztuk meg a gyártó által ajánlott eljárás szerint (RD291108200R, egér és patkány FGF-21 ELISA, BioVendor). Az FGF21 minimális kimutatható koncentrációja ezzel a vizsgálattal 18,4 pg/ml volt. A szérum FGF21 meghatározásához az elemzés előtt 50 μl szérumot hígítottunk 200 μl hígító pufferben.

Valós idejű PCR

Az RNS extrakciót és a valós idejű PCR-t a fent leírtak szerint hajtottuk végre 42. A teljes RNS-t a májból, az iWAT-ból és a BAT-ból TRIzol reagens alkalmazásával extraháltuk a gyártó protokollja szerint (Invitrogen), hozzáadva a BAT és iWAT RNeasy Lipid szövetvizsgálati készletét (Qiagen). Az RNS tisztaságát és mennyiségét spektrofotometriásan határoztuk meg NanoDrop (Thermo Scientific) alkalmazásával. A CDNA szintézist iScript-rel (BioRad) hajtottuk végre, és az mRNS-t ABI 7900 platformon számszerűsítettük az ABI SYBR Green PCR Master Mix alkalmazásával, 384 üreges optikai lemezeken (Applied Biosystems). Az alapozó párokat az IDT RealTime qPCR Primer Design eszközzel terveztük, és legalább egy primer átlépte az exon-exon határt. A célgén expresszióját endofil kontrollként ciklofilinnel normalizáltuk. A felhasznált alapozók a következők, 5'-től 3'-ig írva:

Fas pre GGGATCTGGTGAAAGCTGTAG; Rev GTGTTCTCGTTCCAGGATCTG

Scd-1: CTGTACGGGATCATACTGGTTC; Rev CGTGCCTTGTAAGTTCTGTG

Srebp1 az AGATTGTGGAGCTCAAAGACC esetében; Rev CACTTCGTAGGGTCAGGTTC

Klb Pre ​​CAGGGATATCTACATCACAGCC; Rev GTAGCCTTTGATTTTGACCTTGTC

Fgf21 a CAAATCCTGGGTGTCAAAGC esetében; Rev. CATGGGCTTCAGACTGGTAC

Fgfr1 AAAGATCTGGTATCCTGTGCC esetében; Rev TCGAGCTAAGCCAAAGTCTG

Fgfr4 a TGTCAAATTCCGCTGTCCAG esetében; Rev ACCACACTTTCCATCACCAG

Cyc Pre CTTCGAGC TGTTTGCAGACAAAGT; Rev AGATGCCAGGACCTGTATGCT.

Statisztikai analízis

Az adatokat SAS szoftvercsomaggal (SAS V9, SAS Institute) elemeztük, egyirányú, kétirányú vagy ismételt ANOVA méréseket alkalmazva, általános lineáris modelleljárással. Amikor a kísérleti nagyméretű tesztek szignifikánsak voltak, post-hoc összehasonlításokat hajtottak végre az LSMEANS utasítás és a PDIFF opció segítségével, és a legkevésbé szignifikáns különbségeket mutatták az előre ütemezett összehasonlítások tesztjeiben. Az összes adatot átlag ± SEM-ben fejezzük ki, statisztikai szempontból szignifikánsnak tekintjük a 0,05 valószínűséget.

Az adatok elérhetősége

A jelenlegi vizsgálat során létrehozott és/vagy elemzett adatfájlok ésszerű kérésre rendelkezésre állnak a megfelelő szerzőtől.

köszönöm

A szerzők Madeleine Dehner, Lexus Trosclair és a Comparative Biology Core PBRC munkatársait ügyes segítségükért és kiváló technikai támogatásukért kérik. Köszönetet mondunk dr. Thomas Gettys és laboratóriuma az Ucp1-KO egereknek, valamint a kézirat készítése során folytatott hasznos megbeszélésekért. Ezt a munkát az NIH R01DK081563 és az R01DK105032 támogatta CDM-en. A CMH-t az NIH R01DK105032-01A1S1 adminisztratív kiegészítése támogatta. A TL-t egy kutatási tartózkodás támogatta a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) LA 3042/2-1. A HRB-t az R01DK047348, a HM-t pedig az R01DK092587 támogatta. Ezt a projektet/munkát az állati anyagcsere és viselkedés, a genom és a sejtbiológia magja, valamint a PBRC magjának bio képalkotása során használt létesítmények használták fel, amelyeket részben a COBRE (P30GM118430) és a NORC (P30DK072476) támogatásai támogatnak. a Nemzeti Egészségügyi Intézetektől.

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.