elemeket

absztrakt

elektromágneses

Nanoplazmonikus molekuláris pásztázás mikrofluid csatornákban. ( a ) A nem specifikus kötés mind a receptor, mind a célmolekula koncentrációját lerontja, ha a csatorna nincs passziválva, ami késleltetett szenzorválaszhoz, valamint magas receptor- és célfogyasztáshoz vezet. A nyilak az analitmolekulák lehetséges kölcsönhatásának útját jelzik. ( b ) A csatornafelületek passziválása megfelelő blokkoló fajokkal csökkenti a nem specifikus kötődést, de a blokkoló molekulák a plazmon kimutatás legérzékenyebb térfogatának nagy részét foglalják el. ( c ) Az optimalizált nanoszlopon a fémrészecske növelésével a plazmonikus mezők elkülönülnek a szubsztráttól és a passzivációs molekuláktól. Ez a konfiguráció jelentősen megnöveli a szkennelés tényleges hangerejét és javítja az érzékelő általános teljesítményét.

Teljes méretű kép

Anyagok és metódusok

Érzékelő szubsztrátok előállítása

Az üveglemezeket (24 x 24 mm # 5) acetonban és izopropanolban 5 percig ultrahanggal tisztítottuk, majd titánnal (1 nm) és arannyal (50 nm) vontuk be permetezéssel a 2a. Ábra szerint. A szubsztrátumokat ezután rövid ideig oxigénplazmában kezeltük, majd a pozitív töltésű PDDA-t (polidialil-dimetil-ammónium-klorid, 0,2 térfogat% vízben, Sigma-Aldrich) öntöttük, amint az a 3. ábrán látható. 2b. Rövid vízzel történő öblítés után negatív töltésű polisztirol (PS) gyöngyök (0,1% vízoldat, Microparticles GmbH, Németország) oldatát öntöttük a hordozókra (2c. Ábra). Az alkalmazástól függően vagy a PS gyöngyöket eltávolították az aljzat felületének feléről egy kocka csík segítségével, vagy a hordozókat PDMS mikrokontakt nyomtatással mintázták (2d. Ábra). Az önállóan összeállított PS gyöngyök maszkként működtek az ezt követő ionnyaláb-őrlés során (Ionfab 300, Oxford Instruments, Egyesült Királyság; 2e. Ábra). A PS gyöngyöket ezután egy kockával eltávolítottuk, és a szubsztrátumokat oxigénplazmában kezeltük a maradék PDDA-fragmensek eltávolítása céljából (2f. Ábra).

Nanoszférák készítése nanoszlopokkal. A gyártási folyamat lépései a következők:( a ) az anyag porlasztása; ( b ) pozitív töltésű polimer film öntése; ( c ) negatív töltésű polisztirol (PS) gyöngyök önálló összeszerelése; d ) opcionális mikroképalkotás PDMS bélyegző alkalmazásával; e ) ionnyaláb őrlés; ( f ) a maradék PS gyöngyök eltávolítása a szalag lehúzásával; ( g ) az üvegszubsztrát maratása a BOE-be; h ) végső mikroszkóp arany nanodiszkákkal üveg nanoszlopokon.

Teljes méretű kép

PDMS struktúrák gyártása

A mikrokontakt nyomdai formát lézer-litográfiával készítettük szilíciumlemezen (mrDWL 5-negatív fotoreziszt, Allresist GmbH, Németország). A folyamat paramétereit a gyártó ajánlásai szerint hangolták. A buborék nélküli PDMS-keveréket (10: 1, Sylgard 184 készlet, Dow Corning, USA) 250 fordulat/perc sebességgel vontuk be a formára. Miután sötétben tartott

40 óra alatt ez a folyamat végső PDMS vastagságot eredményezett. 0,75–1 mm. A ragadós PDMS membránt gondosan lehámozták, PS bevonatú arany szubsztrátumra hengerelték, ahol 10-20 másodpercig érintkezésben tartották, majd egy folyamatos mozdulattal eltávolították. A mikrofluidikus PDMS előállítási módszerének részletes leírása megtalálható másutt 31, 32 .

Optikai spektroszkópia

Az átlagolt extinkciós spektrumokat UV-VIS-NIR spektrofotométerrel rögzítettük (Cary 2000, Agilent Technologies, USA). Az egyes pásztázó foltok LSPR hullámhosszának valós idejű monitorozását házi oltószerelvény segítségével hajtottuk végre, egy kollimált szálkapcsolású fényforráson (HL-2000, Ocean Optics, Dunedin, USA) és egy szálkapcsolású spektrométeren (BRC711E, B&W). Tek, USA). Több pásztázó folt egyidejű mérését egy inverz mikroszkóp (Eclipse Ti-E, Nikon, Japán) köré épített 33, 34 hiperspektrális képalkotó eszközzel, hangolható folyadékkristályos szűrővel (LCTF, 650–1100 nm spektrális tartomány, 7 sávszélesség, 1 nm felbontású, Varispec SNIR modell, PerkinElmer, USA) és CMOS kamera (Neo5, Andor Technologies, Egyesült Királyság). Rendszerünket kifejezetten többféle szkennelési hely párhuzamos valós idejű vizsgálatához és menet közbeni elemzéséhez terveztük az összes alapvető optikai alkatrész szinkronizálásával és vezérlésével egyedi Labview kód használatával.

Elektrodinamikai szimulációk

Az optikai spektrum és a közeli terepi eloszlás szimulációit az idő-differenciális időtartomány (FDTD) (Lumerical, Inc., Kanada) kereskedelmi megvalósításával hajtottuk végre, az aranyra vonatkozó optikai állandókkal 35 alapján, és a teljes mező/szórt mező formulázással. = 172, 200 vagy 280 nm, vastagság t = 60 nm, a felső és az alsó él görbülete 5 nm sugárral és 20 ° -os oldalsó kúpos szöggel. A hordozó/oszlop tartó RI-jét n = 1,52-re állítottuk, és a szerkezeteket víz vette körül (n = 1,33). A szembőség 4 nm volt, de a korongok és maratott profilok körül 0,5 nm-re állítottuk be.

Felületi kémia

Először 0,1 mM SH-PEG-metoxi-oldatot (5 kDa, Rapp Polymere, Németország) feloldunk etanolban 50 ° C-on. A szubsztrátumokat egy éjszakán át PEG-oldatba merítjük, majd alacsony hőmérsékletű hőkötéssel ( 40 ° C) 2-3 órán át. Az anti-PEG immunglobulinokat Gs (IgG) E11 és E6.3 50% -os glicerinben, 400 μg ml-1 koncentrációban vettük fel (36. hivatkozás). A neutravidint (NTV; ThermoFischer Scientific) 50 μg ml-1 koncentrációig feloldottuk a megfelelő puffer (ek) ben, és ezt használtuk fel.

Eredmények és vita

Jól megalapozott, olcsó és méretezhető kolloid litográfiai eljárást 37 használtunk, hogy jól definiált rövid hatótávolságú arany nanodisk mintákat készítsünk szabványos üvegmikroszkóp tárgylemezeken. A megfelelő gyártási lépéseket sematikusan mutatjuk be a 2a - 2f ábrákon, ahol egy opcionális lépést (2d. Ábra) is beiktattunk a kétdimenziós mikromintavételezésbe, amely Andersson et al. 38. Ez a gyártási protokoll teljes mértékben kompatibilis a mikrofluidikus eszközökkel és az Aćimović és mtsai által korábban kidolgozott vizsgálati protokollokkal. 32. Az ezzel a módszerrel elérhető kontraszt a nanorészecske és a nem nanorészecske régió között kiváló, amint azt a kiegészítő ábra mutatja.

A nanodisc szubsztrátok adják a kiindulási pontot a nedves maratáshoz (2g. Ábra), hogy keskeny oszlopokon nanodiscsákat képezzenek, amint arról Otte és munkatársai beszámoltak. 29. Szabványos pufferolt oxidmarást alkalmazunk (BOE, 15% -os fluoridos sav). Miután a mintákat vízzel óvatosan leöblítették, hogy megállítsa a maratási folyamatot, a mintákat nitrogénáram alatt szárítják. A szárítás során a vékony vizes réteg visszahúzódásából eredő felületi feszültség a nanorészecskék törését okozhatja, és ez a hatás korlátot szab annak, hogy a nanoszlop milyen vékony lehet, ami viszont korlátozza az EM elválasztás eléréséhez szükséges minimális nanodisc átmérőt. Emiatt a nagyobb átmérőjű arany nanolemezekre összpontosítottunk, mint amit korábban megvizsgáltunk 29 .

A 3. ábra összefoglalja a morfológiai változásokat a maratási idő függvényében három különböző Au nanodisc minta esetében, amelyek d = 170–290 nm. Feltételeztük, hogy a maratás mértéke anizotrop lehet a háromdimenziós nanoszerkezetű táj miatt. Ennek a lehetőségnek a kipróbálására először a vertikális maratás sebességét határoztuk meg profilmérővel történő pásztázással a határokon, d = 290 nm nanodiscsekkel. Amint az a 3a. Ábrán látható, ezek az adatok kiválóan egyeznek laboratóriumunkban a BOE ismert névleges üvegmaratási sebességével (

90 nm min-1). Ezután a szubsztrátumokat letapogató elektronmikroszkóppal (SEM) 70 ° -os dőlésszögben ábrázoltuk, hogy megbecsüljük az oldalsó maratás mélységét közvetlenül a nanolemezek alatt (d - d ′)/2, ahol d ′ az átmérő a nanolemezhez legközelebb eső nanoszlop. A 3a. Ábra adatai 77,5 nm min-1 (lineáris illesztés) laterális maratási sebességet mutatnak, ami jelentős, de kedvező maratási anizotropiát mutat, valószínűleg a diffúziós inhomogenitás következtében. Végül a SEM képelemzés alapján megbecsültük a minimálisan mechanikailag stabil nanoszlop átmérőt d be50 nm-nél. A 3b. Ábra összehasonlítja a lekéretlen lemezeket (balra) és a nanoszlopokkal támogatott lemezeket d = 50 nm (jobbra).

Nanoszlopok létrehozása arany nanolemezek alatt maratással a BOE-ben. a ) Függőleges (vörös adatpontok) és oldalirányú (fekete pontok) üvegmaratási mélység különböző átmérőjű arany nanodiszkákkal borított hordozóknál d. Névleges maratási sebesség kb. 90 nm min-1 szaggatott vonallal van jelölve. A hibasávok az adatkészletek szórását jelentik. ( b ) Különböző d átmérőjű módosítatlan és maratott arany nanolemezek reprezentatív populációinak 70 ° -os dőlésszögben készült SEM képei (skála skála = 100 nm).

Teljes méretű kép

Teljes méretű kép

Az FDTD módszerrel elektrodinamikai számításokat végeztünk, hogy igazoljuk az EM részleggel szemben támasztott igényünket és jobban megértsük az optimális szerkezeti paramétereket. Kiszámítottuk a d = 172, 200 és 280 nm átmérőjű egyes nanodiszkák optikai válaszát, amelyek szorosan megfelelnek a kísérleti értékeknek, de a számítási idő és a modellezési erőfeszítések rövidítéséhez izotróp maratási dinamikát feltételeztünk. Amint a 4c. Ábra összefoglalja, a számított csúcspozíciók hasonló exponenciális tendenciát mutatnak, mint a kísérletek során megfigyelt tendencia. Az LSPR vonal szélessége szintén exponenciális bomlást mutat (4c. Ábra, betét), bár a kísérletek csak a teljes szélesség általános csökkenését mutatták a maximum felére, valószínűleg az inhomogén tágulás következtében, például a PS gyöngyök polidiszperzitásának méretétől függően (ábra (4b. Ábra). A számítások azt mutatják, hogy a rezonáns fennsíkok nem teljesen síkak, részben a feltételezett izotrop és nem anizotrop maratás miatt, de nagyon alacsony meredekségűek az idő múlásával. Megvizsgáltuk a rezonáns helyzet levezetését a maratási mélység függvényében, hogy meghatározzuk a kiválasztott minimális nanorészecske-átmérő d = 50 nm-nél elérhető legnagyobb EM leválás mértékét (4d. Ábra). Az adatok azt mutatják, hogy a minimális abszolút érték,

Az adszorbeált réteg 0, 12 nm/nm vastagságát kapjuk 200 nm lemezekre. A kezdeti deriválták nulla maratási mélységben a lemezek reakcióját jelentik egy végtelenül vékony rétegre, amelynek RI = 1,52 képződik az üvegen. 200 nm-es lemez esetén ez az érték

A d = 50 nm oszlop által támogatott ugyanazon lemez derivált értékének 40-szerese. Így a nanodiszk lényegében elválik a szubsztrátumtól az optimálisan maratott szerkezet érdekében. A 4e. Ábra szemlélteti a közeli mező EM intenzitásának a rezonancia során bekövetkező változásait ebben a két korlátozó esetben, jelezve az oszlop által támogatott nanodiszka szubsztrátja és szubsztrátja közötti térbeli átfedés jelentős csökkenését.

Az EM szétválasztás előnyének bemutatására a bioszenzoros alkalmazásoknál úgy döntöttünk, hogy egy egyszerű, az ideális tesztelési stratégiára emlékeztető modellrendszerrel dolgozunk, amint az az 1b. És 1c. Ábrán látható. Az NTV-t passziváló entitásként használjuk, mivel üvegén szinte visszafordíthatatlan adszorpciója van semleges pH 40 mellett. A receptor egy 5 kDa-os tiol-PEG-metoxi, amely kizárólag az aranyhoz kötődik és hatékonyan taszítja a fehérjéket 41, ezáltal kielégítve a passziváló fajok és a receptor biológiai felismerési rétege közötti alacsony keresztszennyeződés követelményét. Először a PEG-vel bevont nanodiszkák NTV-re (50 μg ml-1) adott LSPR-válaszát vizsgáltuk, amely várhatóan szinte kizárólag az üvegszubsztrátumhoz kötődik. Az 5a. Ábra összefoglalja a reakciót az NTV 210 nm-es lemezekkel történő injektálása után, amelyeket 0, 10, 30 és 50 másodperces maratásnak tettek ki BOE-ben. A leghosszabb rézkarc ideje, amely lényegesen rövidebb, mint 65 s, a 210 nm-es lemezek határértéke, a válasz körülbelül nagyságrenddel csökken a nem rajzolt esethez képest (az abszolút csúcseltolódást lásd az 5a. Ábra betétjében). értékek).

Teljes méretű kép

25%. Így arra a következtetésre juthatunk, hogy a nanolemezes LSPR szenzorok összes alapvető érzékelési jellemzője javul az EM leválasztásával, amint azt az 5b ábra beszúrása összefoglalja.

Az oszlop által támogatott lemezek kompatibilitása a keresztbeállítás és a PDMS mikrofluidikus interfészbe történő nagyméretű beolvadással. a ) Az eszköz része, ahol 64 fényes négyzet (a csatornák és a mikropátia plazmonikus szubsztrát közötti járatoknál) 64 pásztázási pontot képvisel. Ezeket a helyeket használták a szkennelési helyek mintavételi idejének és zajfüggetlenségének ellenőrzésére (az adatok nem láthatók). A betéten az eszköz (24 × 24 × 5 mm) látható az érme mellett (1 SEK). ( b ) Valós idejű szenzogram, amely összehasonlítja az anti-PEG IgG két típusának kölcsönhatását az antitestkoncentráció függvényében.

Teljes méretű kép

következtetések