absztrakt

Az eukariótákban sok gén alternatív splicingen megy keresztül, és több izoformát kódol, ami különböző biokémiai és biológiai tulajdonságokkal rendelkező rokon fehérjék expressziójához vezet (Andreadis et al., 1987). Az IG20 (Insulinoma - Glucagonoma) egy ilyen gén, amely legalább négy különböző toldási variánst (SV) képes kódolni, nevezetesen az IG20pa (azaz IG20 proapoptotikus), MADD/DENN, IG20-SV2 és DENN-SV (Goto et al., 1992, Chow és Lee, 1996, 1998; Cunningham, 1996; Schievella és mtsai, 1997; Al-Zoubi és mtsai, 2001). Ez a négy IG20 -SV különbözik a 13L és 16 exonok differenciális splicingjeitől. Az IG20pa, MADD, IG20-SV2 és DENN-SV vonatkozásában nem expresszálják a 16 vagy 13L exont vagy mindkettőt (Al-Zoubi et al., 2001).

Az IG20 gén fontos szerepet játszik a rákos sejtek szaporodásában, az apoptózisban és a túlélésben (Chow és Lee, 1996, 1998; Schievella és mtsai, 1997; Brinkman és mtsai, 1999; Murakami-Mori és mtsai, 1999; Telliez és mtsai. al., 2000, Al-Zoubi és mtsai, 2001; Lim és Chow, 2002; Efimova és mtsai, 2003, 2004; Lim és mtsai, 2004; Ramaswamy és mtsai, 2004). Ezen felül fontos szerepet játszik a neurotranszmisszióban (Zhang és mtsai, 1998; Tanaka és mtsai, 2001; Yamaguchi és mtsai, 2002), a neurodegenerációban (Del Villar és Miller, 2004) és a guanin nukleotidcserében (Wada és mtsai. 1997, Brown és Howe, 1998; Iwasaki és Toyonaga, 2000; Levivier és mtsai, 2001). Ezeket a divergens funkciókat valószínűleg alternatív splicing közvetíti (Chow et al., 1998; Al-Zoubi et al., 2001; Efimova et al., 2004).

Az IG20 gén expresszió szintje magasabb a rákos sejtekben és szövetekben, összehasonlítva a normál társaikkal. Noha a MADD és a DENN-SV konstitutív módon expresszálódik (a DENN-SV túlzottan expresszálódik a többi rákos megbetegedéshez képest), az IG20pa és az IG20-SV2 expressziója annyiban szabályozott, hogy bizonyos sejtekben expresszálódhatnak vagy nem. Ez azt jelzi, hogy az IG20pa és az IG20-SV2 nem szükséges a sejtek túléléséhez (Efimova et al., 2004).

Korábban tanulmányokat hajtottunk végre a funkció javítására az egyes IG20-SV-ek HeLa-sejtekben történő expressziója révén, és kimutattuk, hogy az MADD és az IG20-SV2 variánsok alig vagy egyáltalán nem befolyásolják a sejtproliferációt és az indukált apoptózist. Míg az IG20pa növeli mind a külső, mind a belső apoptotikus ingerek iránti érzékenységet és elnyomja a sejtek proliferációját, a DENN-SV ellenállást biztosított az indukált apoptózis és a fokozott sejtproliferáció ellen. Így az IG20pa és a DENN-SV "tumorszuppresszorként" és "onkogénként" működött (Efimova et al., 2004).

Az összes endogén IG20-SV leütése antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával in vitro és in vivo spontán apoptózist eredményezett a rákos sejtekben (Lim és Chow, 2002; Lim és mtsai, 2004). Így az IG20-SV fent említett kontrasztos hatásait csak az egyes IG20-SV kizárásával és a későbbi hatások meghatározásával lehet tisztázni. Ez számos kihívást jelentett, mert az IG20-SV csak a 13L (130 bp) és a 16 (60 bp) exonok differenciális expressziójában különbözött (Al-Zoubi et al., 2001). Ugyanakkor kis hajtű-RNS-ek (shRNS-ek) segítségével, amelyek kifejezetten a 13L, 15 és 16 exonokat célozzák meg, képesek voltunk szelektíven kicsapni az IG20-SV összes vagy különböző kombinációját HeLa és PA-1 rákos sejtvonalakban, és meghatározni azok szerepét a túlélésben sejtek. Eredményeink azt mutatják, hogy a MADD önmagában szükséges és elegendő e rákos sejtek túléléséhez.

az eredmény

A kis gátló RNS-ek szelektíven csökkenthetik az exogén IG20-SV expresszióját

Az apoptózishoz és a sejtproliferációhoz hozzájáruló IG20-SV meghatározásához kis gátló RNS-eket (siRNS-eket) használtunk az IG20-SV szelektív csökkentésére (1. táblázat) (McManus és Sharp, 2002; Cullen, 2004; Hall, 2004). A SiRNS-eket a pSUPER vektorba klónoztuk (Brummelkamp et al., 2002), hogy lehetővé tegyük az shRNS expresszióját. 293T sejteket transzfektáltunk YFP-IG20pa, YFP-MADD vagy YFP-DENN-SV, valamint shRNS-t 1: 1, 1: 3 és 1: 7-nél expresszáló különféle pSUPER vektorokkal együtt. Az YFP expressziójának csökkenése a releváns fehérje leütését mutatta kifejezés. Számos shRNS-t szkríneltek, és a leghatékonyabb eredményeket az 1a. Ábra mutatja. A 13L-shRNS célzó 13L exont az IG20pa/MADD-vel modulálva, a DENN-SV expresszió változatlanul hagyva. Ezzel szemben a 16E-shRNS a 16. exont célozta meg, amelyet az IG20pa modulált, de a MADD/DENN-SV nem. Közép-shRNS célzó exon 15 az összes tesztelt IG20-SV-t modulálta. Önmagában a vektor vagy a kontroll shRNS alig vagy egyáltalán nem befolyásolta az IG20-SV expressziót.

Asztal teljes méretben

ig20

Az shRNS-ek szűrése az IG20 leütése céljából. a ) Csökkent exogén IG20-SV expresszió. A 293T sejteket 12 lyukú lemezekre szélesztettük és együtt transzfektáltuk a jelzett IG20-SV-YFP és pSUPER-shRNS konstrukciókkal. Az YFP expresszióját az átlagos fluoreszcencia intenzitásként fejezzük ki. A bemutatott adatok (a triplikátumok átlag ± SD) három független kísérletre vonatkoznak, mindegyik P-értékkel

Az endogén IG20-SV downmodulációja HeLa sejtekben. A transzlukció után 72 órával HeLa sejtekből nyert egy mikrogramm teljes RNS-t használtunk a reverz transzkripció-polimeráz láncreakcióhoz. A termékeket 2% -os agarózgélen szétválasztottuk. ( a ) Mind a négy IG20-SV amplifikálása F2-B2 primerek alkalmazásával. ( b ) A relatív sávintenzitások számszerűsítése a panelről és Alpha Imager (Alpha Innotech Corporation, CA, USA) alkalmazásával. ( c ) Az IG20pa és MADD amplifikációja a 13L-Forward és a B2-Reverse primerek alkalmazásával. d ) A relatív sávintenzitások számszerűsítése a c panelből.

Teljes méretű kép

Az IG20-SV downmodulációja HeLa sejtekben spontán apoptózishoz vezet

A spontán sejtpusztulást nukleáris kondenzációval (Hoechst 33342) (3a. És b. Ábra) és a mitokondriális membránpotenciál elvesztésével (tetrametil-rodamin-észter [TMRM] festés) határoztuk meg (3c. És d. Ábra). Az összes IG20-SV down-modulálása Mid-shRNS-sel jelentős spontán apoptózist eredményezett. Noha az IG20pa/IG20-SV2 downmodulációjának nem volt hatása, a MADD/IG20pa megszüntetése fokozott spontán apoptózist eredményezett. Annak megállapításához, hogy a spontán apoptózis kiváltó oka hasonló-e az extrinsic (kaszpáz-8) vagy az intrinsic út (kaszpáz-9) által kiváltott apoptózis során megfigyelthez, meghatároztuk az aktív kaszpáz-8 és -9 expresszáló sejtek százalékos arányát. áramlási citometriával.

Az IG20-SV downmoduláció hatása HeLa sejtekben. ( a ) Hoechst-festés - 72 órával a transzdukció után HeLa-sejteket gyűjtöttünk, és 5 ug/ml Hoechst-tel festettük, és fluoreszcenciával aktivált sejtválogatási elemzésnek (FACS) vetettük alá. Az erősen pozitív sejtek (apoptotikus sejtek) százalékos arányát a hisztogramok mutatják. ( b ) Az eredmények összefoglalása, amely a megnövekedett magkondenzációval rendelkező sejtek százalékos arányát mutatja, Hoechst festéssel három független kísérletből mérve. A P értéke:

Caspase aktiválás az IG20-SV downmoduláció után. ( a ) Általános kaszpáz aktiválás - HeLa sejteket gyűjtöttünk 60 órával a transzdukció után, és minden aktivált kaszpázra festettük Red-z-VAD-FMK alkalmazásával; ( b ) a kaszpáz-8 esetében Red-IETD-FMK-val; a ( c ) a vörös-LEHD-FMK-val végzett kaszpáz-9 esetében, és az FACS elemezte. A kaszpáz aktiváció százalékos arányát mutatjuk be GFP-pozitív sejtekben (átlag ± SD triplikátumok).

Teljes méretű kép

Az IG20-SV downmodulációjának nincs nyilvánvaló hatása a HeLa sejtek proliferációjára

A sejtnövekedésre és a proliferációra gyakorolt ​​hatások értékeléséhez különféle életképes shRNS-expresszáló sejteket számláltunk. A kontrollokhoz képest a Mid- és 13L-shRNS-t expresszáló életképes sejtek számának jelentős csökkenését figyeltük meg (5a. Ábra). A CFSE-hígítás (SNARF-1 karbonsav, acetát, szukcinimidil-észter) időbeli elégtelen eltérése a Mid- és 13L-shRNS-sejtekkel kezelt kontrollsejtek között idővel azt sugallja, hogy a sejtszámban a különbségek nem a csökkent proliferáció miatt következtek be (5b. Ábra). azonos számú, különböző shRNS-t expresszáló HeLa-sejtek szélesztésével és 12 nap elteltével meghatároztuk a telepek számát és méretét. Bár lényegesen kevesebb telepet képeztek a Mid és a 13L-shRNS-t expresszáló sejtek (d, e panelek), a telepek mérete összehasonlítható volt a kontrollcsoportok méretével. Továbbá az shRNS-sel kezelt sejtek nem mutattak szignifikáns különbségeket a sejtciklus progressziójában (nem látható). Ezek az eredmények együttesen azt mutatták, hogy a MADD abláció elsősorban spontán apoptózishoz vezet.

Az IG20 downmoduláció hatása a Hela sejtproliferációra. a ) Sejtnövekedés. Huszonnégy órával a transzdukció után HeLa-sejteket szélesztettünk az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. A sejteket ezután összegyűjtöttük, és az életképes sejteket (negatív tripán kék sejteket) megszámoltuk a megjelölt napokon. Az adatok a triplikátumok átlag ± SD értékei. ( b ) Sejtek szaporodása. Huszonnégy órával a transzdukció után a HeLa-sejteket CFSE-vörös színnel (SNARF-1-karbonsav, acetát, szukcinimidil-észter) festettük, a jelzett napokon összegyűjtöttük, és fluoreszcenciával aktivált sejtek szortírozásával értékeltük a CFSE hígítását. A hisztogramokon szereplő számok a transzdukált sejtek geometriai csúcsa átlagos CFSE festési intenzitását mutatják. ( c - g ) Sejt túlélés. Az IG20 -SV downmoduláció után 12 nappal túlélő sejtek festését mutatja kristálylila színben.

Teljes méretű kép

A MADD csökkenése a PA-1 petefészek karcinóma sejtekben spontán apoptózishoz vezet

A HeLa sejtekben vagy le tudtuk modulálni mind a négyet, vagy az IG20pa/MADD vagy az IG20pa/IG20-SV2 kombinációját. Annak bizonyítására, hogy az MADD szükséges a sejtek túléléséhez, PA-1 petefészek karcinóma sejteket használtunk, amelyek lényegében csak az MADD-t és a DENN-SV-t expresszálják (Efimova et al., 2004), ezáltal lehetővé téve az MADD kizárólagos csökkentését 13L-shRNS-sel. Míg a Mid-shRNS lefelé modulált MADD/DENN-SV, a 13L-shRNS csak megszüntette a MADD expresszióját (6a. És b. Ábra). A spontán apoptózis a sejtek körülbelül 50% -ában nyilvánvaló volt 72 órával a 13L-shRNS-sel történő transzdukció után (6c. És d. Ábra).

Az IG20 downmoduláció hatása PA-1 sejtekben. ( a ) Az endogén IG20 downmodulációja PA-1 sejtekben. A PA-1 sejtekből származó IG20-SV reverz transzkripció-polimeráz láncreakciója 72 órával a transzdukció után, F2-B2 primerek alkalmazásával. ( b ) Az IG20pa és MADD amplifikálása csak a 13L-F és B2 primerek alkalmazásával. c ) Nukleáris kondenzáció. 72 órával a transzdukció után a PA-1 sejteket Hoechst festékkel festettük, és fluoreszcenciával aktivált sejtrendezéssel (FACS) elemeztük. Az apoptotikus sejtek százalékos arányát a hisztogramok mutatják. ( d ) Mitokondriális depolarizáció. 72 órával a transzdukció után a PA-1 sejteket TMRM-mel festettük és FACS-mal elemeztük. A bemutatott adatok három különböző kísérletre vonatkoznak.

Teljes méretű kép

Meghatároztuk a hasonlóan kezelt PA-1 sejtek szaporodási képességét. Egyenlő számú, különböző kezelésben részesülő PA-1 sejtet (24 órával a transzdukció után) tenyésztettünk, és az életképes sejtek számát különböző időpontokban határoztuk meg (7a. Ábra). Bár a MADD elvesztése a sejtek számának jelentős csökkenéséhez vezetett, hasonlóan a HeLa sejtekhez, nem volt hatással a CFSE hígítására vagy a telep méretére (7b-g ábra).

Az IG20 downmoduláció hatása a PA-1 sejtproliferációra:( a ) sejtnövekedés, ( b ) proliferáció, ( c ) a sejtek túlélése. A kísérleteket a fent leírtak szerint hajtottuk végre HeLa sejtekkel (lásd az 5. ábrát). A bemutatott adatok három különböző kísérletre vonatkoznak.

Teljes méretű kép

A MADD, nem a DENN-SV, megakadályozhatja a spontán apoptózist

A MADD önmagában történő leütése a PA-1 sejtekben spontán apoptózishoz vezetett. Annak megállapítására, hogy a DENN-SV önmagában történő expressziója képes-e megmenteni a sejteket a fokozott spontán apoptózistól, együtt expresszáltak 13L és 16E shRNS-t HeLa sejtekben, és fokozott spontán apoptózist találtak. Ez tovább erősítette a MADD és nem a DENN-SV kritikus követelményét a sejtek túlélésére (8. ábra).

A MADD downmodulációja spontán apoptózist okoz. A HeLa sejteket megfertőztük a jelzett, shent expresszáló lentivírusokkal. 72 óra a transzdukció után ( a ), a reverz transzkripció-polimeráz láncreakciót a fent leírtak szerint hajtottuk végre, és a termékeket 2% -os agarózgélen szétválasztottuk. ( b ) Hoechst festést végeztünk a spontán apoptózis meghatározására.

Teljes méretű kép

Az MADD alapvető szerepének a sejtek túlélésében való egyértelmű bemutatásához HeLa-sejteket állítottunk elő, amelyek stabilan expresszáltatták a MADD-YFP-Mut és a DENN-SV-YFP-Mut (1b. Ábra). Amint a 9a. Ábra mutatja, 72 órával a transzdukció után a Mid-shRNS nem volt képes sem a MADD-YFP-Mut, sem a DENN-SV-YFP-Mut modulálására; míg a 13L-shRNS képes mind az endogén, mind a MADD-YFP-Mut modulálására. Érdekes módon a MADD-YFP-Mut és nem a DENN-SV-YFP-Mut expressziója elegendő volt a spontán apoptózis kialakulásának megakadályozásához a mid-shRNS-sel kezelt Hela sejtekben (9b. Ábra). Hasonló eredményeket kaptunk PA-1 sejtekben (nem látható). Ezek az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy a MADD önmagában megakadályozhatja a rákos sejtek spontán apoptózisát.

A MADD, nem a DENN-SV, megakadályozhatja a spontán apoptózist. ( a ) IG20-SV reverz transzkripció-polimeráz láncreakció a kontroll vektorral, MADD-YFP-Mut vagy DENN-SV-YFP-Mut tartósan transzfektált és az említett shRNS-expresszáló vírusokkal 72 órán át fertőzött sejtekből. b ) Nukleáris kondenzáció. A HeLa-sejteket Hoechst-tel festettük a spontán apoptózis meghatározása céljából. A bemutatott adatok három különböző kísérletre reprezentatívak (P