- elemeket
- absztrakt
- bevezetés
- az eredmény
- A HSC csoport klonális összetétele az életkor miatt
- A régi HSC klónok funkcionális megfordítása
- vita
- mód
- egerek
- Immunfenotípusos elemzések és sejtszortírozás
- A HSC öregedési klonalitásának vizsgálata
- Az iPS sejtek levezetése
- Specifikus kiméra egerek klónjainak előállítása és jellemzése
- statisztika
- Az adatok elérhetősége
- További részletek
- További információ
- PDF fájlok
- További információ
- Fájl áttekintése
- Excel fájlok
- Kiegészítő információk 1
- Hozzászólások
elemeket
- öregedés
- vérképzés
- Vérképző őssejtek
absztrakt
Az öregedés a szomatikus/felnőtt őssejtek jelentős változásával jár, és ezek ellensúlyozására szolgáló kezelések jelentős egészségügyi előnyökkel járhatnak. A vérben a hematopoietikus őssejt (HSC) öregedése számos funkcionális hiányossággal jár. Azonban azon nemrégiben tapasztalt megállapítás mellett, hogy az egyes HSC-k fiatal koruktól eltérően beállíthatók, a HSC-k aszinkron módon is öregedhetnek. A HSC megújulásának kilátásainak értékelése ezért végső soron megközelítést igényel azokhoz a HSC-khez, amelyeket funkcionálisan érint az életkor. Itt egyesítjük a régi HSC egerek genetikai vonalkódjait az indukált pluripotens őssejtek (iPS) képződésével. Ez lehetővé teszi számunkra, hogy kifejezetten az idősebb HSC-ket célozzuk meg, amelyek markáns ferde vonalakat mutatnak, amelyek a HSC öregedésének jellemzői. Funkcionális és molekuláris értékelések azt mutatják, hogy ezekből az iPS klónokból származó hematopoiesis nem különböztethető meg a fiatal egereknél tapasztaltaktól. Adataink tehát közvetlen támogatást nyújtanak ahhoz az elképzeléshez, hogy a HSC öregedésének számos fő funkcionális jellemzője megfordítható.
Az öregedés számos betegség mély hajlamával jár, amelyek magukban foglalják a vérszegénység, a leukémia és a immunitás károsodásának nagyobb előfordulását a vérben 1. Míg az életkorral összefüggő betegségek valószínűleg az érett effektorsejtek működését sértő vagy megváltoztató változásoknak tudhatók be, nehezebben egyeztethetők össze olyan szervekkel, mint a vér, amelyek eredendően rövid életű effektorsejtekre támaszkodnak, amelyek folyamatos utánpótlást igényelnek 1. 2, 3. Az összegyűjtött adatok inkább arra engednek következtetni, hogy a hematopoietikus sejtek alosztályainak de novo termelése az életkorral, 4, 5, 6, 7 korszakkal eltolódik, hasonlóan a kezdeti fejlődés szűkebb időablakaihoz 8. Ezek a megállapítások nagymértékben megkérdőjelezték a klasszikusan meghatározó hematopoietikus őssejt (HSC) kritériumokat, mint a sejtek homogén populációját, differenciálódási képességgel az összes hematopoietikus vonal esetében. Ehelyett a HSC-k differenciálkapacitása pontosabban definiálható folyamatos többkamrás hematopoietikus kimenetként, amely azonban nem feltétlenül vonja maga után az összes vérsejttermelést minden időpontban.
Míg a felnőttek öregedésében bekövetkezett változások nagy része az 1. HSC funkció változásainak tulajdonítható, a HSC csoport egyes komponensei jelentős változást mutathatnak a 4., 9., 10. funkcióban. Amellett, hogy a különböző HSC-k különbözően vannak beállítva 5, 6, 11, amelyek fokozatosan megváltoztathatják a HSC-csoport összetételét 5, 6 éves kortól, egyéb mechanizmusok vezethetnek szegmentális változásokhoz a HSC-csoporton belül, beleértve a környezeti hatásokat, az egyenetlen szaporodást és a helyreállítást Az egyes sejtekben DNS-mutációk is lehetségesek. Így az egyes sejtek heterogenitását nem csak a kronológiailag régi sejtpopulációk értékelése veszi figyelembe.
Az öregedést mind a szervezet, mind a sejtek szintjén mozgató mechanizmusok jelentős figyelmet keltettek, mivel ezek a beavatkozás fő célpontjai. Például elhúzódó egészségi állapotról és hosszú élettartamról számoltak be különféle modellorganizmusokban kalóriakorlátozás és/vagy az IGF1 és mTOR 3 tengelyek manipulálása. Ezenkívül a régi sejtek fokozott működését javasolták a „fiatal” szisztémás tényezők révén12. Hogy ezek a megközelítések valóban tükrözik-e a sejtek szintjén a fiatalodást, vagy inkább az életkor által kevésbé érintett sejteket stimulálják, nagyrészt nem világos. Ez az aggodalom vonatkozik a korábbi vizsgálatokra is, amelyek megközelítik a sejtek öregedésének megfordítását a 13., 14., 15. szomatikus sejtek újraprogramozásával, amelyek általában nem tesznek különbséget a funkcionálisan és a kronológiailag régi sejtek között. Ehhez megbízhatóan meg kell határozni az újraprogramozáshoz használt specifikus szülői donorsejt funkcióját, amely klonális/egyedi sejtek szintjén történő értékelésre szorul.
Itt ezeket a kérdéseket fiatal és idős HSC genetikai vonalkódolásával kezeljük, amely lehetővé teszi a transzplantáció utáni regenerációs képességük értékelését klonális szinten. Ez lehetővé teszi számunkra, hogy megállapítsuk, hogy az öregedés a lymphoid potenciális HSC klónok csökkenésével és a myeloid potenciális klónok növekedésével jár. Funkcionálisan definiált régi HSC klónokból indukált pluripotens törzsvonalakat (iPS) állítunk elő, amelyeket további blasztocysta/morula komplementációval történő HSC-vel történő differenciálódás után értékelünk vérképességük szempontjából. Kísérleteink azt mutatják, hogy az összes vizsgált iPS klón, beleértve azokat is, amelyek kezdetben teljesen hiányozták a T- és/vagy B-sejtpotenciált, hasonlóan működnek, mint a fiatal egyensúlyi állapotú HSC-k (1 ° kimérák), bár kénytelenek regenerálni a lymphomyeloid hematopoiesist másodlagos transzplantációk. Ez a funkció ismét egybeesik a fiatal, nem régi HSC-kkel megosztott transzkripciós tulajdonságokkal. Ezért közvetlen támogatást nyújtunk ahhoz az elképzeléshez, hogy a HSC öregedésének számos funkcionális aspektusa megfordítható.
az eredmény
A HSC csoport klonális összetétele az életkor miatt
Az 1. és 2. lépésben a fiatal és idősebb HSC-ket izolálták, vonalkódolták és versenyképesen transzplantálták halálosan besugárzott fiatal gazdákba. A vonalkódolt sejtekből származó hosszú távú hematopoiesis meghatározása és kiértékelése után (3a. Lépés) a perifériás B, T és mieloid sejteket, valamint a BM erythroid sejt progenitorokat izoláltuk, és alapos szekvenálásnak vetettük alá őket, hogy megszakítsuk az alap vonalkódjaikat ( lépés (3b).). Ugyanakkor éretlen BM-sejteket izoláltunk régi HSC vonalkódokkal (1 ° transzplantációval) átültetett egerekből, amelyekből teljesen hiányzik a T-sejt rekonstrukció (a csökkent T-sejt termelés a HSC öregedésének jellemzője). A kapott iPS vonalak vonalkódjait megvizsgáltuk, hogy átfedik-e a 3a. Lépésben kapott egyes HSC vonalak potenciálját. Ezután öt iPS-vonalat használtak az iPS-kimérák előállításához blasztociszták és morulák kiegészítésével, amelyek vonalkódjai a myeloid vonalak letörésével társulnak (4. lépés). Az iPS kiméra HSC-jeit mind a vérképzés funkcionális, mind molekuláris paraméterei szempontjából megvizsgáltuk, és teljesítményüket összehasonlítottuk fiatalokkal (funkcionális és molekuláris vizsgálatok), középkorúakkal (molekuláris vizsgálatok) és régi HSC-kkel (molekuláris vizsgálatok; 5. lépés).
Teljes méretű kép
a ) Perifériás T-sejtek előállítása HSC-kből vonalkóddal 1 ° -os transzplantációban, iPS kimérákban és 2 ° transzplantációkban. Az összes vizsgált sejt közötti átlagos gyakoriság (%) ± sd látható (n = 5 és 22 egér iPS transzplantáció esetén 2 °). A FACS-parcellákban lévő sejteket egy, életképes CD45.2 +, GFP +, CD11b sejteken, valamint egyszeres, életképes CD45.2 +, CD11b blasztociszta sejteken (iPS kimérák) és 2 ° -os transzplantációkon pregegáljuk. b ) T-sejtek képződése kakukkfű iPS kimérákban és 2 ° -os transzplantációkban. A CD4-CD8-, CD4 + CD8-, CD4 + CD8 + és CD4-CD8 + átlagos gyakoriságát (%) ± sd a tesztelt sejtekből származó CD3 + timocita között a megfelelő kapuk jelzik. A sejteket egy, életképes -, CD3e +, CD45.1 +/CD45.2 + vonalakon pregegálják a fiatal kontrollok és a CD45.2 + iPS-ből származó sejtek számára. Az adatok egy kísérletből származnak (elsődleges és másodlagos kimérák) minden egyes iPS vonalon.
Teljes méretű kép
Asztal teljes méretben
Az iPS-ből nyert sejtek hematopoietikus újrapopulációs potenciáljának értékeléséhez tovább transzplantáltuk a blastocysta/morula kimérából származó BM sejteket letálisan besugárzott gazdákba (1. ábra, transzplantáció 2 °). Az elsődleges kimérákban az iPS-ből származó és endogén keverék miatt ezek a kísérletek versenyképesek. Ez azt mutatta, hogy mind az iPS-ből származó HSC-k (iPS-HSC-k) mennyiségi (donor eredetű sejtszintje), mind minőségi szempontból (az egyes értékelt vonalakhoz való hozzájárulás) hasonlóak voltak az endogén (fiatal) kontroll HSC-kéhez (1. táblázat). Mivel a szülői HSC-k teljesen hiányoznak a T-sejtvonalból (2f. És 3a. Ábra), vizsgálatainkat kiegészítettük a T-sejtek fejlődésének részletesebb elemzésével az iPS-ben és a 2 ° -átültetett kakukkfűekben (3. ábra). Ez feltárta a CD3 + CD4 - CD8-, CD3 + CD4 + CD8 +, CD3 + CD4 + CD8 + és CD3 + CD4 - CD8 + sejtek összehasonlítható gyakoriságát endogén (fiatal) kontrollsejtekkel (3b. Ábra), és ellenőrizték a perzisztens re - a T-sejtek kompetenciájának meghatározása a T-sejtekkel inkompetens szülői donorsejtekből.
Teljes méretű kép
vita
A legtöbb szerv felnőtt/szomatikus őssejtek olyan populációit tartalmazza, amelyek az életen át fenntartják a homeosztázist. Tekintettel az egyre növekvő bizonyítékokra, miszerint a felnőtt őssejtek nem kímélik az öregedést, ésszerűnek tűnik, hogy a szövetek funkciójának az életkor előrehaladtával történő jelentős csökkenése a hozzájuk kapcsolódó őssejtek megváltozott működésének köszönhető. Ugyanakkor az öregedő őssejtek minden csoportját potenciálisan heterogénnek kell tekinteni; vagy azért, mert az egyes őssejtek fiatal koruktól eltérően lehetnek előre beállítva, az egyes őssejtek felszabadulásának ontogenezisében tapasztalt különböző tapasztalatok, vagy ezen tények kombinációja. Ezért a sejtek öregedésének megfordításának kilátásait vizsgálva elengedhetetlen a funkcionális megközelítés, csak a kronológiailag régi sejtekkel szemben.
mód
Rosa26 rtTA egerek; A Col1a1 4F2A-t (4F2A egerek) dr. Rudolf Jaenisch és Jackson laboratóriumában szerezték be őket (raktárszám: 011004). Ezeknek az egereknek a sejtjei az okt4, Klf4, Myc és Sox2 expresszálják a doxiciklin 22 kiegészítést követően. Valamennyi egér C57BL/6 háttér volt, és a CD45.1, CD45.2 vagy F1CD45.1 x CD45.2 kongenerikus markerek kombinációját tartalmazta. Az állatokat a Lundi Egyetemen és a Koppenhágai Egyetemen állattartó létesítményekben helyezték el. Minden állatkísérletet a helyi etikai bizottságok jóváhagyásával hajtottak végre. A kísérletekhez hím és nőstény egereket is használtunk.
Immunfenotípusos elemzések és sejtszortírozás
A HSC öregedési klonalitásának vizsgálata
Az iPS sejtek levezetése
Specifikus kiméra egerek klónjainak előállítása és jellemzése
iPS kimérák. A kiválasztott iPS klónokat (eredetileg CD45.2 +) CD45.1 + /.2 + egerekből származó morulába és blasztocisztákba injektáltuk egy alapvető transzgenikus egér létesítményben (Koppenhágai Egyetem, Dánia). A kapott kimérákat megvizsgáltuk agouti szőrzetének színére, PCR-rel egy adott vonalkóddal szemben, és a CD45.2 + pozitív sejtek jelenlétét a PB-ben. 11-14 hetes korban kiméra egereket áldoztak fel, és BM-t, PB-t és kakukkfüvet összegyűjtötték elemzés céljából és a FACS általi válogatás céljából.
2 ° átültetés. Az iPS-eredetű HSC-k versenyképességének vizsgálatához négy-öt halálos besugárzott (950 cGy) 8-14 hetes CD45.1 + vagy CD45.1 + /.2 + F1 egeret ültettünk át 2x106 nem frakcionált BM sejtből. mindegyik iPS kiméra. A FACS PB rendszeresen értékelte a több vonalas rekonstitúciót.
Az iPS-ből származó HSC-k molekuláris hasonlóságának vizsgálatához a különböző kronológiai korú HSC-khez először 3 erősen expresszált HSC-vel kapcsolatos gént, 3 referencia gént (Actb, Hprt és Gapdh) és 42 gént választottunk ki az életkor miatt különböző módon HSC-ben. A második kategóriát a korábban közzétett mikrochip adatok elemzésével kaptuk fiatalok és idősebbek egyensúlyi állapotú HSC-jeiről (koronként hat mező). Az adatokat a próba szintű expressziós értékek RMA 25 alkalmazásával történő előfeldolgozásával, majd a dChip 26 segítségével tovább elemeztük, az összes részhalmazban 50-nél alacsonyabb expressziójú próbák kiszűrésével a zaj kiküszöbölése érdekében, és a differenciális expresszió 1,5-nél kisebb volt. Ezután fel- és lefelé szabályozott géneket alkalmaztunk génkészletként génkészlet-dúsítási elemzéshez. Az egyensúlyi állapotú fiatal és idős HSC tömbök közül 27-et és 42 gént választottunk ki ezen elemzések élvonalbeli génlistáiból.