omega-3

  • elemeket
  • absztrakt
  • bevezetés
  • Anyagok és metódusok
  • Etika
  • vadállat
  • Szövettani értékelés
  • RNS extrakció és gén expresszió elemzés valós idejű kvantitatív PCR-rel
  • A TG-tartalom mérése
  • Statisztikai analízis
  • az eredmény
  • A HFD-vel etetett egerek jellemzői kísérleti anyagokkal vagy anélkül
  • A NASH-val társított omega-3-gyengített májfibrózis és az UDCA hozzáadása tovább növelte antifibrotikus hatását.
  • A NASH-hoz társuló omega-3 és UDCA-gyengített hepatitis
  • A máj TG omega-3 és UDCA felhalmozódása
  • Az omega-3 elnyomta a lipogenezissel összefüggő gének expresszióját, és az UDCA hozzáadása fokozta ezt a hatást.
  • Az UDCA hatása a NASH-ra csökkent expresszióval járt iNOS mRNS
  • vita

elemeket

absztrakt

Az alkoholmentes zsírmájbetegség, amely a világ egyik legelterjedtebb krónikus májbetegsége, számos olyan állapotból áll, amelyek magukban foglalják az alkoholmentes steatohepatitist (NASH). 1, 2, 3 Bár az egyszerű steatosis előrehaladott májfibrózis kíséretében indolens természetes úton haladhat át, gyakran hasonló klinikai folyamaton megy keresztül, mint az előrehaladott fibrózisos krónikus hepatitis C vírusfertőzés. 4 Mindezen lehetséges májbetegségek és halálozások mellett azonban még nem találtunk végleges kezelést a betegség progressziójának megállítására vagy megfordítására.

Az omega-3-többszörösen telítetlen zsírsavat (omega-3) klinikailag használják a hipertrigliceridémia kezelésére. 5 Bizonyíték van arra, hogy az omega-3 elnyomja a trigliceridek májban való felhalmozódását (TG) és csökkenti a gyulladást, ezáltal enyhíti a NASH-t állatmodellekben. 6, 7, 8, 9 Mindazonáltal nem állnak rendelkezésre szilárd klinikai bizonyítékok az omega-3 előnyére a NASH-ban, bár az omega-3 jelentős káros hatásainak hiánya miatt helyénvaló kiegészítésként használni. 10, 11, 12

A beszámolók szerint az Ursodeoxycholic acid (UDCA) jótékony szerepet játszik a kísérleti NASH-ban gyulladáscsökkentő, máj-, protektív és antioxidáns hatása miatt. 13., 14., 15., 16. A klinikai vizsgálatok azonban nem mutattak érdemi javulást a hepatitisben vagy a fibrózisban UDCA-val kezelt NASH-betegeknél. 17., 18. Noha a negatív eredmények a rosszul megtervezett vizsgálatoknak tulajdoníthatók, ideértve a szuboptimális gyógyszeradagot és a vizsgálat időtartamát is, várható, hogy az UDCA és más szerek, például az E-vitamin kombinációja klinikailag jelentős eredményeket eredményezhet; A tanulmány azonban kimutatta, hogy nagy dózisú E-vitamin (napi adag 400 NE) hosszú távú fogyasztása növelte a mortalitást. A kombinált terápia tesztelésekor figyelembe kell venni a biztonságot.

Azok a reagensek, amelyek kedvező hatást mutatnak a kísérleti NASH-ra, gyakran nem mutatnak jelentős javulást az emberi vizsgálatokban. Az ilyen szereknél biztonságosabb és hatékonyabb kombinációs terápia ezért jobb eredményeket hozhat a klinikai körülmények között. Így ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja az omega-3 és az UDCA kombinációjának hatását az egerek NASH-indukált táplálkozására, és összehasonlítsa az eredményeket egyedül az omega-3 eredményeivel, hogy értékelje ennek a kombinációnak a NASH kezelésének lehetőségét.

Anyagok és metódusok

Etika

Az állatokon végzett kísérleti eljárásokat és protokollokat a Yonsei Egyetem Orvostudományi Főiskolája, a Gangnam Severance kórház intézményi állatgondozási és -használati bizottsága hagyta jóvá (jóváhagyási szám: 0011). A vizsgálatot az állatok gondozásával és felhasználásával foglalkozó alkotmányos bizottság ajánlásainak és korlátainak megfelelően végezték el.

A hím C57BL/6 egereket (12 hetesek) a Central Lab Animal-től (Szöul, Korea) szereztük be, és 12 órás világos-sötét ciklusba helyeztük. Az egereket 15% vízmentes tejzsírból, 1,0% koleszterinből és 50% szacharózból (magas zsírtartalmú étrend (HFD)) tartalmazó étrendet etették, amelyet a Picolab-tól (Bethlehem, PA, USA) vásároltak. Ezeket az egereket 24 héten át HFD-vel etették, majd három csoportra osztva egyedül HFD-vel (HFD), HFD-vel és 70 mg kg -1 omega-3-mal (Pronova Biocare, Sandefjord, Norvégia; HFD/Omega -3) vagy HFD-vel etették őket. és omega-3 20 mg kg -1 UDCA-val (Daewoong Pharm., Szöul, Korea; HFD/Omega-3 + UDCA) kombinálva további 24 hétig. Az omega-3-at és az UDCA-t 0,75% Tween-80-ban hígítottuk, és 24 héten át szájon át adagoltuk. 48 hetes HFD-etetés után a kísérleti anyagok beadásával vagy anélkül az egereket leöltük, és a májukat eltávolítottuk. A friss májszövet mintáját 10% -os pufferolt formalinban rögzítettük, a fennmaradó szövetet pedig folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és -80 ° C-on tároltuk. A vérmintákat egér érzéstelenítés után szívszúrással vettük és -80 ° C-on tároltuk.

Szövettani értékelés

A májszövet mintáinak 10% -os formalinban rögzített és paraffinviaszba ágyazott szakaszait H & E-vel és Sirius Red-kel festettük szövettani értékelés céljából. A megvakult patológus a korábbi vizsgálatokban leírtak szerint a tárgylemezeket kisebb módosításokkal értékelte. 21, 22, 23 A gyulladást szövettanilag úgy számszerűsítettük, hogy megszámláltuk a gyulladásos lerakódásokat 20 egymást követő nagy teljesítményű mezőben (× 40 lencse; átlagos szövettani fokozat, 0. fokozat: nincs góc, 1:24 fokozat. Röviden: a Sirius vörös foltos szakaszainak képeit nagyítással × 10. A színes részen a piros a fibrózist, a szürke pedig a parenchymát jelezte. Az interaktív küszöbérték meghatározása után a képet bináris képpé alakították. A dimenziós mintákat bináris képek közvetlen pixelszámolásával mértük. A teljes terület az összeg volt A parenchymát és a fibrózist magában foglaló mikroszkópos mezõterületek mindegyik tárgylemezén 20 egymást követõ, nagy áteresztõképességû mezõben értékeltük a fibrózis területét, majd átlagoltuk.

RNS extrakció és gén expresszió elemzés valós idejű kvantitatív PCR-rel

A TG-tartalom mérése

A TG májtartalmát kereskedelmi készlet (ab65336, Abcam, Cambridge, MA, USA) segítségével számszerűsítettük a gyártó ajánlásai szerint. Röviden: lipidkivonatokat állítottunk elő 50 mg fagyasztott szövet homogenizálásával 5% -os NP-40 oldatban. A homogenizált szövetet 80–100 ° C-ra melegítjük vízfürdőben 2–5 percig, majd szobahőmérsékletre hűtjük. A mintákat megtisztítottuk és hígítottuk (1:10) desztillált vízzel, amelyet 570 mm OD-nél mértünk a gyártó utasításainak megfelelően.

Statisztikai analízis

Az összes eredményt átlag ± (sem) értékként jelentjük. Az adatokat nonparametrikus analízissel (Kruskal-Wallis vagy Mann-Whitney teszt) vagy Tukey post-hoc analízisével egyirányú varianciaanalízissel elemeztük. P

A testsúly a kísérlet 48 hete alatt változik. Az összes egeret 24 héten keresztül magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) etették, majd három csoportra osztották. Az egyik csoport (n = 8) csak HFD-t (HFD), a másik csoport (n = 8) HFD-t és omega-3-at (HFD/Omega-3), a másik csoport (n = 8) HFD-t kapott. és omega-3-ot UDCA-val kombinálva (HFD/Omega-3 + UDCA) adtak további 24 hétig.

Teljes méretű kép

Asztal teljes méretben

A NASH-val társított omega-3-gyengített májfibrózis és az UDCA hozzáadása tovább növelte antifibrotikus hatását.

A májfibrózis szövettani értékelését Sirius Red festési képelemző rendszerrel végeztük. Omega-3 adagolása 70 mg kg -1 napi dózisban szövettanilag kiértékelt HFD-fokozott májfibrózissal (P 1 omega-3-val kombinálva tovább gyengítette a HFD által kiváltott májfibrózist (P = 0,026, az omega-3-hoz képest) 3. ábra, 2b. ábra).

A diéta által kiváltott fibrózis és gyulladás szövettani értékelése NASH-ban. H&E-vel és Sirius Red-tel történő festés után a máj szövettani elemzését végeztük a gyulladás és a fibrózis értékelésére. Az egereket 24 hétig magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) etették, majd három csoportra osztották. Az egyik csoport (n = 8) csak HFD-t (HFD), a másik csoport (n = 8) HFD-t és omega-3-at (HFD/Omega-3), a másik csoport (n = 8) HFD-t kapott. és 24 héten keresztül omega-3-at adtak UDCA-val (HFD/Omega-3 + UDCA) kombinálva. a ) Reprezentatív szövettani értékelés H&E (× 100) és Sirius Red (× 100) alkalmazásával. b ) A fibrózis százalékos területe. A májfibrózist a fibrózis arányának képelemző rendszerrel történő kiszámításával értékeltük. A teljes terület a mikroszkopikus mezők területeinek összege volt, beleértve a parenchymát és a fibrózist. ( c ) A gyulladást szövettanilag úgy számszerűsítettük, hogy megszámláltuk a gyulladásos lerakódásokat 20 egymást követő nagy teljesítményű mezőben (× 40 objektív). Az átlagolt szövettani fokokat a következőképpen fejezzük ki; 0. évfolyam: nincs járvány, 1. évfolyam:

Máj triglicerid tartalom. A fagyasztott májszövetben a máj triglicerid tartalmát kereskedelmi készlet segítségével mértük. Az egereket 24 hétig magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) etették, majd három csoportra osztották őket. Az egyik csoport (n = 8) csak HFD-t (HFD), a másik csoport (n = 8) HFD-t és omega-3-at (HFD/Omega-3), a másik csoport (n = 8) HFD-t kapott. és omega-3-ot UDCA-val kombinálva (HFD/Omega-3 + UDCA) adtak további 24 hétig. * A P 27, 28 és az UDCA számos gyulladásos betegségben csökkenti az iNOS-t. 29, 30 Értékeltük, hogy az UDCA NASH-ra gyakorolt ​​jótékony hatása összefüggésben állt-e az iNOS mRNS-expresszió csökkenésével. Az omega-3 HFD-vel történő beadása az iNOS mRNS csökkenését eredményezte (P = 0,012), és az UDCA hozzáadása az omega-3-mal kombinálva tovább elnyomta az iNOS mRNS expresszióját (P = 0,029 a csak omega-3 csoporthoz képest; 3d. Ábra ). ).

vita

Bár számos korábbi tanulmány arról számolt be, hogy az omega-3 a legjobb tudásunk szerint enyhíti az étrend által kiváltott NASH-t, 31, 32, 33, ez az első olyan tanulmány, amely az omega-3 és az UDCA NASH-ra gyakorolt ​​additív hatásáról számol be. Más tanulmányokkal összhangban tanulmányunk azt is kimutatta, hogy az omega-3 önmagában képes enyhíteni a máj fibrózisát, amelyet a kollagén α1 (I) mRNS csökkent expressziója azonosít. Az UDCA omega-3-mal kombinációban történő alkalmazása azonban tovább csökkentette a fibrózist az mRNS szintjén, és tovább gyengítette a szövettanilag megítélt májfibrózist az egyedül omega-3 csoporthoz képest. A májfibrózisról többször úgy gondolták, hogy az az egyik legfontosabb tényező a NASH progressziójának előrejelzésében, 34, 35, 36, és az omega-3 és az UDCA additív hatása a NASH-val összefüggő fibrózis csökkentésében ezt a kombinációt potenciális jelöltvé teszi NASH kezelés.

A TGFβ-t a májfibrózis kulcsfontosságú szabályozójának azonosították, amely profibrogén hatását a májsejteken keresztül fejti ki. 37 A TGFβ szignalizáció szerepét a NASH-val összefüggő fibrózis előrehaladásában számos tanulmányban is beszámolták, vonzó kezelési célponttá téve azt. 38, 39 Vizsgálatunk kimutatta, hogy az omega-3 és az UDCA additív hatást fejtett ki a TGFβ mRNS expressziójának elnyomásában, bár eredményeink szerint a TGFβ nem javasolt célként ennek a kombinációs terápiának.

A májfibrózis mellett a gyulladás is ismert, hogy nagy szerepet játszik a NASH kialakulásában és progressziójában. 23, 43 Noha az omega-3 önmagában történő beadása nem mutatott szignifikáns szövettani változásokat, az UDCA omega-3-mal kombinációban történő beadása szövettanilag javított étrend által kiváltott gyulladást eredményezett a NASH-ban, ami additív hatásra utal. Egy korábbi tanulmány kimutatta a pro-gyulladásos citokin TNFα expressziójának csökkenését az omega-3 kiegészítés után, összhangban tanulmányunk eredményeivel.

A TG májban történő felhalmozódását az SREBP-1c, a transzkripciós faktor szabályozza, amely a lipogén enzimeket szabályozza. 45, 46 Számos tanulmány arról számolt be, hogy az omega-3 kiegészítés csökkentette az SREBP-1c gén expresszióját (6, 7, 8, 9), és egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy az UDCA közvetítette a lipogenezist az SREBP-1c expresszió elnyomásával. Vizsgálatunk az omega-3 és az UDCA additív hatását javasolta az SREBP-1c szuppressziójára, bár ez a tanulmány nem mutathatta ki az UDCA additív hatását a de novo lipogenezissel vagy a zsírsav oxidációval kapcsolatos gének szabályozására.

Bár tanulmányunk nem határozza meg az omega-3 és az UDCA kombinált terápiájának mechanikai szerepét a NASH enyhítésében, az elfojtott iNOS expresszió arra utal, hogy egy lehetséges magyarázat csökkentheti a májkárosodást az oxidatív stressz hatására. A megnövekedett iNOS-termelést kimutatták a fruktóz által kiváltott máj steatosisban 48, az elnyomott iNOS-termelést pedig gyulladáscsökkentő gyógyszerek alkalmazásával társították. A jövőben részletesebb mechanizmusokat vizsgáló tanulmányokra van szükség.

Végül tanulmányunk kimutatta az omega-3 és az UDCA additív hatását a diéta okozta fibrózis és gyulladás enyhítésére a NASH-ban. Vizsgálatunk kimutatta az omega-3 és az UDCA additív hatását az SREBP-1c lipogén gén és az oxidatív stresszhez kapcsolódó iNOS gén szuppressziójára is. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az omega-3 és az UDCA kombinációja lehetséges kezelés lehet a NASH számára, bár a validálás különféle NASH modellek és humán vizsgálatok segítségével szükséges.