absztrakt
Nemrégiben beszámoltunk arról, hogy a biológiailag lebontható poli [α- (4-amino-butil) -L-glikolsav] (PAGA) képes kondenzálódni és megvédeni a plazmid DNS-t az DNáz I-től. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a pCAGGS szisztémás beadása egér IL-10-nek mIL -10) A PAGA-val komplexált expressziós plazmid csökkentheti az inzulitis kialakulását nem elhízott diabéteszes (NOD) egerekben. A plazma PAGA/mIL-10 komplexek több mint 60 percig stabilak voltak, de a meztelen DNS-t 10 percen belül DNase I roncsolta. A PAGA/DNS komplexeket 3 hetes NOD egerek farokvénájába injektáltuk. A szérum mIL-10 szintje az injekció beadása után 5 nappal tetőzött, és több mint 9 hétig volt kimutatható. A 12 hetes NOD egerekben a súlyos inzulitis prevalenciája szignifikánsan csökkent a PAGA/DNS komplex intravénás injekciójával (15,7%) a meztelen DNS (34,5%) és a kezeletlen kontrollok (90,9%) injekciójához képest. Összefoglalva, a pCAGGS mIL-10 plazmid/PAGA komplexek szisztémás beadása csökkentheti az inzulitis súlyosságát a NOD egerekben. Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a PAGA/DNS komplex képes megakadályozni az autoimmun diabetes mellitus kialakulását.
Az 1-es típusú cukorbetegség kóros jellemzője a hasnyálmirigy-szigetek β-sejtjeinek sejtközvetített autoimmun pusztulása (inzulitisz). Egy nemrégiben végzett tanulmány kimutatta, hogy az immunszuppresszív citokin plazmidok intramuszkuláris injekciója hatékonyan elnyomhatja az autoimmun cukorbetegség progresszióját 1-es típusú cukorbetegség állatmodelljében (nem elhízott cukorbeteg egér, NOD egér).
A meztelen plazmid intravénás beadását a májban, a tüdőben és a lépben fejeztük ki. Ugyanakkor a plazmid DNS-t gyorsan eltávolítják a vérkeringésből, mivel kiterjedt májfelvételük és a plazma nukleáz által történő gyors lebomlása miatt.456 Bár kimutatták, hogy a komplexképződés, különösen kationos liposzómákkal, növeli a DNS stabilitását és a génexpressziót, a plazmid még mindig gyorsan eltávolítható plazmából. a keringés és a liposzóma/plazmid komplexek mérgezőek a sejtekre.78 Nemrégiben szintetizáltunk egy biológiailag lebontható kationos polimert, a poli [α- (4-amino-butil) -L-glikolsavat)] (PAGA). Ez a polimer hatékonyan kondenzálja a DNS-t, és kevésbé citotoxikus, mint a PLL. A PAGA biológiailag lebontható, nem toxikus a sejtekre, és fokozza a transzfekciót a tenyésztett sejtekben. . Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy a szintetikus PAGA in vitro növelte a pCAGGS mIL-10 plazmid transzfekciós hatékonyságát. A plazma PAGA/mIL-10 komplexek intravénás injekció után juttathatók a májba, és a komplexek elnyomhatják az autoimmun inzulitis progresszióját NOD egerekben.
az eredmény
In vitro készítmény és jellemzés
Gél retardációs vizsgálatot végeztek a PAGA/plazmid komplexek önfelépülésének megerősítésére. A PAGA/plazmid komplexek növekvő arányát 1,0% -os agarózgél-elektroforézissel azonosítottuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a PAGA 2: 1 (+/-) töltési arányban képes kis részecskékké kondenzálni a plazmid DNS-t (1. ábra). A PAGA komplexek átlagos tényleges átmérője (2: 1, +/-), fényszórással meghatározva, 179 nm volt. A DNáz I jelenlétében mutatott stabilitás a szisztémás génbevitel egyik alapvető paramétere. A DNáz I stabilitási vizsgálat eredményeit a 2. ábra mutatja. Az összes meztelen DNS 10 percen belül megsemmisült, de a PAGA több mint 60 percig védi a DNS-t a DNáz I-től.
A PAGA/DNS komplexet agaróz gél retardációs elektroforézissel elemeztük. 1. sáv, PAGA/DNS töltési arány 2: 1 (+/−); 2. sáv, 1: 1; 3. sáv, 1: 2, 4. sáv, 1: 3; 5. sáv, meztelen DNS. A PAGA 2: 1 töltési arányban (+/−) képes volt megfogni a DNS-t.
Teljes méretű kép
A PAGA/DNS komplexek hasítása DNáz I emésztéssel A PAGA/DNS komplexeket 2: 1 (+/-) arányban állítottuk elő és 37 ° C-on inkubáltuk. A plazmid DNS disszociálásához a PAGA-ból 37 μl 1,0% SDS-t adtunk. hozzáadjuk, és a komplexet egy éjszakán át 65 ° C-ra melegítjük. A DNS-t 1,0% -os agaróz gélen választottuk el. a) meztelen DNS; b) PAGA/DNS komplex. A PAGA 60 percnél hosszabb ideig képes volt megvédeni a DNS-t.
Teljes méretű kép
In vitro transzfekció
Megvizsgáltuk, hogy a PAGA fokozottan befolyásolja-e a plazmid 293T sejtekbe történő bejuttatását (ATCC, Rockville, MD, USA). A PAGA által közvetített transzfekció hatékonysága 293T sejteken szignifikánsan magasabb volt, mint a meztelen DNS (P
A PAGA/DNS komplex DNS in vitro transzfekciós hatékonysága 293T sejtekben (1 μg DNS/üreg, 2 x 104 sejt/lyuk). 24 órás tenyésztés után a tenyészközeget összegyűjtjük, és az mIL-10 szintjét ELISA-val mértük. Az értékek az átlagot és a szórást jelzik.
Teljes méretű kép
Az mIL-10 mRNS RT-PCR kimutatása a NOD egerek májában
Meghatároztuk az intravénásan injektált PAGA/DNS komplexből RT-PCR-rel átírt mIL-10 mRNS jelenlétét. Az RT-PCR-termékek kizárására a szennyezett pCAGGS-plazmidból vagy az endogén mIL-10 mRNS-ből primereket terveztünk, hogy tartalmazzák a pCAGGS-mIL-10 plazmid intronszekvenciáját. A kívánt RT-PCR termék mérete 222 bázispár volt. Ennek eredményeként mIL-10 mRNS-t detektáltak a májban intravénás injekció után mind meztelen, mind PAGA/DNS komplex csoportokban (4. ábra). A meztelen csoport májában azonban az mIL-10 plazmid expressziója 5 héttel az injekció beadása után csökkent, míg a PAGA/DNS komplex csoport hasonló mértékű expressziót mutatott az injekció után 9 hétig. A lép és a hasnyálmirigy RT-PCR termékét nem azonosították.
NOD egerek májszövetének RT-PCR-je PAGA/DNS-komplexek intravénás injekcióit követően (144 μg PAGA/100 μg DNS, 2: 1, +/-). 1-5. Sáv, csoport PAGA/DNS komplex injekcióval; 6-10 sáv, DNS-sel töltött csoport; M sáv, molekuláris marker; C csoport, a csoportba PAGA-t injektáltunk. 1. és 6. sáv, 1 héttel az injekció beadása után; 2. és 7. sáv, 2 hét; 3. és 8. sáv: 3 hét; 4. és 9. sáv, 5 hét; 5. és 10. sáv, 9 hét.
Teljes méretű kép
Az mIL-10 és az inzulitis in vivo expressziója
Megvizsgáltuk, hogy vajon a NOD egerek inzulitisa szuppresszálható-e a PAGA/mIL-10 plazmid komplex intravénás injekcióit követően. Három hetes nőstény NOD egereknek egyszer 100 μg PAGA-val komplexelt mIL-10 plazmidot (PAGA: DNS töltésarány = 2: 1, 200 μl, pH 7, 35 foszfáttal pufferolt sóoldat) injektáltunk a farokvénába. A tervezett időpontokban a NOD egereket feláldozták vérminták és máj vételére. Az egér szérum IL-10 szintjét ELISA módszerrel mértük 1, 2, 3, 5 és 9 héttel a szisztémás beadás után. A PAGA/pCAGGS egér IL-10 plazmid komplexével (PAGA/DNS komplex csoport) injektált egerek szérum mIL-10 NOD szintje szignifikánsan megemelkedett, és az mIL-10 expresszió több mint 9 hétig a kontroll szint felett maradt (P
Egér szérum IL-10 koncentráció. Minden NOD egér intravénás injekcióban kapott DNS vagy PAGA/DNS komplexeket (2: 1, +/-, 100 μg DNS egérenként) 3 hetes korban. A szérum mIL-10 szinteket ELISA-val mértük 1., 2., 3., 5. és 9. héten. A 0. napon egyetlen injekciós csoportot (kontroll) sem vizsgáltunk. Az értékek az átlag ± sem értéket mutatják
Teljes méretű kép
Az inzulitis elnyomása NOD egerekben, miután PAGA/DNS komplexeket (2/1, +/−) injektáltunk a farokvénába egérenként 100 μg pCAGGS mIL-10 plazmid dózisban. Az inzulitist úgy értékeltük, hogy minden hasnyálmirigyből több mint 20 szigettel festettük meg a hematoxilin-eozint, és értékeltük az inzulitis progresszióját. a) PAGA-val injektált csoport; (b) egy csoport, amelybe PAGA/DNS komplexet injektáltunk; (c) csupasz DNS-sel injektált csoport; d) 0. fokú inzulitis; e) 2. fokozatú inzulitis; és f) 4. fokozatú inzulitis.
Teljes méretű kép
vita
Az autoimmun diabetes mellitus egyértelmű jelölt a génterápiára. Elvileg az autoimmun cukorbetegség kezelésének legjobb módja az lenne, ha azonosítanák a veszélyeztetett embereket és kezelnék őket a szigetek károsodásának megelőzése érdekében.
A génterápiában a betegségek kezelésének legfőbb akadálya a plazmid átmeneti expressziója és alacsony transzfekciós hatékonysága volt. Az ismételt intravénás injekciók jelenthetnek megoldást ezen főbb akadályok leküzdésére. Korábbi tanulmányok azt találták, hogy az intravénásán injektált meztelen DNS expressziós szintje nem volt kimutatható. 10111 Egy nemrégiben végzett tanulmány azonban azt mutatta, hogy az expressziós szint magas volt nagy mennyiségű meztelen DNS gyors intravénás injekciójához.12 A meztelen DNS intravénás beadása továbbra is kihívást jelent. A plazmid védelme a nukleáz általi lebontástól magasabb transzfekciós hatékonyságot eredményezhet
A génterápiás rendszerek fejlesztése szempontjából fontos a DNS sikeres eljuttatása a citoplazmából a sejtmagba. Biológiailag lebontható kationos polimereket vezettek be olyan gén-szállító rendszerként, amelyek javíthatják a transzfekció hatékonyságát. Kondenzálhatják a DNS-t és megvédhetik a nukleáz általi lebontástól. Nagy és hosszan tartó plazmid expressziót értünk el biológiailag lebontható karnitin-észterrel egerek intravénás beadása után.
A szintetizált biológiailag lebontható génrendszer másik típusa a kationos lipidek. A kationos lipidek magasabb transzgén expressziót indukáltak, mint más liposzómák, és a sejtekben való lebontásuk növelte a DNS-t intracelluláris sejtek nélkül.16 Megállapítottuk, hogy az intravénásán injektált biológiailag lebontható PAGA/DNS komplexek magas és hosszú távú expressziót váltottak ki a NOD egerekben. Ez az eredmény arra utal, hogy a PAGA degradációja növelheti a DNS-t intracelluláris sejtek nélkül. További vizsgálatra van még szükség.
A transzfekció hatékonyságának javítása érdekében a kationos hordozó/DNS komplex endoszóma felszabadítása és disszociációja szükséges a transzkripció előtt. A túlzott pozitív töltés akadálya lehet a kationos hordozó/DNS komplex disszociációjának. 1718 A PAGA/DNS komplexet 2: 1 (+/−) töltési arányban használtuk, ami minimális, túlzott pozitív töltés volt.
A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az autoreaktív mononukleáris sejtek szigetekbe való beszivárgása (inzulitisz) az 1. (Th1) és a 2. (Th2) típusú segítő sejtek által kiválasztott citokinek egyensúlyhiánya miatt következik be. 1920 Th1 sejt szekretált gyulladásgátló citokinek (IFN-γ és IL-2) növelik a gyulladásos és a sejtek által közvetített immunitást, míg a Th2 szekretált gyulladásgátló citokinek (IL-4, 5, 6, 10 és 13) stimulálják a humorális immunitást . a sejtek közvetítik az autoimmun inzulitist. A NOD egerekben a Th1 sejtek aktiválódását az mIL-10 elnyomta, ami megelőzheti az inzulitist és a cukorbetegséget. 232425 Ez a rekombináns citokinterápia alacsony biológiai hozzáférhetőséget, kémiai instabilitást és modulált immunválaszt mutatott. Az NIL-ben a cukorbetegség kialakulásának megelőzése mIL-10 esetén életkorfüggő. Korábbi adatok azt mutatták, hogy fiatal korban injekcióra van szükség.1 Ezért a PAGA/DNS komplexet 3 hetes NOD egerekbe injektáltuk az inzulitis megelőzése érdekében. A pCAGGS plazmid nem okoz IL-10.1 szintek nem specifikus indukcióját
Röviden: a biológiailag lebontható kationos polimer PAGA kondenzálni tudta a pCAGGS egér IL-10 plazmidot, megvédte a DNáz I-től és növelheti a transzfekció hatékonyságát 293T sejtekben. A pCAGGS mIL-10 plazmid/PAGA komplexek szisztémás beadása csökkentheti az inzulitis súlyosságát a NOD egerekben. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a PAGA kiváló géntranszfer hordozó az mIL-10 plazmid intravénás injekciójához.
Anyagok és metódusok
A PAGA szintézise
A CBZ-L-oxilizint a CBZ-L-lizinből nátrium-nitrit és kénsav diazotálásával szintetizáltuk, majd etil-éterrel extraháltuk, majd kerozinnal kicsaptuk. A CBZ-L-oxilizint 150 ° C-on, 10-4 Torr vákuumban, 5 napig tartó kondenzációval polimerizáltuk. A lehűtött polimert kloroformban oldjuk és metanollal kicsapjuk. A szárított polimert DMF-ben oldjuk, amely palládium-szén katalizátort tartalmaz, és 85% hangyasavat adunk proton donorként. 15 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd a polimer oldatot szűréssel izoláljuk a katalizátortól. 2 N sósavat adunk hozzá, és a polimert acetonnal kicsapjuk. A PAGA-t felhasználásig -70 ° C-on tároltuk.
Három hetes NOD egereket vásároltunk a Jackson Laboratories-tól (Bar Harbor, ME, USA), és specifikus kórokozóktól mentes körülmények között tartottuk fenn. A NOD egereket ütemezett időpontokban méhnyak diszlokációval feláldoztuk altatás után metoxi-flurán inhalációval (Schering-Plough Animal Health, Union, NJ, USA).
A pCAGGS mIL-10 plazmid előállítása
Az IL-10 pCAGGS plazmid DNS egér expresszióját amplifikáltuk az Escherichia coli (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) és a tisztított Qiagen Plasmids Maxi Kits (Qiagen, Valencia, CA, USA) DH5a szubklónozási hatékonyságában. A plazmid DNS-készítmény tisztaságát és azonosságát az abszorbancia 260 nm-en és 280 nm-nél történő mérésével és az emésztett plazmid restrikciós enzim gélelektroforézissel igazoltuk.
PAGA/DNS komplex előállítása
PAGA/DNS komplexeket házon belül készítettünk. 1,5 mg PAGA-t feloldunk 1 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS, pH 7, 3). Száz mikroliter PAGA-oldatot adunk 900 μl PBS-hez. Tíz mikroliter hígított PAGA-oldatot adtunk lassan cseppenként 1 μl előkészített DNS-gén-plazmidhoz (1,0 mg/ml), és 30 percig hagytuk (PAGA/DNS töltésarány 2: 1). A PAGA/DNS komplex képződését rutinszerűen, 1,0% -os agaróz gél elektroforézissel követtük nyomon. 2627 A PAGA/DNS komplex részecskeméretét dinamikus fényszórással határoztuk meg (BI-2030AT; Brookhaven Instruments, Holtsville, NY, USA).
A PAGA/DNS komplexek stabilitása
A PAGA: DNS komplex töltésaránya (+/-) 2,0 volt PBS-ben. A komplexképződés után a DNáz I-t (10 egység, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) adtuk a komplex oldathoz, és a komplex szuszpenziót 37 ° C-on 60 percig inkubáltuk. Az inkubálás után 0, 2, 5, 10, 20, 40 és 60 perc múlva 50 μl mintát vettünk a komplex szuszpenzióból, és összekevertünk 75 μl stopoldattal (4 M ammónium-acetát, 20 mM EDTA és 2 mg/ml). . ml) és jégre helyezzük. A plazmid DNS PAGA-tól való leválasztásához 37 μl 1,0% SDS-t adtunk hozzá, és a komplexet egy éjszakán át 65 ° C-on melegítettük. Fenollal és kloroformmal végzett extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A pelleteket 10 μl TE pufferben oldjuk, és 1,0% agaróz gél elektroforézisre visszük fel.
In vitro transzfekció
Az NIH 293T sejteket (ATCC, Rockville, MD, USA) 24-lyukú lemezeken (Corning, NY, USA) tenyésztettük 2x104 sejt/üreg koncentrációban 24 órán át. A tenyészeteket DMEM-ben (Gibco-BRL) kezdtük meg, amely 10% magzati szarvasmarha-szérumot tartalmaz, 100 E/ml penicillinnel kiegészítve, 37 ° C-on 24 órán át, 5% CO 2 -val. A táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket PBS-sel mostuk. Transzfekciós tápközeg hozzáadása után 293T sejteket inkubáltunk 24 órán át, majd a táptalajt összegyűjtöttük és -70 ° C-on tároltuk, amíg fel nem használtuk az mIL-10 expressziós vizsgálathoz.
Fordított transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR)
A teljes RNS-t izoláltuk a NOD egérmájából ütemezett időpontokban egy GlassMAX RNS mikroizolációs centrifugapatron rendszer alkalmazásával (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). A reverz transzkripciót 37 ° C-on 1 órán át hajtottuk végre reverz transzkriptáz (Qiagen) és reverz primer alkalmazásával. A specifikus oligonukleotid primerek az 5'-GCTGGTTATTGTGCTGTCTC-3 'előreindító, az 5'-CTCTAGGAGCATGTGGCTCT-3' fordított primerek voltak. Ezeket a primereket úgy tervezték, hogy tartalmazzanak egy intronszekvenciát, hogy meg lehessen különböztetni a plazmid-DNS vagy a genomi DNS-szennyezés lehetséges PCR-termékeit.1 A következő PCR-reakcióciklust alkalmaztuk: 40 ciklust 94 ° C-on 1 percig, 60 ° C-on 1 perc és 72 ° C 1 perc 30, majd 10 perc hosszabbítás 72 ° C-on. A várt termékek hossza 222 bázispár volt. A PCR-termékeket elektroforézissel elemeztük 1,0% -os agarózgélen, amelyet etidium-bromid festéssel láttunk UV-fényben.
Egér IL-10 teszt és az inzulitis mérése NOD egerekben
Statisztikai analízis
Az IL-10 koncentráció összehasonlítását Student t teszttel végeztük. A 0,05 alatti P értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.
köszönöm
A szerzők köszönetet mondanak az Expression Genetics Inc.-nek pénzügyi támogatásukért és Jun-Ichi Miyazakinak, a japán Oszakai Egyetemnek a pCAGGS mIL-10 plazmid nagylelkű adományozásáért. Szeretnénk köszönetet mondani Troy Kochnak a technikai segítségért.