absztrakt

A fő

A genotípusos HLA-azonos csontvelő-transzplantációval (BMT) összehasonlítva a nem kapcsolódó donor-ojtással (URD) ​​magasabb halálozási arány társul. A súlyos akut graft-versus-host betegség (aGVHD) és a graft meghibásodása a transzplantációval összefüggő mortalitás (TRM) fő oka ebben a helyzetben, és összefüggésben állhat a HLA inkompatibilitás mértékével.

A HLA-tipizálás korábbi standardjai magukban foglalták a HLA-A és -B molekulák szerológiai módszereit és a DNS-alapú HLA-DRB1 tipizálást. A donor-recipiens identitás A HLA-DRB1 csökkenti az aGVHD kockázatát és javítja a túlélést az URD-BMT után.5678 Azonban az aGVHD, a graft meghibásodása és a halál kockázata továbbra is magasabb azoknál a betegeknél, akiket HLA-A, -B és -DRB1. a HLA-azonos testvérekkel átültetettek között.1 A legújabb tanulmányok szerint ezek a szövődmények a HLA-A és -B közötti különbségek következményei lehetnek a beteg és a donor között.89101112 Valójában több mint 300 allélt írtak le molekuláris szinten. 85 szerológiailag meghatározott I.13. Osztályú antigén Ezen túlmenően, a szerológiailag a HLA-A és -B 'páros' párok gyakran ellentétesek a HLA-C-vel.141516 Az ilyen eltérések klinikai következményei azonban nem egyértelműek. Petersdorf és munkatársai tanulmányában. A 10 HLA I. osztálybeli eltérés jobban korrelált a graft meghibásodásával, mint az akut GVHD-vel, és csak a többszörös eltérések esetén befolyásolta a túlélést. Ezzel szemben Sasazuki és mtsai (9) tanulmányában még egy HLA-A vagy B eltérés is befolyásolta a túlélést a súlyos akut GVHD növekedésével. Ebben a tanulmányban a C-lokusz eltérése csökkent relapszusszámmal társult, és az I. osztály eltérésének a klinikai eredményre gyakorolt ​​hatása még fontosabbnak tűnt, mint a II.

A molekuláris tipizálás mellett sejtalapú vizsgálatokat fejlesztettek ki, hogy megjósolják a HLA I. osztályú különbségek hatását az aGVHD valószínűségére. Ezek abból állnak, hogy meghatározzák a citotoxikus donor T-sejt prekurzorok (CTLp) gyakoriságát anti-recipiens specifitással (GVHD irány). 17 Az alacsony CTLp frekvenciák szorosan korrelálnak a HLA-A és -B azonosakkal.

Mivel az URD-BMT használata a donorregiszterek méretének növekedésével nőtt, sürgősen további adatokra van szükség ebben a témában a klinikai gyakorlat javítása érdekében, és minden egyes BMT klinikai csoport esetében visszamenőleges értékelés szükséges a korábbi tapasztalatokról. Ennek a vizsgálatnak a célja az volt, hogy meghatározzuk a HLA I. és II. Osztálybeli különbségek hatását a betegek kimenetelére URD-BMT után. A HLA I. és II. Osztályát nagyfelbontású DNS-technikákkal dolgoztuk át 69 donor befogadó párban, akiket 1988 szeptembere és 1998 júniusa között transzplantáltak intézményünkben. Ezen párok közül 33-ban meghatároztuk a CTLp frekvenciákat is.

Anyagok és metódusok

BMT eljárás

A vizsgálat 69 egymást követő URD-BMT eljárást tartalmazott, amelyeket 1988 szeptembere és 1998 júniusa között hajtottak végre a Henri-Mondor Egyetemi Kórházban (1. táblázat). Három beteget kétszer transzplantáltak. Az adományozókat európai és NMDP nyilvántartásokon keresztül azonosították. A BMT előtti betegek főbb jellemzőit az 1. táblázat foglalja össze. A betegeket a BMT betegség státusza szerint két csoportba soroltuk: 32 CML-ben szenvedő beteg az első krónikus fázisban vagy az akut leukémia az első vagy második remisszióban képezte a standard kockázati csoportot . és 37 előrehaladottabb BMT-vel rendelkező beteg a magas kockázatú csoportba tartozott.

Asztal teljes méretben

Az első 66 BMT eljárást a mieloablatív kondicionálás után hajtották végre, ideértve a teljes test besugárzását (n = 59) vagy a buszulfán alapú kezelést (n = 7). Három másodperces oltást végeztünk egy másik donor alkalmazásával prokarbazin-ciklofoszfamid és antitocita globulin után. A GVHD kombinált ciklosporin és metotrexát megelőzése a seattle-i protokoll szerint.18 Minden beteg módosítatlan csontvelőt kapott. Az akut GVHD-t Glucksberg és mtsai. 19 szerint osztályozták, és standard szteroiddózisokkal kezelték, sikertelenség esetén nagy dózisú szteroidokkal vagy ATG-vel.

HLA tipizálás és a beteg-donor párosítás

HLA gépelés a BMT előtt:

A donorokat a HLA-A és -B tipizálás alapján választottuk ki a mikrolimfocitotoxicitási technika20 alkalmazásával, amely meghatározta az Egészségügyi Világszervezet (WHO) által a transzplantáció idején elismert megfelelő sajátosságokat. A II. Osztályú HLA tipizálást a transzplantáció idején rendelkezésre álló technikákkal végeztük. Így a HLA-DR és -DQ fenotípusokat kis felbontásban, 14 párban vizsgáltuk szerológia (n = 3) vagy RFLP (restrikciós fragmens hossza polimorfizmus) (n = 11) alkalmazásával, míg a másik 55 párban a HLA-DRB1, A -DQB1 és -DPB1 tipizálást nagy felbontásban végeztük PCR-reverz dot blot (Innogenetics, Brüsszel, Belgium) plusz PCR-RFLP2122 HLA-DRB1 és -DQB1 esetén.

Retrospektív HLA tipizálás:

A HLA I. osztályú tipizálást retrospektíven végeztük PCR-SSP (szekvencia specifikus primer) alkalmazásával (Dynal, Oslo, Norvégia).

A HLA-A és HLA-B szerológiai "üres" elemeket alacsony felbontású DNS-tipizálással újból tipizáltuk. Az összes szerológiailag expresszált HLA-A antigént allél szinten határoztuk meg. A szerológiailag expresszált HLA-B antigéneket nagy felbontásban határoztuk meg, a kereskedelmi készletek rendelkezésre állása szerint (a HLA-B fenotípust nagy felbontásban teljesen meghatároztuk 69 donor-recipiens pár 39 közül). A HLA-C lokuszt a Cw1-18 alléleket meghatározó technikával tanulmányoztuk.

A HLA-DRB1, -DQB1 és -DPB1 átírását 14 donor-recipiens párban írtuk le korábban, alacsony felbontással.

A CTL-p frekvenciák kiszámítása

A CTLp-vizsgálatokat a Kaminski és mtsai. 17-ben leírtak szerint végeztük. Röviden: a vizsgálatokat „GVHD-irányban” hajtottuk végre, donorsejteket használva válaszreakcióban lévő sejtekként, és a befogadó sejteket stimuláló sejtként. A kutakat akkor tekintettük pozitívnak, ha 51 Cr felszabadulásuk nagyobb volt, mint a negatív kontroll (stimuláló sejtek sejtreceptív sejtek nélkül) átlag plusz 3 szórása (sd). Az 1/300000 alatti CTLp frekvenciákat negatívnak tekintették.8

statisztikai módszerek

Az adatokat 1998. november 15-én gyűjtöttük és frissítettük, minimum 7 hónapos, legfeljebb 122 hónapos követéssel és 29 hónapos medián túléléssel (7–122 hónap). Az aGVHD, a TRM és a túlélés becsült valószínűségét kiszámítottuk és ábrázoltuk Kaplan-Meier módszerrel, és összehasonlítottuk a log-rank teszt segítségével. A második transzplantáción átesett betegeket az első transzplantációhoz a második BMT napján cenzúrázták.

az eredmény

A HLA tipizálás és a pCTL gyakorisága

A transzplantáció idején hat donor-recipiens párról ismert, hogy a HLA-A vagy -B antigén nem egyezik egymással (UPN 671, 588, 536, 620, 629, 643); két párban a HLA-DQB1 nem egyezik (UPN 495, 547), az egyik párban pedig a HLA-A és -DQB nem felel meg (UPN 502) (2. táblázat).

Asztal teljes méretben

A retrospektív DNS-tipizálás megerősítette az összes szerológiailag azonosított eltérést. További eltéréseket találtunk a kilenc ismert, rokon donor-recipiens pár közül hétben (2. táblázat). A 60 másik donor befogadó pár között a transzplantáció idején nem azonosított HLA eltéréseket a 27/60 (45%), míg a 33/60 (55%) párokat azonosnak találták a HLA-A esetében., -B allélok -C, -DRB1 és -DQB1. Így retrospektív tipizálás után a donor-recipiens párok 36/69 (52%) nem egyezett. Ebből a párból 27 csak a HLA I. osztályú antigénekkel, öt pár csak a HLA II. Osztályú antigénekkel, négy pedig a HLA I. és II.

HLA I. osztály

A szerológiailag üres fenotípusokat mindig alacsony felbontású DNS-tipizálás igazolta, ami azt is megmutatta, hogy egy egyedet helytelenül azonosítottak szerológiai tipizálással (HLA-B57 (17) a HLA-B58 (17) helyett (UPN 502)). A HLA-A-ra és a -B-re a transzplantáció idején szerológiailag reagáló 62 pár közül a HLA-A és/vagy -B eltéréseket 13-nál találták retrospektív tipizálás után (2. és 3. táblázat). A HLA-B antigéneket nagy felbontású tipizálással határoztuk meg 17/33 páros donor és recipiens párban és 22/36 nem egyező párban.

Asztal teljes méretben

A 69 pár között 23 HLA-C eltérés volt (3. táblázat). Tíznek csak egy HLA-C antigén-eltérése volt, míg 12-nél szintén HLA-A és/vagy -B nem volt egyező, és egynél szintén HLA II-es osztálybeli eltérés volt (2. és 4. táblázat). Az összes HLA-B molekulát nagy felbontásban, 10 párban írtuk, a HLA-C eltérésekkel. Így retrospektív DNS-tipizálás után 31/69 (45%) párnak legalább egy HLA I. osztálybeli eltérése volt.

Asztal teljes méretben

HLA II. Osztály

A transzplantáció idején alacsony felbontásban fenotipizált 14 donor befogadó pár közül hat valószínűleg azonos donor párban találtak eltéréseket a retrospektív tipizálásban - HLA II. Osztályú recipiensek; közülük három HLA-DQB1 (UPN 392, 441, 380), egy HLA-DRB1 és -DQB1 (UPN 373), kettő pedig HLA I és II osztály (UPN 426, 306) (2. táblázat) )). Ezért egy 9/69 recipiens donor párja nem volt megfelelő a HLA II.

A HLA-DPB1 tipizálás azt mutatta, hogy ebben a tekintetben csak kilenc beteg-donor pár volt párosítva. Összesen csak öt HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 és -DPB1 pár volt azonos.

Ősi haplotípusok

Annak eldöntése érdekében, hogy konzervált haplotípusok alapján meg lehet-e jósolni a nagy felbontású DNS-tipizálással kimutatott eltérések gyakoriságát, a transzplantáció során azonosított donor-recipiens párok HLA-fenotípusait osztályoztuk a 25-ből egy vagy kettő valószínű jelenléte alapján a HLA-ABDR haplotípusok (AH) ősei. Christiansen et al. szabályozás). Két párnak két AH, 29 egy AH és 30 AH nem lehet. A megvizsgált 122 haplotípus közül a HLA I. osztálybeli eltérései gyakoribbak voltak a nagy felbontású DNS után a haplotípusokon belül, amelyeket születendőnek tekintettek, mint az AH-ban (21/89 vs 2/33) (P = 0,017 Fisher pontos teszt).

A CTLp frekvenciákat 33 párra határoztuk meg. DNS-tipizálás után 14 pár HLA I. osztályba esett a GVHD irányában, és 19 pár párosult (5. táblázat). A nem egyező 14 pár közül magas CTLp gyakoriságot találtak kilenc párban, alacsony frekvenciákat pedig öt párban. Az utóbbi öt pár közül kettő a HLA-A eltérése volt (UPN 671, 547), az egyik a HLA-B eltérése (UPN 642), kettő pedig a HLA-C nem megfelelősége (UPN 680, 668). Alacsony CTLp frekvenciákat 19 párban találtak a GVHD irányában.

Asztal teljes méretben

elkapni

Hat beteg meghalt a transzplantációt követő 30. nap előtt, ami azt jelzi, hogy 63 graft értékelhető. Öt esetben fordult elő graft meghibásodás. Az öt párból négy HLA I. osztályba esett, és a HVG (host-versus-graft) irányban nem egyezett meg (UPN 526, 436, 617, 536), egy pedig azonos volt. Két betegnél egy HLA-C antigén eltérés volt (UPN 617, 436), egynél HLA-B antigén eltérés volt (UPN 526), ​​egynél HLA-B és -C eltérés volt (UPN 536).

AGVHD, TRM és túlélés

66 beteg közül tizenkilenc életben van (medián 28 hónap, 7–122 hónappal a BMT után), beleértve az autológ helyreállítású (UPN 617) és a limfóma relapszusban szenvedő beteget (UPN 600). A teljes kohorsz teljes túlélési aránya 28 ± 6%, és az értékek korrelálnak a hematológiai állapottal (55% vs. 9%) (P

osztályú

A Kaplan-Meier túlélési becslések „standard kockázati státusszal” (folytonos vonal) rendelkező betegek esetében összehasonlítva a „magas kockázati státusú” (szaggatott vonal) betegekével. A túlélés valószínűsége 55% volt a standard kockázatú betegeknél és 9% a magas kockázatú betegeknél (P

Kaplan-Meier túlélési becslések azoknál a betegeknél, akik HLA I. és II. Osztályú transzplantáción estek át (folytonos vonal) ahhoz képest, akik HLA I. és/vagy II. Osztályú transzplantációt kaptak (szaggatott vonal). A túlélés valószínűsége 40% volt a válaszadó betegeknél és 20% a nem reagáló betegeknél (P

A III-IV fokozatú aGVHD valószínűsége HLA-kompatibilis (folytonos vonal) és HLA-kompatibilis transzplantációkban (szaggatott vonal). A GVHD szempontjából értékelhető betegek közül 2/30 egyeztetett betegnél és 16/33 nem egyeztetett betegnél alakult ki súlyos aGVHD (P

Kaplan-Meier túlélési becslések azoknál a betegeknél, akik megfelelő HLA I. és II. Osztályú transzplantációt kaptak (folytonos vonal) ahhoz képest, akik nem egyező HLA I. osztályú transzplantáción estek át (szaggatott vonal). A túlélés valószínűsége 42% volt a HLA I. és II. Osztályának megfelelő transzplantációnál, 18% pedig a HLA I. és II.

A Kaplan-Meier túlélési becslések összehasonlítása négy alcsoportban: "standard kockázati állapot" és a megfelelő transzplantációk; "Kockázat szokásos állapota" és nem megfelelő transzplantációk; "Magas kockázatú állapot" és a megfelelő transzplantációk; "Nagy kockázatú" és nem megfelelő transzplantációk. A túlélés valószínűsége 66%, 31%, 9% és 8% volt.

Teljes méretű kép

vita

Vizsgálatunk egyértelműen megerősíti, hogy az URD-BMT utáni túlélés javítható a donor-recipiens HLA-A, -B, -C egyeztetésével magas felbontású szinten, ami arra utal, hogy a HLA inkompatibilitást csak nagy felbontású tipizálás (azaz hiányzó) hagyományos technikák) klinikailag relevánsak. Bár a HLA II. Osztályú párosításról ez már évek óta ismert, a HLA I. osztályára vonatkozóan csak két újabb tanulmány állapította meg. 910 Vizsgálatunk azt mutatja, hogy a HLA-A és -B szerológiailag azonos donorok között az I. HLA osztály gyakran nem felel meg. -fogadó párok. Valójában a HLA-A és/vagy -B allél-eltéréseket 13/62 (21%) szerológiailag párosított párban és 6/7 (86%) párban találták, amelyek a transzplantáció idején nem egyeznek. Ezenkívül ez a tanulmány kiemeli a HLA-C eltérés magas gyakoriságát (23/69, 33%), amely 11/23 esetben fordult elő HLA-A és/vagy -B eltérés nélkül.

Érdekes módon elemzésünk azt sugallja, hogy az AH-k ritkábban társulnak a HLA I. osztályú allél-eltérésekhez, összhangban Prasad és mtsai. 12 Meg kell azonban jegyezni, hogy az AH elkülönítése valószínűségszámításon alapul, és nem határozható meg. donor család tanulmányok.

A közelmúltban számos transzplantációs egységben vezettek be CTLp-vizsgálatokat a hiányzó HLA I. osztálybeli eltérések kimutatására vagy az aGVHD előrejelzésére.8 Központunkban CTLp-eredményeket használtunk a transzplantáció előtti donorok kiválasztására, és a legnagyobb CTLp-vizsgálattal rendelkező donorokat eltávolítottuk. Ebben a tanulmányban a CTLp és a DNS tipizálás összehasonlításakor a magas CTLp tesztek mindig társultak az I. osztályú HLA nem egybeesésével. A negatív CTLp vizsgálatokat azonban öt párban figyelték meg a GVHD eltérése ellenére (köztük három esetben HLA-A eltérés vagy - B), ami összhangban áll Scott és mtsai tanulmányával. 11 A CTLp hasznos lehet a megengedő HLA I. osztályú eltérések kimutatására. \ T Azonban a súlyos aGVHD előfordulása négy beteg közül kettőben, akiknek csak az HLA I. osztálya nem felel meg és negatív CTLp tesztjei nem engedik megerősíteni ezt a lehetőséget.

Nemrégiben két vizsgálat mutatott összefüggést a HLA I. osztályú megfelelés és a klinikai eredmény között. 910 Sasazuki és mtsai 9 összefüggést találtak a HLA-A, -B és -C eltérések és a súlyos aGVHD magas előfordulása között, míg az I. osztály nem megfelelő volt a graft kilökődése a vizsgálatban Petersdorf és mtsai, 10, különösen a HLA-C lokusz esetében.24 Sasazuki és mtsai másrészt azt találták, hogy a HLA-C párosítás korrelál a leukémia 21 megismétlődésének kockázatával, ami a az NK-sejtek aktivitásának gátlása a donor és a HLA-C azonosság eseteiben A két vizsgálat különböző eredményei az etnikai háttér és a hematológiai betegség különbségeivel magyarázhatók (CML-es betegek összehasonlítva az országos nyilvántartással). Vizsgálatunkban magas transzplantációval összefüggő mortalitást figyeltek meg a HLA I. osztályba sorolt ​​betegeknél, a súlyos aGVHD előfordulása miatt. Ezenkívül 4/5 esetet figyeltek meg a graft meghibásodásáról ebben a betegcsoportban. Így a HLA-C eltérése súlyos aGVHD-vel, valamint graft-kudarccal társulhat, ami megerősíti a HLA-C transzplantációs antigénként betöltött szerepét. A HLA-C azonosságának a leukémia megismétlődésére gyakorolt ​​hatását nem tudtuk elemezni munkánk során, a donor-recipiens párok alacsony száma miatt.

Összegzésképpen elmondható, hogy a HLA I. és II. Osztályú allélek genomi tipizálása jelentősen hozzájárul a nem rokon donorok transzplantációjának sikeréhez, az azonos csoportban a medián túlélés összehasonlítható a gén-azonos testvérekkel végzett transzplantáció túlélésével. A nem HLA-transzplantáción átesett betegek rossz prognózisa új transzplantációs módszerek szükségességére utal.